Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Agradecemos ao Prêmio de Testes Intramuros do Prêmio de Testes Intramuros do Moffitt Cancer Center por fornecer o financiamento para este desenvolvimento de protocolos. Agradecemos também ao Dr. Claudio Anasetti por sua inestimável ajuda e orientação através deste projeto. Finalmente, agradecemos ao Dr. Justin Boucher por suas ideias e revisão do manuscrito.

NOTA: A aprovação do IRB foi obtida e o consentimento informado foi obtido dos doadores.
1. Isolamento do linfócito
<ol><li>Transfira o produto da aferese para uma sala limpa. NOTA: A validação do processo foi realizada utilizando-se aferese normal do doador de um fornecedor comercial externo compatível com as normas de coleta de matérias-primas.</li>
	<li>Coletar amostras para testes de esterilidade, contagem de células e fenotipagem celular.</li>
	<li>Elutriate no dispositivo de centrifugação de contrafluxo usando um meio primário da Solução de Sal Balanceado Hanks com 1% de albumina de soro humano (HSA) e um meio secundário de solução salina (0,9% injeção de cloreto de sódio USP) ou salina fosfato-tampão de dulbecco (DPBS). Defina a velocidade de centrifugação da elutriação em 900 × g e colete frações com base na taxa de fluxo e no tempo.</li>
	<li>Coletar amostras da fração 2 e realizar os seguintes testes: 2 mL para testes de esterilidade; 0,5 mL para contagem de células e viabilidade utilizando iodeto de acridina laranja/propidium (AO/PI); 5 × 106 células para fenotipagem celular por citometria de fluxo.</li>
	<li>Expanda uma fração de linfócito puro (fração 2) de células na cultura a 10 × 106 células/cm2 em um bioreator de sistema fechado de 1 L com 5 μmol/L de ácido zoledrônico e 300 UI/mL de IL-2.</li>
	<li>Incubar por sete dias em uma incubadora fixada a 37 °C com 5% de CO2.</li>
</ol>2. Esgotamento de células T Alfa-beta (αβ)
<ol><li>Células de colheita do frasco bioreator do sistema fechado 1 L. Soldar estéril um pacote de transferência de 1 L para a linha vermelha do bioreator do sistema fechado, e usar a bomba farmacêutica apropriada para transferir as células para o pacote de transferência.</li>
	<li>Pegue as seguintes amostras: 10 mL para esterilidade média gasta; 0,5 mL de células para contagem de células e viabilidade utilizando AO/PI; 5 × 106 células para citometria de fluxo</li>
	<li>Resuspend as células em ~5 × 108 células/mL em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) ou (PBS/ethylenodiaminetetraactic acid (EDTA)) tampão + 0,5% HSA e anticorpos tcr αβ-específicos biotinilados.</li>
	<li>Coloque o agitador na geladeira e incuba as células a 2-8 °C por aproximadamente 15 minutos com agitação.</li>
	<li>Lave as células com um total de 600 mL de tampão PBS/EDTA + 0,5% HSA. Centrífuga para remover o anticorpo desvinculado em 200-500 × g por 15 min a 2-8 °C. Resuspend ~5 × 108 células/mL em buffer PBS/EDTA + 0,5% HSA com microesferas anti-biotina (7,5 mL/1 frasco).</li>
	<li>Coloque o agitador na geladeira e incuba as células a 2-8 °C por aproximadamente 15 minutos com agitação. Após a incubação, centrifugar as células a 200-500 × g por 15 min a 2-8 °C para remover as microesferas não ligadas. Resuspend ~6 × 107 células/mL no buffer PBS/EDTA + 0,5% HSA e transfira-as para uma mala de transferência.</li>
	<li>Instale o conjunto de tubos no dispositivo de separação celular magnética de grau clínico seguindo as instruções do fabricante, coloque as embalagens com o tampão PBS/EDTA e o pacote de transferência com o produto celular no instrumento e bata-o quando instruído pelo instrumento.</li>
