Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Мы благодарим премию «Клеточная иммунотерапия-исследователь инициировал испытания» от Онкологического центра Моффитта за финансирование этого протокола. Мы также благодарим д-ра Клаудио Анасетти за его неоценимую помощь и руководство в рамках этого проекта. Наконец, мы благодарим д-ра Джастина Буше за его идеи и рецензию на рукопись.

ПРИМЕЧАНИЕ: Было получено одобрение IRB и получено информированное согласие от доноров.
1. Выделение лимфоцитов
<ol><li>Перенесите продукт афереза в чистое помещение. ПРИМЕЧАНИЕ: Валидация процесса проводилась с использованием обычного донорского афереза от внешнего коммерческого поставщика, соответствующего правилам сбора клеточного сырья.</li>
	<li>Соберите образцы для тестирования на стерильность, количество клеток и фенотипирование клеток.</li>
	<li>Элютриат на устройстве центрифугирования противотока с использованием первичной среды сбалансированного раствора соли Хэнкса с 1% сывороточного альбумина человека (HSA) и вторичной среды физиологического раствора (0,9% хлорида натрия для инъекций USP) или фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS). Установите скорость центрифугирования элютриации на уровне 900 × g и соберите фракции на основе расхода и времени.</li>
	<li>Соберите образцы из фракции 2 и выполните следующие испытания: 2 мл для проверки на стерильность; 0,5 мл для количества и жизнеспособности клеток с использованием акридина оранжевого/йодида пропидия (АО/ПИ); 5 × 106 клеток для фенотипирования клеток методом проточной цитометрии.</li>
	<li>Расширить чистую фракцию лимфоцитов (фракция 2) клеток в культуре при 10 × 106 клеток/см2 в 1 л закрытого системного биореактора с 5 мкмоль/л золедроновой кислоты и 300 МЕ/мл IL-2.</li>
	<li>Инкубировать в течение семи дней в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.</li>
</ol>2. Истощение альфа-бета(αβ)Т-клеток
<ol><li>Собирайте клетки из колбы с закрытой системой 1 л. Стерильно приварите 1-литровый трансферный пакет к красной линии биореактора с закрытой системой и используйте соответствующий фармацевтический насос для переноса клеток в трансферную упаковку.</li>
	<li>Берут следующие пробы: 10 мл на отработанную среднюю стерильность; 0,5 мл клеток для подсчета и жизнеспособности клеток с использованием АО/ПИ; 5 × 106 клеток для проточной цитометрии</li>
	<li>Повторное суспендирование клеток при ~5 × 108 клеток/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) или (PBS/этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА)) буфере + 0,5% HSA и биотинилированное TCR αβ-специфическое антитело.</li>
	<li>Поместите шейкер в холодильник и высиживайте ячейки при 2-8 °C в течение приблизительно 15 мин с встряхиванием.</li>
	<li>Промывайте ячейки общим количеством 600 мл буфера PBS/EDTA + 0,5% HSA. Центрифуга удаляет несвязанное антитело при 200-500 × г в течение 15 мин при 2-8 °С. Повторное суспендирование ~5 × 108 клеток/мл в буфере PBS/EDTA + 0,5% HSA с антибиотин-специфическими микрошариками (7,5 мл/1 флакон).</li>
	<li>Поместите шейкер в холодильник и высиживайте ячейки при 2-8 °C в течение приблизительно 15 мин с встряхиванием. После инкубации центрифугируют клетки при 200-500 × г в течение 15 мин при 2-8 °C для удаления несвязанных микрошариков. Повторное суспендирование ~6 × 107 клеток/мл в буфере PBS/EDTA + 0,5% HSA и перенос их в сумку для переноски.</li>
	<li>Установите комплект трубок в устройство разделения магнитных клеток клинического класса, следуя инструкциям производителя, поместите упаковки с буфером PBS / EDTA и передаточным пакетом с клеточным продуктом в приборе и увеличьте его по указанию прибора.</li>
	<li>Выберите протокол Depletion 1.2 для истощения меченых αβ Т-клеток.</li>
	<li>Центрифугировать целевую фракцию (обогащенную γδ Т-клетками) и повторно суспендировать клетки в среде, дополненной 10% сывороткой AB человека.</li>
	<li>Возьмите образец объемом 0,5 мл и выполните подсчет и жизнеспособность клеток с окрашиванием AO / PI. Доведите клетки до конечной концентрации приблизительно 1 × 106 клеток/мл. Возьмите образец из 5 × 106 клеток продукта для фенотипирования проточной цитометрии после истощения.</li>
</ol>3. Совместная культура с APC
<ol><li>Облучение 5 × 107 aAPC/колба при 100 Гр на рентгеногенерирующем приборе.</li>
	<li>Используйте aAPC в кокультуре в соотношении 10:1 с γδ Т-клетками. Поместите облученные APC (5 × 107 клеток/колбу) и γδ Т-клетки (5 × 106 клеток/колбу) в колбы с закрытой системой 1 л закрытой системы с 1 л питательной среды, дополненной 10% сывороткой AB человека. Высевают до 10 колб.</li>
	<li>Разверните клетки в культуре в течение 10 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.</li>
	<li>Контролируйте уровень глюкозы и лактата каждые 3-4 дня с помощью полосок, глюкозы и лактатометра.</li>
	<li>Если уровень глюкозы падает до 250 мг/дл, уменьшите объем в колбе до 200 мл с помощью фармацевтического насоса путем стерильной сварки 1-литрового трансферного пакета к красной линии закрытого системного биореактора.</li>
