Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Vi takker Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity fra Moffitt Cancer Center for å gi finansiering til denne protokollutviklingen. Vi takker også Dr. Claudio Anasetti for hans uvurderlige hjelp og veiledning gjennom dette prosjektet. Til slutt takker vi Dr. Justin Boucher for hans innsikt og gjennomgang av manuskriptet.

MERK: IRB-godkjenning ble innhentet, og informert samtykke ble innhentet fra giverne.
1. Lymfocyttisolasjon
<ol><li>Overfør afereseproduktet til et rent rom. MERK: Prosessvalidering ble utført ved hjelp av vanlig donoropphøyelse fra en ekstern kommersiell leverandør som er i samsvar med rå cellulære materialinnsamlingsforskrifter.</li>
	<li>Samle prøver for sterilitetstesting, celleantall og cellefenotyping.</li>
	<li>Elutriate på motløpssentridugeringsenheten ved hjelp av et primærmedium av Hanks Balanced Salt Solution med 1% humant serumalbumin (HSA) og et sekundært medium saltløsning (0,9% natriumkloridinjeksjon USP) eller Dulbeccos fosfatbufferde saltvann (DPBS). Still inn elutriasjonssentrigeringshastigheten på 900 × g og samle brøker basert på strømningshastighet og tid.</li>
	<li>Samle prøver fra brøkdel 2 og utfør følgende tester: 2 ml for sterilitetstesting; 0,5 ml for celleantall og levedyktighet ved bruk av acridine oransje/propidiumjodid (AO/PI); 5 × 106 celler for cellefenotyping ved strømningscytometri.</li>
	<li>Utvid en ren lymfocyttfraksjon (brøkdel 2) av celler i kultur ved 10 × 106 celler/cm2 i en 1 L lukket bioreaktor med 5 μmol/l zoledronsyre og 300 IE/ml IL-2.</li>
	<li>Inkuber i syv dager i en inkubator satt til 37 °C med 5 % CO2.</li>
</ol>2. Alfa-beta (αβ) T celletømming
<ol><li>Høst celler fra 1 L lukket system bioreaktorflaske. Sterilsveis en 1 L overføringspakke til den røde linjen til bioreaktoren i lukket system, og bruk den aktuelle farmasøytiske pumpen til å overføre cellene til overføringspakken.</li>
	<li>Ta følgende prøver: 10 ml for brukt middels sterilitet; 0,5 ml celler for celleantall og levedyktighet ved hjelp av AO/PI; 5 × 106 celler for strømningscytometri</li>
	<li>Resuspend cellene ved ~ 5 × 108 celler / ml i fosfatbufret saltvann (PBS) eller (PBS / etylendiamintetraacetic acid (EDTA)) buffer + 0,5% HSA og biotinylert TCR αβ-spesifikt antistoff.</li>
	<li>Plasser shakeren i kjøleskapet og inkuber cellene ved 2-8 °C i ca. 15 minutter med risting.</li>
	<li>Vask cellene med totalt 600 ml PBS/EDTA buffer + 0,5% HSA. Sentrifuge for å fjerne det ubundne antistoffet ved 200-500 × g i 15 min ved 2-8 °C. Resuspend ~5 × 108 celler/ml i PBS/EDTA buffer + 0,5% HSA med antibiotinspesifikke mikrober (7,5 ml / 1 hetteglass).</li>
	<li>Plasser shakeren i kjøleskapet og inkuber cellene ved 2-8 °C i ca. 15 minutter med risting. Etter inkubasjon sentrifugerer du cellene ved 200-500 × g i 15 min ved 2-8 °C for å fjerne de ubundne mikrober. Resuspend ~6 × 107 celler/ml i PBS/EDTA buffer + 0,5% HSA og overfør dem til en overføringspakkepose.</li>
	<li>Monter slangesettet i den kliniske magnetiske celleseparasjonsenheten ved å følge produsentens anvisninger, plasser pakkene med PBS /EDTA-bufferen og overføringspakken med celleproduktet i instrumentet og pigg det når det er instruert av instrumentet.</li>
	<li>Velg Uttømming 1.2-protokollen for uttømming av de merkede αβ T-cellene.</li>
	<li>Sentrifuger målfraksjonen (beriket γδ T-celler) og resuspender cellene i medium supplert med 10% humant AB-serum.</li>
	<li>Ta en 0,5 ml prøve og utfør et celleantall og levedyktighet med AO/PI-flekk. Bring celler til en endelig konsentrasjon på ca. 1 × 106 celler/ml. Ta en prøve på 5 × 106 celler av produktet for strømning cytometri fenotyping etter uttømming.</li>