	<li>Selecione o protocolo Depletion 1.2 para o esgotamento das células αβ T rotuladas.</li>
	<li>Centrifugar a fração alvo (células γδ t enriquecidas) e resuspensar as células em meio suplementado com soro AB 10% humano.</li>
	<li>Pegue uma amostra de 0,5 mL e realize uma contagem de células e viabilidade com a mancha AO/PI. Leve as células a uma concentração final de aproximadamente 1 × 106 células/mL. Pegue uma amostra de 5 × 106 células do produto para fenotometria de fluxo pós-esgotamento.</li>
</ol>3. Co-cultura com aAPCs
<ol><li>Irradiar 5 × 107 aAPCs/frasco a 100 Gy no instrumento gerador de raios-X.</li>
	<li>Use os aAPCs na cocultura em uma proporção de 10:1 com as células γδ T. Coloque as células aAPCs irradiadas (5 × 107 células/frascos) e γδ T (5 × 106 células/frascos) em frascos bioreatores de sistema fechado 1 L com 1 L de meio de cultura suplementado com soro AB 10% humano. Semente até 10 frascos.</li>
	<li>Expanda as células na cultura por 10 dias em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Monitore os níveis de glicose e lactato a cada 3-4 dias usando tiras, glicose e um medidor de lactato.</li>
	<li>Se a glicose cair para 250 mg/dL, reduza o volume no frasco para 200 mL usando uma bomba farmacêutica por solda estéril um pacote de transferência de 1 L para a linha vermelha do bioreator do sistema fechado.</li>
	<li>Misture as células nos 200 mL restantes e pegue uma amostra de 0,5 mL para contagem celular e medição de viabilidade por coloração AO-PI. Se a contagem de células for ≥109, divida um frasco em dois frascos e encha cada frasco até 1 L com AIM-V complementado com soro AB 10% humano. Se a contagem de células for <109, alimente as células com um litro fresco de cultura de meio suplementado com soro AB 10% humano.</li>
	<li>Repita o passo 3.6 para todos os frascos e devolva-os à incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Repita as etapas 3.4-3.7 a cada 3 a 4 dias.</li>
</ol>4. Colheita celular
<ol><li>Ao final de 10 dias em co-cultura, colhe todos os frascos bioreatores. Colher 1 frasco de bioreator de cada vez, e juntar todas as células em um pacote de transferência de tamanho apropriado. Soldar o pacote de transferência para a linha vermelha do bioreator do sistema fechado, e usar a bomba farmacêutica para transferir as células para o pacote de transferência.</li>
	<li>Remova as seguintes amostras de controle de qualidade: 1% do produto medicamentoso (DP) para esterilidade por cultura sanguínea e coloração gramada; 0,5 mL para contagem de células e viabilidade utilizando AO/PI; 5-10 × 106 células para citometria de fluxo (ver Figura 1 para estratégia de gating); 0,5 mL para endotoxina; 0,5 mL para coloração de grama; 106 células cravadas em 10 mL de meio gasto para testes de Mycoplasma.</li>
	<li>Centrifugar as células a 200-500 × g por 15 minutos à temperatura ambiente e descartar o sobrenante.</li>
	<li>Lave as células em uma solução de solução cristalina balanceada+ 0,5% HSA a 200-500 × g por 15 min a temperatura ambiente. Resuspennciá-los em um volume-alvo de 100-300 mL de solução cristalina equilibrada + 0,5% HSA.</li>
</ol>5. Teste de liberação
<ol><li>Realizar testes de controle de qualidade da célula γδ T DP para os seguintes: pureza e identidade por citometria de fluxo (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); viabilidade por manchas ao/PI; endotoxina; Teste de mycoplasma por reação em cadeia de polimerase (PCR); esterilidade por manchas gramas e culturas sanguíneas aeróbicas e anaeróbicas; ensaio residual K562 por citometria de fluxo (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