	<li>Смешайте клетки в оставшихся 200 мл и возьмите образец 0,5 мл для подсчета клеток и измерения жизнеспособности путем окрашивания AO-PI. Если количество клеток составляет ≥109, разделите одну колбу на две колбы и заполните каждую колбу до 1 л AIM-V, дополненной 10% сывороткой AB человека. Если количество клеток составляет <109, кормите клетки свежим литром питательной среды, дополненной 10% сывороткой AB человека.</li>
	<li>Повторите шаг 3.6 для всех колб и верните их в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Повторяйте шаги 3,4-3,7 каждые 3-4 дня.</li>
</ol>4. Сбор клеток
<ol><li>По истечении 10 дней в кокультуре собирают все колбы биореактора. Соберите 1 колбу биореактора за раз и объедините все клетки в трансферную упаковку соответствующего размера. Стерильно приварите трансферную упаковку к красной линии биореактора с закрытой системой и используйте фармацевтический насос для переноса клеток в передаточный пакет.</li>
	<li>Удаляют следующие образцы контроля качества: 1% лекарственного препарата (ДП) для стерильности путем посева крови и окрашивания граммами; 0,5 мл для подсчета и жизнеспособности клеток с использованием АО/ПИ; 5-10 × 106 клеток для проточной цитометрии (см. Рисунок 1 для стратегии гастинга); 0,5 мл для эндотоксина; 0,5 мл для окрашивания в грамм; 106 клеток превратились в 10 мл отработанной среды для тестирования на микоплазму.</li>
	<li>Центрифугируют клетки при 200-500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре и выбрасывают супернатант.</li>
	<li>Промыть ячейки раствором сбалансированного кристаллоидного раствора + 0,5% HSA при 200-500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторно суспендируют их в целевом объеме 100-300 мл сбалансированного кристаллоидного раствора + 0,5% HSA.</li>
</ol>5. Тестирование релиза
<ol><li>Провести контроль качества γδ Т-клеток DP для следующего: чистоты и идентичности методом проточной цитометрии (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); жизнеспособность при окрашивании АО/ПИ; эндотоксин; Тестирование микоплазмы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР); стерильность путем окрашивания по граму и аэробных и анаэробных культур крови; остаточный анализ К562 методом проточной цитометрии (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Лаборатория клеточной терапии Моффита разработала протокол с двухфазным расширением высокочистых γδ Т-клеток для использования в качестве DP в клинических испытаниях. Этот протокол обеспечивает метод производства в соответствии с руководящими принципами cGMP в закрытой системе, которая дает высокочистую γδ T-ячейку DP, которая успешно активируется и расширяется золедроновой кислотой и WCB aAPCs. Этот протокол был одобрен FDA для производства аллогенной γδ Т-клеточной DP для пациентов с ОМЛ. Используя здоровых доноров, мы успешно расширили небольшую популяцию донорских γδ Т-клеток всего за 7 дней с 2,06 ± 0,45% до 54,45 ± 28,34%. После 7-дневного расширения золедроновой кислотой было замечено, что донор 2 имел увеличение популяции НК.
Золедроновая кислота ингибирует фарнезилдифосфатсинтазу (FDPS) в моноцитах, что, в свою очередь, приводит к накоплению изопентенилпирофосфата (IPP), что коррелирует со значительным увеличением пролиферации Т-клеток и естественных NK-клеток7,8,9. Это увеличение популяции NK препятствует 2-й фазе расширения с aAPCs, поскольку aAPC будут только способствовать дальнейшему расширению NK-клеток. По этой причине критерии доноров были изменены, чтобы исключить доноров с высокой численностью населения Нагорного Карабаха. После истощения αβ Т-клеток γδ Т-клетки были дополнительно обогащены до 76,61 ± 27,51%. Этот уникальный протокол включает в себя второе расширение, использующее APC производства Моффита для нацеливания на рецепторы CD8, CD28 и CD127L в γδ Т-клетках. Эта вторая фаза расширения с aAPC дала DP с ≥65% для CD3 + TCR γδ + Т-клеток, ≤1% TCRαβ T и <35% CD3-CD16 + CD56 + NK-клеток. В связи с использованием APC, полученных из K562, было необходимо продемонстрировать, что эти APC составляют <1% конечного продукта.
Moffit CTF разработал проточный цитометрический анализ, используемый для критериев высвобождения для измерения процента остаточных клеток K562 в конечном DP. Этот проточный цитометрический анализ смягчает все проблемы использования антигенов клеточной поверхности для идентификации клеток K562. Поскольку активированные Т-клетки могут экспрессировать CD71, мы разработали стратегию исключения всех Т-клеток и NK-клеток путем выделения популяций CD3-CD56- и CD16- , а затем изучения клеток CD71+ , которые будут исключительно клетками K562. Этот протокол демонстрирует, что DP γδ Т-клеток дает 0,48 ± 0,42% остаточных клеток K562 и соответствует всем критериям высвобождения жизнеспособности ≥70%, негативности микоплазмы с помощью ПЦР, отсутствия организмов, видимых при окрашивании граммами, ≤2 ЕС / мл эндотоксина и отсутствия стерильности конечного роста (14 дней) культуры крови.