</ol>3. Samkultur med aAPCer
<ol><li>Bestråle 5 × 107 aAPCer/kolbe ved 100 Gy på røntgengenererende instrumentet.</li>
	<li>Bruk aAPCene i samkultur med et 10:1-forhold med γδ T-cellene. Plasser de bestrålede aAPCene (5 × 107 celler/kolbe) og γδ T-celler (5 × 106 celler/kolbe) i 1 L bioreaktorflasker med 1 L kulturmedium supplert med 10 % humant AB-serum. Frø opptil 10 kolber.</li>
	<li>Utvid cellene i kultur i 10 dager i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.</li>
	<li>Overvåk glukose- og laktatnivåer hver 3-4 dager ved hjelp av strimler, glukose og en laktatmåler.</li>
	<li>Hvis glukose faller til 250 mg/dl, reduser volumet i kolben til 200 ml ved hjelp av en farmasøytisk pumpe ved steril sveising av en 1 L overføringspakke til den røde linjen i det lukkede systemet bioreaktor.</li>
	<li>Bland cellene i de resterende 200 ml, og ta en 0,5 ml prøve for celletelling og levedyktighetsmåling ved AO-PI-farging. Hvis celleantallet er ≥109, del en kolbe i to kolber og fyll hver kolbe opp til 1 L med AIM-V supplert med 10% menneskelig AB-serum. Hvis celleantallet er <109, mate cellene med en frisk liter kulturmedium supplert med 10% menneskelig AB-serum.</li>
	<li>Gjenta trinn 3.6 for alle kolber og returner dem til inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Gjenta trinn 3.4-3.7 hver tredje til fjerde dag.</li>
</ol>4. Cellehøst
<ol><li>På slutten av 10 dager i samkultur, høst alle bioreaktorflasker. Høst 1 bioreaktorflaske om gangen, og samle alle cellene i en overføringspakke av passende størrelse. Sterilsveis overføringspakken til den røde linjen til bioreaktoren i lukket system, og bruk den farmasøytiske pumpen til å overføre cellene til overføringspakken.</li>
	<li>Fjern følgende kvalitetskontrollprøver: 1% av legemiddelproduktet (DP) for sterilitet ved blodkultur og gramfarging; 0,5 ml for celletelling og levedyktighet ved bruk av AO/PI; 5-10 × 106 celler for strømningscytometri (se figur 1 for gatingstrategi); 0,5 ml for endotoksin; 0,5 ml for gramfarging; 106 celler pigget inn i 10 ml brukt medium for Mycoplasma testing.</li>
	<li>Sentrifuger cellene ved 200-500 × g i 15 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten.</li>
	<li>Vask cellene i en løsning av balansert krystallloidløsning + 0,5% HSA ved 200-500 × g i 15 minutter ved romtemperatur. Resuspend dem i et målvolum på 100-300 ml balansert krystallloid løsning + 0,5% HSA.</li>
</ol>5. Slipp testing
<ol><li>Utfør kvalitetskontrolltesting av γδ T-cellen DP for følgende: renhet og identitet ved flowcytometri (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); levedyktighet ved AO / PI farging; endotoksin; Mycoplasma testing ved polymerase kjedereaksjon (PCR); sterilitet ved gramfarging og aerobe og anaerobe blodkulturer; gjenværende K562-analyse ved strømningscytometri (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Moffit Cell Therapy Lab har utviklet en protokoll med en bifasisk utvidelse av svært rene γδ T-celler for bruk som DP i kliniske studier. Denne protokollen gir en produksjonsmetode i henhold til cGMP-retningslinjer i et lukket system som gir en svært ren γδ T-celle DP som er vellykket aktivert og utvidet av zoledronsyre og WCB-aAPCene. Denne protokollen er godkjent av FDA for fremstilling av en allogen γδ T celle DP for AML-pasienter. Ved hjelp av friske givere utvidet vi den lille befolkningen av donor γδ T-celler på bare 7 dager fra 2,06 ± 0,45% til 54,45 ± 28,34%. Etter den 7-dagers ekspansjonen med zoledronsyre ble det observert at donor 2 hadde en økning i NK-befolkningen.