O Moffit Cell Therapy Lab desenvolveu um protocolo com uma expansão bifásica de células γδ T altamente puras para uso como DP em ensaios clínicos. Este protocolo fornece um método de fabricação sob as diretrizes cGMP em um sistema fechado que produz um DP de células γδ t altamente pura que é ativado e expandido com sucesso por ácido zoledrônico e os aAPCs WCB. Este protocolo foi aprovado pela FDA para a fabricação de um DP aogenético γδ T celular para pacientes com LMA. Usando doadores saudáveis, expandimos com sucesso a pequena população de células γδ T doadoras em apenas 7 dias, de 2,06 ± 0,45% para 54,45 ± 28,34%. Após a expansão de 7 dias com ácido zoledrônico, observou-se que o doador 2 apresentou aumento na população de NK.
O ácido zoledrônico inibe a distease de difosfato de farnésila (FDPS) em monócitos, o que, por sua vez, leva ao acúmulo de pirofosfato isocenil (IPP), que foi correlacionado com um aumento significativo na proliferação de células T e células NK naturais7,8,9. Esse aumento da população de NK dificulta a 2ª fase de expansão com os aAPCs, pois os aAPCs só contribuirão para a expansão das células NK. Por essa razão, os critérios de doadores foram modificados para excluir doadores com altas populações de NK. Após o esgotamento das células αβ T, as células γδ T foram enriquecidas para 76,61 ± 27,51%. Este protocolo único inclui uma segunda expansão utilizando os aAPCs fabricados pelo Moffit para atingir os receptores CD8, CD28 e CD127L nas células γδ T. Esta segunda fase de expansão com os aAPCs rendeu um DP com ≥65% para células T CD3+TCR γδ+, ≤1% TCRαβ T e <35% células CD3-CD16+CD56+ NK. Devido ao uso de aAPCs derivados do K562, foi necessário demonstrar que esses aAPCs constituíam <1% do produto final.
O Moffit CTF desenvolveu um ensaio citométrico de fluxo utilizado para os critérios de liberação para medir o percentual das células residuais K562 no DP final. Este ensaio citométrico de fluxo atenua todas as questões de utilização de antígenos da superfície celular para identificar as células K562. Como as células T ativadas podem expressar CD71, criamos uma estratégia para excluir todas as células T e células NK, gating em populações CD3-CD56 e CD16 e, em seguida, examinando as células CD71+, que seriam exclusivamente células K562. Este protocolo demonstra que a γδ T célula DP produz 0,48 ± 0,42% das células residuais de K562 e atende a todos os critérios de liberação de ≥ 70% de viabilidade, negatividade mycoplasma por PCR, nenhum organismo visto por coloração gramada, ≤2 EU/mL de endotoxina, e nenhum crescimento final (14 dias) de esterilidade da cultura sanguínea.