Рецидив лейкемии является основной причиной смертности после трансплантации гемопоэтических клеток (HCT) у пациентов с ОМЛ1,2,3. Сообщалось о лучшей выживаемости без лейкемии при повышенном восстановлении γδ Т-клеток крови после HCT без повышенного риска болезни трансплантата против хозяина (GVHD)4. Способность γδ Т-клеток распознавать антигены независимым от MHC способом и развивать сильные цитолитические и Th1-подобные эффекторные функции делает эту незначительную субпопуляцию Т-клеток идеальной для лечения пациентов с ОМЛ, подвергающихся аллогенной трансплантации с риском рецидива5. Учитывая, что Т-клетки Vγ9Vδ2 являются второстепенным подмножеством Т-лимфоцитов в диапазоне от 0,5% до 5% Т-клеток на периферии6, мы решили создать надежную систему для расширения этой редкой популяции клеток крови для достижения потенциально терапевтических доз для клинических испытаний.
Хотя другие успешно расширили γδ Т-клетки, используя золедроновую кислоту и даже aAPC, мы разработали процесс, который потенциально может расширить γδ Т-клетки в 229 749 раз. Расширение двухфазное: сначала лимфоциты получают элютрированием с помощью инструмента разделения. Оборудование обеспечивает замкнутую систему, которая позволяет разделять ячейки на основе их размера, формы и плотности путем противоточного центрифугирования. После обогащения на лимфоциты селективное расширение Т-клеток Vγ9Vδ2 достигается лечением золедроновой кислотой и ИЛ-2 в течение 7 дней. Сразу после этого лечения TCR-αβ Т-клетки истощаются с использованием технологии микрогранул, что позволяет впоследствии расширять γδ Т-клетки с помощью APC, полученных из K562.
Для валидации процесса было использовано только 5 × 106 γδ-Т-клеток, расширенных золедроновой кислотой, для расширения кокультуры фазы-2 с aAPC. На этом втором этапе расширения γδ Т-клетки активируются с использованием текущего Банка рабочих клеток (WCB), совместимого с надлежащей производственной практикой (cGMP), генетически модифицированных APC K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)), изготовленных в Моффитте. Обоснование этого двухфазного расширения основано на способности золедроновой кислоты ингибировать фарнезилдифосфатсинтазу (FDPS) в моноцитах, что приводит к накоплению изопентенилпирофосфата, который непосредственно стимулирует клетки Vγ2Vδ2. На второй фазе расширения производные от K562 aAPC (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) обеспечивают надежную стимуляцию всех Т-клеток. Тем не менее, клеточный продукт уже был обогащен для γδ Т-клеток, что привело к надежному расширению γδ Т-клеток.
С использованием специального оборудования и колб процесс представляет собой функционально закрытую систему, что снижает риск загрязнения. Кроме того, 1 л закрытого системного биореактора способствует максимальному росту и расширению клеток в общем объеме 1 л среды с минимальной потребностью в питании. Преимущество метода Моффитта заключается в том, что он обеспечивает быструю, воспроизводимую и высокоосуществимую систему GMP для получения высокочистого продукта γδ-Т-клеток донорского происхождения для аллогенного введения. Этот метод может быть применен к любому клиническому испытанию, которое направлено на использование человеческих γδ Т-клеток, экспрессирующих рецепторы Т-клеток Vγ2Vδ2, в качестве приемной иммунотерапии для опосредования иммунитета против микробов и опухолей у больных раком с частичной и полной ремиссией. Кроме того, он обеспечивает надежную платформу для разработки и производства γδ химерных антиген-рецептор-положительных (CAR+) Т-клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