Zoledronsyre hemmer farnesyldifosfatsyntase (FDPS) i monocytter, noe som igjen fører til akkumulering av isopentenylpyrofosfat (IPP), som har blitt korrelert med en betydelig økning i spredningen av T-celler og naturlige NK-celler7,8,9. Denne økte NK-populasjonen hindrer den andre ekspansjonsfasen med aAPCene, da aAPCene bare vil bidra til ytterligere utvidelse av NK-celler. Av denne grunn ble giverkriteriene endret for å ekskludere givere med høye NK-populasjoner. Etter uttømming av αβ T-cellene ble γδ T-cellene ytterligere beriket til 76,61 ± 27,51%. Denne unike protokollen inkluderer en ny utvidelse som bruker de Moffit-produserte aAPCene til å målrette mot CD8-, CD28- og CD127L-reseptorene i γδ T-cellene. Denne andre ekspansjonsfasen med aAPCene ga en DP med ≥65 % for CD3+TCR γδ+T-celler, ≤1 % TCRαβ T og <35 % CD3-CD16+CD56+ NK-celler. På grunn av bruk av K562-avledede aAPCer var det nødvendig å demonstrere at disse aAPCene besto <1% av sluttproduktet.
Moffit CTF utviklet en strømningscytometrisk analyse som ble brukt til frigjøringskriteriene for å måle prosentandelen av de resterende K562-cellene i den endelige DP. Denne strømningscytometriske analysen reduserer alle problemene med å bruke celleoverflateantigener for å identifisere K562-cellene. Som aktiverte T-celler kan uttrykke CD71, utarbeidet vi en strategi for å ekskludere alle T-celler og NK-celler ved å stirre på CD3- CD56- og CD16-populasjoner og deretter undersøke CD71 + -cellene, som utelukkende ville være K562-celler. Denne protokollen viser at γδ T-cellen DP gir 0,48 ± 0,42% av gjenværende K562-celler og oppfyller alle utgivelseskriteriene for ≥70% levedyktighet, Mycoplasma-negativitet av PCR, ingen organismer sett av gramfarging, ≤2 EU / ml endotoksin og ingen vekstfinale (14 dager) blodkultursterilitet.

Leukemi tilbakefall er den ledende årsaken til dødelighet etter hematopoietisk celletransplantasjon (HCT) hos pasienter med AML1,2,3. Bedre leukemifri overlevelse ble rapportert med økt utvinning av blod γδ T celler etter HCT uten økt risiko for Graft-versus-Host Sykdom (GVHD)4. γδ T-cellenes evne til å gjenkjenne antigener på en MHC-uavhengig måte og utvikle sterke cytolytiske og Th1-lignende effektorfunksjoner gjør denne mindre subpopulasjonen av T-celler ideell for behandling av AML-pasienter som gjennomgår allogen transplantasjon i fare for tilbakefall5. Gitt at Vγ9Vδ2 T-cellene er en mindre undergruppe av T-lymfocytter som spenner fra 0,5% til 5% av T-cellene i periferien6, bestemte vi oss for å etablere et robust system for å utvide denne sjeldne populasjonen av blodceller for å oppnå potensielt terapeutiske doser for kliniske studier.
Selv om andre har utvidet γδ T-celler ved hjelp av zoledronsyre og til og med aAPCer, har vi utviklet en prosess som potensielt kan utvide γδ T-celler med 229 749 ganger. Utvidelsen er bifasisk: For det første oppnås lymfocytter ved elutriasjon ved hjelp av separasjonsinstrumentet. Utstyret gir et lukket system som gjør det mulig å separere celler basert på størrelse, form og tetthet ved motstrømssentrifugering. Etter berikelse for lymfocytter oppnås selektiv utvidelse av Vγ9Vδ2 T-celler ved behandling med zoledronsyre og IL-2 i 7 dager. Umiddelbart etter denne behandlingen tømmes TCR-αβ T-celler ved hjelp av mikrobeadteknologi, noe som muliggjør etterfølgende utvidelse av γδ T-cellene med K562-avledede aAPCer.