A recaída da leucemia é a principal causa de mortalidade após o transplante hematopoiético de células (HCT) em pacientes com LMA1,2,3. Uma melhor sobrevida livre de leucemia foi relatada com o aumento da recuperação das células γδ T sanguíneas após o HCT sem o aumento do risco de Doença do Enxerto versus Hospedeiro (GVHD)4. A capacidade das células γδ T de reconhecer antígenos de forma independente do MHC e desenvolver fortes funções de efeitos citolíticos e th1 tornam esta pequena subpopulação de células T ideal para o tratamento de pacientes com LMA submetidos a transplante alogênico em risco de recaída5. Dado que as células T Vγ9Vδ2 são um pequeno subconjunto de linfócitos T que variam de 0,5% a 5% das células T na periferia6, propusemos estabelecer um sistema robusto para expandir essa rara população de células sanguíneas para alcançar doses potencialmente terapêuticas para ensaios clínicos.
Embora outros tenham expandido com sucesso células γδ T usando ácido zoledrônico e até mesmo aAPCs, desenvolvemos um processo que pode potencialmente expandir as células γδ T em 229.749 vezes. A expansão é fofásica: primeiro, os linfócitos são obtidos por elutriação utilizando o instrumento de separação. O equipamento fornece um sistema fechado que permite a separação de células com base em seu tamanho, forma e densidade por centrifugação de contrafluxo. Após enriquecer para linfócitos, a expansão seletiva das células T Vγ9Vδ2 é alcançada pelo tratamento com ácido zoledrônico e IL-2 por 7 dias. Imediatamente após este tratamento, as células TCR-αβ T são esgotadas usando a tecnologia de microesferas, permitindo a posterior expansão das células T γδ com aAPCs derivados de K562.
Para validação do processo, apenas 5 × 106 células γδ T expandidas por ácido zoledrônico foram utilizadas para a expansão da cocultura fase 2 com aAPCs. Nesta segunda fase de expansão, as células γδ T são ativadas usando um banco de células de trabalho (WCB) compatível com boas práticas de fabricação (WCB) de aAPCs derivados geneticamente (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fabricados na Moffitt. A lógica dessa expansão fáfasica baseia-se na capacidade do ácido zoledrônico de inibir a distease de difosfato farnésico (FDPS) em monócitos, levando ao acúmulo de pirofosfato isopaténico, que estimula diretamente as células Vγ2Vδ2. Na segunda fase de expansão, os aAPCs derivados do K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fornecem uma estimulação robusta para todas as células T. No entanto, o produto celular já foi enriquecido para as células γδ T, resultando em uma expansão robusta das células γδ T.
Com o uso de equipamentos e frascos específicos, o processo é um sistema funcionalmente fechado, diminuindo assim o risco de contaminação. Além disso, o bioreator de sistema fechado 1 L facilita o crescimento máximo e a expansão das células em um volume total de 1 L de médio com mínima necessidade de alimentação. A vantagem do método Moffitt é que ele fornece um sistema GMP rápido, reprodutível e altamente viável para produzir um produto celular γδ T altamente puro e derivado de doadores para administração aogenética. Este método pode ser aplicado a qualquer ensaio clínico que visa o uso de células γδ T humanas expressando receptores de células T Vγ2Vδ2 como imunoterapia adotiva para mediar a imunidade contra micróbios e tumores em pacientes com câncer com remissão parcial e completa. Além disso, fornece uma plataforma robusta para o desenvolvimento e produção de células T γδ quimérico receptor-positivo (CAR+).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

Embora as células T Vγ9Vδ2 sejam um pequeno subconjunto de linfócitos T, essa população é procurada por sua capacidade de reconhecer antígenos de uma forma importante e de histocompatibilidade (MHC) independente e desenvolver uma forte função de efeito citóltico que o torna um candidato ideal para a imunoterapia contra o câncer. Devido à baixa frequência das células T Gama-Delta (γδ) no sangue periférico, desenvolvemos um protocolo eficaz para expandir um produto de células γδ t altamente puro para o uso in primeiro em humano de células γδ alusicais em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA). Usando aferese saudável do doador como fonte celular alergênica, os linfócitos são isolados usando um dispositivo validado para um método de centrifugação de contrafluxo de separar células por tamanho e densidade. 
A fração rica em linfócitos é utilizada, e as células γδ T são preferencialmente ativadas com ácido zoledrônico (aprovado pela FDA) e interleucina (IL)-2 por 7 dias. Após a expansão preferencial das células T γδ, um dispositivo de separação celular magnética de grau clínico e contas TCRαβ são usadas para esgotar as células T contaminantes (TCR)αβ T. As células γδ T altamente enriquecidas passam então por uma segunda expansão usando células artificiais de presente de antígeno (aAPCs) projetadas de células K562 geneticamente modificadas para expressar fragmento variável de cadeia única (scFv) para CD3 e CD28, 41BBL (CD137L) e IL15-RA-juntamente com ácido zoledr e IL-2. A semeadura de todas as células γδ T enriquecidas no dia 7 em co-cultura com os aAPCs facilita a fabricação de células γδ T altamente puras com uma expansão média de dobra de >229.000 vezes de sangue saudável do doador.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Apresentado é um protocolo para a expansão do produto de células T Gama-Delta (γδ). Os linfócitos são isolados por elutriação e enriquecidos com ácido zoledrônico e interleucina-2. As células T alfa-beta estão esgotadas usando um dispositivo de separação magnética de grau clínico. As células γδ são co-cultivadas com células derivadas de antígenos artificiais e expandidas.