Хотя Т-клетки Vγ9Vδ2 являются незначительным подмножеством Т-лимфоцитов, эта популяция востребована за ее способность распознавать антигены основным комплексом гистосовместимости (MHC) независимым образом и развивать сильную цитолитическую эффекторную функцию, что делает ее идеальным кандидатом для иммунотерапии рака. Из-за низкой частоты гамма-дельта (γδ) Т-клеток в периферической крови мы разработали эффективный протокол для значительного расширения высокочистого лекарственного препарата γδ-клеток для первого в человеке использования аллогенных γδ Т-клеток у пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Используя здоровый донорский аферез в качестве аллогенного источника клеток, лимфоциты выделяют с помощью валидированного устройства для метода противоточного центрифугирования разделения клеток по размеру и плотности. 
Используется богатая лимфоцитами фракция, и γδ Т-клетки предпочтительно активируются золедроновой кислотой (одобренной FDA) и интерлейкином (IL)-2 в течение 7 дней. После предпочтительного расширения γδ Т-клеток для истощения загрязняющих Т-клеточных рецепторов (TCR)αβ Т-клеток используется магнитное устройство для разделения клеток клинического класса и шарики TCRαβ. Высокообогащенные γδ Т-клетки затем подвергаются второму расширению с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (aAPC), полученных из клеток K562, генетически модифицированных для экспрессии одноцепочечного переменного фрагмента (scFv) для CD3 и CD28, 41BBL (CD137L) и IL15-RA-вместе с золедроновой кислотой и IL-2. Посев в течение всего дня 7 обогащенных γδ Т-клеток в кокультуре с aAPC облегчает производство высокочистых γδ Т-клеток со средним расширением в 229 000 раз > из здоровой донорской крови.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Представлен протокол расширения гамма-дельта (γδ) Т-клеточного лекарственного препарата. Лимфоциты выделяют элютрированием и γδ-обогащают золедроновой кислотой и интерлейкином-2. Альфа-бета-Т-клетки истощаются с помощью устройства магнитного разделения клинического класса. Клетки γδ культивируют совместно с искусственными антигенпрезентирующими клетками, полученными из K562, и расширяют.