For prosessvalidering ble bare 5 × 106 zoledronsyre-utvidede γδ T-celler brukt til fase 2-kokulturutvidelsen med aAPCer. I denne andre fasen av utvidelsen aktiveres γδ T-celler ved hjelp av en nåværende Good Manufacturing Practices (cGMP)-kompatibel Working Cell Bank (WCB) av genetisk konstruerte K562-avledede aAPCer (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) produsert på Moffitt. Begrunnelsen for denne bifasiske ekspansjonen er basert på zoledronsyrens evne til å hemme farnesyldifosfatsyntase (FDPS) i monocytter, noe som fører til opphopning av isopentenylpyrofosfat, som direkte stimulerer Vγ2Vδ2-cellene. I den andre fasen av ekspansjonen gir de K562-avledede aAPCene (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) en robust stimulering til alle T-celler. Celleproduktet er imidlertid allerede beriket for γδ T-cellene, noe som resulterer i en robust utvidelse av γδ T-cellene.
Ved bruk av spesifikt utstyr og kolber er prosessen et funksjonelt lukket system, og reduserer dermed risikoen for forurensning. I tillegg legger 1 L-bioreaktoren i lukket system til rette for maksimal vekst og utvidelse av celler i et totalt volum på 1 liter medium med minimalt behov for fôring. Fordelen med Moffitt-metoden er at den gir et raskt, reproduserbart og svært gjennomførbart GMP-system for å produsere et svært rent, donoravledet γδ T-celleprodukt for allogen administrering. Denne metoden kan brukes på alle kliniske studier som tar sikte på å bruke humane γδ T-celler som uttrykker Vγ2Vδ2 T cellereseptorer som adoptiv immunterapi for å megle immunitet mot mikrober og svulster hos kreftpasienter med delvis og fullstendig remisjon. I tillegg gir den en robust plattform for utvikling og produksjon av γδ chimeric antigenreseptorpositive (CAR +) T-celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

Selv om Vγ9Vδ2 T-celler er en mindre undergruppe av T-lymfocytter, er denne befolkningen ettertraktet for sin evne til å gjenkjenne antigener i et stort histokompatibilitetskompleks (MHC)-uavhengig måte og utvikle sterk cytolytisk effektorfunksjon som gjør den til en ideell kandidat for kreftimmunoterapi. På grunn av den lave frekvensen av Gamma-Delta (γδ) T-celler i perifert blod, utviklet vi en effektiv protokoll for å utvide et svært rent γδ T-cellemedisinprodukt for første-i-menneskelig bruk av allogene γδ T-celler hos pasienter med akutt myeloid leukemi (AML). Ved hjelp av sunn donoraferese som en allogen cellekilde, isoleres lymfocyttene ved hjelp av en validert enhet for en motstrøms sentrifugeringsmetode for å skille celler etter størrelse og tetthet. 
Den lymfocyttrike fraksjonen brukes, og γδ T-cellene aktiveres fortrinnsvis med zoledronsyre (FDA-godkjent) og interleukin (IL)-2 i 7 dager. Etter den foretrukne utvidelsen av γδ T-celler brukes en klinisk magnetisk celleseparasjonsenhet og TCRαβ-perler til å tømme forurensende T-cellereseptor (TCR)αβ T-celler. De svært berikede γδ T-cellene gjennomgår deretter en ny utvidelse ved hjelp av konstruerte kunstige antigen-presenting celler (aAPCs) avledet fra K562 celler-genetisk konstruert for å uttrykke enkjedet variabel fragment (scFv) for CD3 og CD28, 41BBL (CD137L) og IL15-RA-sammen med zoledronsyre og IL-2. Såing hele dagen-7 beriket γδ T celler i samkultur med aAPCs letter produksjonen av svært rene γδ T celler med en gjennomsnittlig fold utvidelse av >229,000-fold fra sunt donor blod.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Presentert er en protokoll for utvidelse av Gamma-Delta (γδ) T celle narkotika produkt. Lymfocytter er isolert ved elutriasjon og γδ-beriket med zoledronsyre og interleukin-2. Alpha-beta T-celler tømmes ved hjelp av en magnetisk separasjonsenhet av klinisk kvalitet. γδ-cellene er samkulturert med K562-avledede, kunstige antigen-presenterende celler og utvidet.