Expansão e enriquecimento de células T Gama-Delta (γδ) do produto humano aferido

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

As células Gamma-Delta T têm poderosa atividade citotóxica contra muitos tipos de câncer, incluindo leucemia mielóide aguda. No entanto, as células Gamma-Delta T circulantes em um sangue são relativamente raras, particularmente em pacientes com malignidades. A infusão de células T derivadas do doador, X-vivo expandiu as células Gamma-Delta T, prometem reduzir a recorrência da leucemia e melhorar a sobrevivência de pacientes com leucemia mielóide aguda.O método proposto alcança uma expansão celular Gamma-Delta T de 200.000 vezes, atingindo doses terapeuticamente relevantes de um produto celular Gamma-Delta T altamente puro, em três passos fáceis. Assim, ligando um IEL à expansão, o esgotamento das células Alfa Beta T por classificação magnética e recompensa de expansão secundária com AAPCs. O método proposto expande a utilidade das células Gamma-Delta T para doenças como câncer e doenças autoimunes, criando rapidamente um grande número de células que podem ser usadas fora da prateleira.Esse processo poderia ser adaptado para expandir as células Gama-Delta usando diferentes métodos de enriquecimento e adicionando manipulações adicionais, como a transdução. Demonstrando que o procedimento será lithed em Los Angeles, um tecnólogo de terapia celular, três do meu laboratório. Comece pela elutriação da amostra do produto de efervescência, no dispositivo de centrifugação de contrafluxo, utilizando um meio primário de solução de sal balanceado Hanks, com albumina de soro humano de 1% e o meio secundário de solução salina ou DPBS.Com a velocidade de centrifugação de elutriação a 900 vezes G, colete frações com base na taxa de fluxo e no tempo. Colete as amostras da fração dois para realizar o teste de esterilidade, contagem de células e fenotipagem celular por citometria de fluxo. A partir da fração dois, expanda uma fração pura de linfócitos de células na cultura em 10 vezes 10 para a sexta células por centímetro quadrado, com cinco micromoles por litro de ácido zoledrônico e 300 unidades por mililitro de Interleukin-2 em um bioreator de sistema fechado de um litro.Incubar o sistema por sete dias a 37 graus celsius, com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, as células de colheita do frasco bioreator do sistema fechado de um litro. Para isso, solde uma embalagem de transferência de um litro para a linha vermelha do bioreator, e use a bomba farmacêutica apropriada para transferir as células para o pacote de transferência.Pegue as amostras para testes de esterilidade média gasta, contagem de células e fenotipagem celular por citometria de fluxo. Da amostra restante, suspenda as células em cinco vezes 10 a oitava células por mililitro, no buffer PBS-EDTA contendo 0,5% HSA e receptor de células T biotinitadas, anticorpo específico alfa beta. E incubar as células a dois a oito graus Celsius com tremor.Após 15 minutos, lave as células com 600 mililitros de tampão PBS-EDTA contendo 0,5 HSA e centrífuga a 200 a 500 vezes G por 15 minutos, a dois a oito graus Celsius, para remover o anticorpo desvinculado. Em seguida, suspenda novamente as células em aproximadamente cinco vezes 10 a oitava células por mililitro, em tampão PBS-EDTA contendo 0,5% HSA e 7,5 mililitros por frasco de microesferas específicas anti-biotina. Como descrito anteriormente, incubar as células com agitação, antes de centrifugar a suspensão celular para remover as microesferas não ligadas.Suspenda seis vezes 10 para a sétima célula por mililitro no buffer PBS-EDTA com 0,5% HSA. Colete-os em uma mala de transferência. Espetá-lo quando instruído pelo instrumento.Em seguida, instale um conjunto de tubos no dispositivo de separação celular magnética de grau clínico. Coloque as embalagens com o tampão PBS-EDTA e o pacote de transferência com o produto celular no instrumento. Para o esgotamento das células alfa beta T rotuladas, selecione o protocolo de esgotamento 1.2 no software.Em seguida, centrifugar o produto celular para coletar a fração alvo enriquecida com células Gamma-Delta T. Suspenda demais as células coletadas no meio, suplementadas com soro AB 10% humano. Realize uma viabilidade de