Расширение и обогащение гамма-дельта (γδ) Т-клеток из аферезированного продукта человека

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Гамма-дельта Т-клетки обладают мощной цитотоксической активностью против многих типов рака, включая острый миелоидный лейкоз. Однако циркулирующие гамма-дельта Т-клетки в крови относительно редки, особенно у пациентов со злокачественными новообразованиями. Инфузия донорских, X-vivo расширенных гамма-дельта-Т-клеток, обещает уменьшить рецидив лейкемии и улучшить выживаемость пациентов с острым миелоидным лейкозом.Предлагаемый способ достигает более чем 200 000-кратного расширения гамма-дельта-Т-клеток, достигая терапевтически значимых доз высокочистого продукта гамма-дельта-Т-клеток в три простых этапа. Таким образом, лигирование IEL к расширению, истощение альфа-бета-Т-клеток путем магнитной сортировки и вторичное расширение баунти с помощью AAPCs. Предлагаемый метод расширяет полезность гамма-дельта-Т-клеток при таких заболеваниях, как рак и аутоиммунные заболевания, быстро создавая большое количество клеток, которые могут быть использованы с полки.Этот процесс может быть адаптирован для расширения гамма-дельта-клеток с использованием различных методов обогащения и добавления дополнительных манипуляций, таких как трансдукция. Демонстрация процедуры будет проведена в Лос-Анджелесе, технолог клеточной терапии, три из моей лаборатории. Начинают с элюирования образца шипучего продукта на устройстве центрифугирования противоточного потока, используя первичную среду сбалансированного солевого раствора Хэнкса, с 1% сывороточного альбумина человека и вторичную среду солевого раствора или DPBS.Со скоростью центрифугирования элюрации в 900 раз больше G, собирайте фракции на основе скорости потока и времени. Соберите образцы из фракции два для проведения тестирования на стерильность, количество клеток и фенотипирование клеток с помощью проточной цитометрии. От фракции второй расширить чистую лимфоцитарную фракцию клеток в культуре в 10 раз 10 до шестой клетки на сантиметр в квадрате, с пятью микромолями на литр золедроновой кислоты и 300 единицами на миллилитр интерлейкина-2 в одном литре закрытой системы биореактора.Инкубируйте систему в течение семи дней при температуре 37 градусов по Цельсию, с 5% углекислого газа. После инкубации собирают клетки из однолитровой колбы закрытой системы биореактора. Для этого стерильно приварите литровый трансферный пакет к красной линии биореактора и используйте соответствующий фармацевтический насос для переноса клеток в трансферную упаковку.Возьмите образцы для тестирования стерильности отработанной среды, количества клеток и фенотипирования клеток методом проточной цитометрии. Из оставшегося образца повторно приостанавливают клетки в пять раз по 10 до восьми клеток на миллилитр, в буфере PBS-EDTA, содержащем 0,5% HSA и биотинилированный рецептор Т-клеток, альфа-бета-специфическое антитело. И инкубировать клетки при температуре от двух до восьми градусов Цельсия с встряхиванием.Через 15 минут промыть клетки 600 миллилитрами буфера PBS-EDTA, содержащего 0,5 HSA, и центрифугу в 200-500 раз G в течение 15 минут, при двух-восьми градусах Цельсия, чтобы удалить несвязанное антитело. Затем повторно приостанавливают клетки примерно в пять раз от 10 до восьми клеток на миллилитр, в буфере PBS-EDTA, содержащем 0,5% HSA и 7,5 миллилитра на флакон антибиотиновых специфических микрогранул. Как описано ранее, инкубируйте клетки с встряхиванием, прежде чем центрифугировать клеточную суспензию, чтобы удалить несвязанные микрошарики.Повторно суспендировать шесть раз по 10 до седьмых клеток на миллилитр в буфере PBS-EDTA с 0,5% HSA. Соберите их в сумку для переноски. Поднимите его, когда получите инструкцию от инструмента.Затем установите комплект трубок в устройство для разделения магнитных клеток клинического класса. Поместите упаковки с буфером PBS-EDTA и трансферный пакет с продуктом ячейки в прибор. Для истощения меченых альфа-бета-Т-клеток выберите протокол истощения 1.2 в программном обеспечении.Затем центрифугируют клеточный продукт для сбора целевой фракции, обогащенной гамма-дельта-Т-клетками. Повторно приостановить собранные клетки в среде, дополненной 10% сывороткой AB человека. Выполняют подсчет жизнеспособности клеток и проточную цитометрию фенотипирование после истощения.Доведите клетки до конечной концентрации примерно в один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр. Облучите пять раз от 10 до седьмого искусственного антигенпрезентирующего клетки или AAPC на колбу, при 100 серых на рентгеногенерирующем инструменте. Готовят ко-культуру, помещая облученные AAPC и Gamma-Delta T-клетки в соотношении 10 к одному, в один литр закрытых системных колб биореактора.