Utvidelse og berikelse av Gamma-Delta (γδ) T-celler fra det afærerte menneskelige produktet

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Gamma-Delta T-cellene har kraftig cytotoksisk aktivitet mot mange krefttyper, inkludert akutt myeloid leukemi. Sirkulerende Gamma-Delta T-celler i et blod er imidlertid relativt sjeldne, spesielt hos pasienter med malignitet. Infusjonen av donor avledet, X-vivo utvidet Gamma-Delta T celler, har lovet å redusere tilbakefall av leukemi, og forbedre overlevelsen til pasienter med akutt myeloid leukemi.Den foreslåtte metoden oppnår mer enn 200 000 ganger Gamma-Delta T celleutvidelse, og når terapeutisk relevante doser av et svært rent Gamma-Delta T-celleprodukt, i tre enkle trinn. Så ligating en IEL til ekspansjon, alfa beta T celle uttømming ved magnetisk sortering og dusør sekundær utvidelse med AAPCs. Den foreslåtte metoden utvider nytten av Gamma-Delta T-celler for sykdommer som kreft og autoimmune sykdommer ved raskt å skape et stort antall celler som kan brukes fra hyllen.Denne prosessen kan tilpasses for å utvide Gamma-Delta-celler ved hjelp av forskjellige berikelsesmetoder og legge til flere manipulasjoner som transduksjon. Å demonstrere prosedyren vil bli flytende i LA, en celleterapiteknolog, tre fra laboratoriet mitt. Begynn med elutriasjon av effervescence produktprøven, på motstrøms sentrifugeringsenheten, ved hjelp av et primært medium av Hanks balansert saltløsning, med 1% humant serumalbumin og sekundært medium for saltløsning eller DPBS.Med elutriasjon sentrifugeringshastigheten ved 900 ganger G, samle fraksjoner basert på strømningshastighet og tid. Samle prøvene fra brøkdel to for å utføre sterilitetstesting, celletelling og cellefenotyping ved strømningscytometri. Fra brøkdel to utvider du en ren lymfocyttfraksjon av celler i kultur ved 10 ganger 10 til de sjette cellene per centimeter kvadrert, med fem mikromoler per liter zoledronsyre og 300 enheter per milliliter Interleukin-2 i en en liter lukket systembioreaktor.Inkuber systemet i syv dager ved 37 grader celsius, med 5% karbondioksid. Etter inkubasjon, høst celler fra den ene liter lukket system bioreaktor kolbe. For å gjøre dette, steril sveis en overføringspakke på en liter til bioreaktorens røde linje, og bruk den aktuelle farmasøytiske pumpen til å overføre cellene til overføringspakken.Ta prøvene for testing av brukt middels sterilitet, celleantall og cellefenotyping ved strømningscytometri. Fra den gjenværende prøven, re-suspendere cellene på fem ganger 10 til åttende celler per milliliter, i PBS-EDTA buffer som inneholder 0,5% HSA og biotinylert T celle reseptor, alfa beta spesifikt antistoff. Og inkuber cellene ved to til åtte grader Celsius med risting.Etter 15 minutter, vask cellene med 600 milliliter PBS-EDTA buffer som inneholder 0,5 HSA og sentrifuger ved 200 til 500 ganger G i 15 minutter, ved to til åtte grader Celsius, for å fjerne det ubundne antistoffet. Deretter suspenderer du cellene på omtrent fem ganger 10 til de åttende cellene per milliliter, i PBS-EDTA-buffer som inneholder 0,5% HSA og 7,5 milliliter per hetteglass med antibiotinspesifikke mikrober. Som beskrevet tidligere, inkuber cellene med risting, før sentrifugerer cellefjæringen for å fjerne de ubundne mikrobeadene.Re-suspendere seks ganger 10 til syvende celler per milliliter i PBS-EDTA buffer med 0,5%HSA. Samle dem i en overføringspakkepose. Spike den når du blir instruert av instrumentet.Deretter installerer du et rørsett i den kliniske magnetiske celleseparasjonsenheten. Plasser pakkene med PBS-EDTA-bufferen, og overføringspakken med celleproduktet inn i instrumentet. For uttømming av de merkede alfa beta T-cellene, velg uttømming 1.2-protokollen i programvaren.Deretter sentrifugerer du celleproduktet for å samle målfraksjonen beriket med Gamma-Delta T-celler. Re-suspendere de innsamlede cellene i mediet, supplert med 10% humant AB-serum. Utfør en celle teller levedyktighet og strømning cytometri fenotyping post uttømming.Bring celler til en endelig konsentrasjon på omtrent en gang 10 til de sjette cellene per milliliter. Bestråle fem ganger 10 til den syvende kunstige antigen-presenterende celler eller AAPCs per kolbe, ved 100 grå på røntgengenererende instrument. Forbered en medkultur, ved å plassere de bestrålede AAPC- og Gamma-Delta T-cellene i forholdet 10 er til en, i en liter lukket system bioreaktorflasker.Med en liter kulturmedium, supplert med 10% menneskelig AB-serum, frø opp til 10 kolber. Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius, og 5% karbondioksid i 10 dager, med en screening av glukose- og laktatnivåer hver tredje til fjerde dag ved hjelp av strimler, glukose og en laktatmåler. Hvis glukosenivået faller til 215 milligram per desiliter, reduser volumet i kolben til 200 milliliter.Bland cellene i de resterende 200 milliliter medier, og fjern en 0,5 milliliter prøve for celletelling og levedyktighetsmåling ved acridine oransje eller propidiumjodidfarging. Hvis celleantallet er lik, eller mer enn 10 til det niende, del innholdet i en kolbe i to og fyll hver kolbe opp til en liter med AIM-V-medium, supplert med 10% menneskelig AB-serum. Hvis celleantallet er mindre enn 10 til det niende, mate cellene med en frisk en liter kulturmedium, supplert med 10% menneskelig AB-serum, og returner kolber til inkubatoren.På slutten av 10 dager i samkultur, høst bioreaktorflaskene en om gangen, og trekk alle cellene inn i en overføringspakke av passende størrelse. Etter å ha fjernet kvalitetskontrollprøvene, sentrifuger cellene ved 200 til 500 ganger G i 15 minutter ved romtemperatur, og kast supernatanten. Vask cellene i en løsning av balansert krystallloidoppløsning, supplert med 0,5% HSA ved 200 til 500 ganger G i 15 minutter ved romtemperatur.Re-suspendere dem i et målvolum på 100 til 300 milliliter balansert krystallloid løsning med 0,5%HSA. Cellene separert fra stolpens motstrøms sentrifugeringsfraksjon. To ga en ren lymfocyttpopulasjon, med en utmerket gjennomsnittlig levedyktighet på 95,80%Gamma-Delta T-cellenes spesifikke ekspansjon, med zoledronsyre avhengig av den første prosentandelen av naturlige morderceller tilstede i lymfocyttfraksjonen etter elutriasjon.Berikelsen av Gamma-Delta T-celle narkotika substans, med T-celle reseptor alfa beta uttømming var konsistent. Gamma-Delta T-celle narkotika produkt produsert av tre friske donorer, oppfylt utgivelse kriterium på mindre enn 1%av T-celle reseptor alfa beta positive T-celler, med et gjennomsnitt på 0.11%CD20 positive B celler, og 0.00%T-celle reseptor alfa beta positive T-celler. Den gjennomsnittlige prosentandelen av naturlige morderceller i sluttproduktet var rundt 17,06%, som oppfylte frigjøringskriteriet for mindre enn 35% celleoverflatefarging og strømningscytometrisk analyse, ble brukt til å karakterisere identiteten, renheten og prosess urenheter av stoffet og legemiddelproduktet.Den andre re-utvidelsen oppnådd fra samkulturen av AAPC og Gamma-Delta T-celle narkotika substans, genererte en Gamma-Delta T-celle narkotika produkt som oppfylte alle utgivelseskriterier. Patoner som beriker T-cellepopulasjonen påvirker produktets ekspansjon og egenskaper. Tilstrekkelig vurdering og undersøkelse av berikelsesmetoder er nødvendig, før initiering av deres berikelsesprosess.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Målet cellen pre berikelse og hele genomet forsterkning for enkeltcelle nedstrøms karakteristikk

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering av menneskelig endotelceller fra Normal kolon og Colorectal Carcinoma - en forbedret protokoll

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Morfologi-baserte skillet mellom sunn og patologiske celler utnytte Fourier transformeres og selv-organisering kart

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Ekstraksjon av vandig metabolitter fra kultivert tilhenger Cells for Metabolomic analyse av kapillær elektroforese-Mass massespektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolasjon og utvidelse av cytotoktoktokin-indusert killer T-celler for kreftbehandling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolere mononukleære celler i humant perifert blod og CD4+ T-celler fra Sézary Syndrome-pasienter for transkripsjonsomic profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funksjonell vurdering av humane brystkreftstamceller fra celle- og vevsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Generering og utvidelse av primære, ondartede pleural mesoteliom tumorlinjer

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Sanntidsdeteksjon og fangst av invasive celledelpopulasjoner fra samkulturer

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...