contagem de células e fenotometria de fluxo pós esgotamento.Leve as células a uma concentração final de aproximadamente uma vez 10 a 6 células por mililitro. Irradiar cinco vezes 10 para a sétima células que apresentam antígeno artificial ou AAPCs por frasco, a 100 cinzas no instrumento gerador de raios-X. Preparar uma co-cultura, colocando as células IMS irradiadas e Gamma-Delta T na proporção de 10 é para uma, em um litro de frascos bioreatores fechados do sistema.Com um litro de meio de cultura, suplementado com soro AB 10% humano, semente até 10 frascos. Incubar a cultura a 37 graus Celsius, e 5% de dióxido de carbono por 10 dias, com uma triagem dos níveis de glicose e lactato a cada três ou quatro dias usando tiras, glicose e um medidor de lactato. Se o nível de glicose cair para 215 miligramas por decilitro, reduza o volume no frasco para 200 mililitros.Misture as células nos 200 mililitros restantes da mídia e remova uma amostra de 0,5 mililitro para contagem celular e medição de viabilidade por coloração de iodeto de laranja acrídina ou propídio. Se a contagem de células for igual, ou mais de 10 a nona, divida o conteúdo de um frasco em dois e encha cada frasco até um litro com meio AIM-V, suplementado com soro AB 10% humano. Se a contagem de células for inferior a 10 a nona, alimente as células com um litro fresco de meio de cultura, suplementado com soro AB 10% humano, e devolva os frascos à incubadora.Ao final de 10 dias em co-cultura, colher os frascos bioreatores um de cada vez, e puxar todas as células para um pacote de transferência de tamanho apropriado. Depois de remover as amostras de controle de qualidade, centrifugar as células a 200 a 500 vezes G por 15 minutos em temperatura ambiente, e descartar o sobrenante. Lave as células em uma solução de solução cristalina equilibrada, suplementada com 0,5% HSA a 200 a 500 vezes G por 15 minutos em temperatura ambiente.Suspendê-los em um volume-alvo de 100 a 300 mililitros de solução cristalina equilibrada com 0,5%HSA. As células separadas da fração de centrifugação pós-fluxo. Dois produziram uma população de linfócitos puros, com excelente viabilidade média de 95,80% A expansão específica das células Gamma-Delta T, com ácido zoledrônico, dependia da porcentagem inicial de células assassinas naturais presentes na fração de linfócitos após a elutriação.O enriquecimento da substância gamma-delta t-cell drug, com receptor de células T alfa beta esgotamento foi consistente. O produto de células Gamma-Delta T fabricado a partir de três doadores saudáveis, atendeu ao critério de liberação de menos de 1% das células T beta positivas T do receptor de células T, com uma média de 0,11% CD20 células B positivas, e 0,00% células T-receptor alfa beta positivo T. O percentual médio de células assassinas naturais no produto final foi de cerca de 17,06%, o que atendeu ao critério de liberação de menos de 35% A coloração da superfície celular e a análise citométrica de fluxo, foram utilizadas para caracterizar a identidade, pureza e impurezas de processo da substância da droga e do produto medicamentoso.A segunda re-expansão obtida a partir da co-cultura da substância medicamentosa célulaS Gamma-Delta T, gerou um produto de células T Gama-Delta que atendeu a todos os critérios de liberação. Pathons que enriquecem a população de células T impactam a expansão e características do produto. É necessária consideração e investigação suficientes dos métodos de enriquecimento, antes do início de seu processo de enriquecimento.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Pesquisa do câncer

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolamento de células endoteliais humanas do cólon Normal e Carcinoma colorrectal - um protocolo melhorado

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Baseado na morfologia distinção entre saudável e patológico células utilizando transformações de Fourier e auto-organização mapas

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolamento e Expansão de células T assassinas induzidas por citocina para tratamento de câncer

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Geração e Expansão das Linhas tumorais primárias e malignas do mesotelioma

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...