С помощью одного литра питательной среды, дополненной 10% сывороткой АВ человека, засевают до 10 колб. Инкубируйте культуру при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 10 дней, с скринингом уровня глюкозы и лактата каждые три-четыре дня с использованием полосок, глюкозы и лактатометра. Если уровень глюкозы падает до 215 миллиграммов на децилитр, уменьшите объем в колбе до 200 миллилитров.Смешайте клетки в оставшихся 200 миллилитрах среды и удалите образец размером 0,5 миллилитра для подсчета клеток и измерения жизнеспособности путем окрашивания акридиновым апельсином или йодидом пропидия. Если количество клеток равно или больше 10 к девятому, разделите содержимое одной колбы на две и заполните каждую колбу до одного литра средой AIM-V, дополненной 10% сывороткой AB человека. Если количество клеток меньше 10 к девятому, кормите клетки свежим литром питательной среды, дополненной 10% сывороткой AB человека, и верните колбы в инкубатор.По истечении 10 дней в совместной культуре собирают колбы биореактора по одной и вытягивают все клетки в трансферную пачку соответствующего размера. После удаления образцов контроля качества центрифугируют ячейки в 200-500 раз G в течение 15 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант. Промыть клетки раствором сбалансированного кристаллоидного раствора, дополненного 0,5% HSA в 200 - 500 раз G в течение 15 минут при комнатной температуре.Повторно суспендировать их в целевом объеме от 100 до 300 миллилитров сбалансированного кристаллоидного раствора с 0,5% HSA. Ячейки отделены от постпотоковой центрифугированной фракции. Два дали чистую популяцию лимфоцитов с отличной средней жизнеспособностью 95,80% Удельное расширение гамма-дельта Т-клеток с золедроновой кислотой зависело от начального процента естественных клеток-киллеров, присутствующих во фракции лимфоцитов после элютрирования.Обогащение гамма-дельта Т-клеточного лекарственного вещества с истощением альфа-бета-рецептора Т-клеток было последовательным. Гамма-дельта-Т-клеточный лекарственный препарат, изготовленный из трех здоровых доноров, соответствовал критерию высвобождения менее 1% альфа-бета-положительных Т-клеток рецептора Т-клеток, в среднем 0,11% CD20 положительных В-клеток и 0,00% Т-клеточных рецепторов альфа-бета-положительных Т-клеток. Средний процент естественных клеток-киллеров в конечном продукте составил около 17,06%, что соответствовало критерию высвобождения менее 35% Окрашивание поверхности клеток и проточный цитометрический анализ, которые использовались для характеристики идентичности, чистоты и технологических примесей лекарственного вещества и лекарственного продукта.Второе повторное расширение, достигнутое из совместной культуры AAPC и гамма-дельта Т-клеточного лекарственного вещества, привело к образованию лекарственного препарата гамма-дельта-Т-клеток, который соответствовал всем критериям высвобождения. Пафоны, которые обогащают популяцию Т-клеток, влияют на расширение и характеристики продукта. Необходимо достаточное рассмотрение и исследование методов обогащения до начала процесса их обогащения.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Целевые ячейки предварительного обогащения и весь геном усилители на одну ячейку вниз по течению характеристика

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Изоляция эндотелиальных клеток человека от обычной толстой кишки и колоректальный рак - улучшение протокол

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

На основе морфология различие между здоровым и патологические клетки используя Фурье и самоорганизующихся карт

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Извлечение aqueous Метаболитов из культовых клеток присоединения для метаболомического анализа капиллярной электрофорез-масс-спектрометрии

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Изоляция и расширение цитотоксических цитотинов индуцированных Killer T-клеток для лечения рака

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови человека и CD4+ Т-клеток у пациентов с синдромом Сезари для транскриптомного профилирования

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Выделение и функциональная оценка стволовых клеток рака молочной железы человека из образцов клеток и тканей

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Генерация и расширение первичных, злокачественных опухолевых линий мезотелиомы плевры

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Обнаружение и захват инвазивных клеточных субпопуляций из кокультур в режиме реального времени

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...