Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Vi tackar Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity från Moffitt Cancer Center för att tillhandahålla finansiering för denna protokollutveckling. Vi tackar också Dr. Claudio Anasetti för hans ovärderliga hjälp och vägledning genom detta projekt. Slutligen tackar vi Dr. Justin Boucher för hans insikter och granskning av manuskriptet.

OBS: IRB-godkännande erhölls och informerat samtycke erhölls från givarna.
1. Lymfocytisolering
<ol><li>Överför aferesprodukten till ett rent rum. OBS: Processvalidering utfördes med hjälp av normal donatoraferes från en extern kommersiell leverantör som följer reglerna för insamling av råmaterial.</li>
	<li>Samla in prover för sterilitetstestning, cellantal och cellfenotypning.</li>
	<li>Elutriate på motflödescentrifugeringsanordningen med ett primärt medium av Hanks Balanced Salt Solution med 1% humant serumalbumin (HSA) och ett sekundärt medium av saltlösning (0,9% natriumkloridinjektion USP) eller Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). Ställ in elutriationscentrifugeringshastigheten på 900 × g och samla fraktioner baserat på flödeshastighet och tid.</li>
	<li>Samla in prover från del 2 och utför följande tester: 2 ml för sterilitetstest; 0,5 ml för cellantal och livskraft med acridinorange/propidiumjodid (AO/PI). 5 × 106 celler för cellfenotypning genom flödescytometri.</li>
	<li>Expandera en ren lymfocytfraktion (fraktion 2) av celler i odling vid 10 × 106 celler/cm2 i en 1 L sluten bioreaktor med 5 μmol/L zoledronsyra och 300 IE/ml IL-2.</li>
	<li>Inkubera i sju dagar i en inkubator som är inställd på 37 °C med 5% CO2.</li>
</ol>2. Alfa-beta (αβ) T-cellutarmning
<ol><li>Skörda celler från 1 L bioreaktorkolven med sluten system. Steril-svetsa en 1 L överföringspaket till den röda linjen i den slutna systembioreaktorn och använd lämplig läkemedelspump för att överföra cellerna till överföringsförpackningen.</li>
	<li>Ta följande prover: 10 ml för förbrukad medium sterilitet; 0,5 ml celler för cellantal och livskraft med hjälp av AO/PI; 5 × 106 celler för flödescytometri</li>
	<li>Återsuspend cellerna vid ~5 × 108 celler/ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller (PBS/etylendiamintetraättiksyra (EDTA)) buffert + 0,5% HSA och biotinylerad TCR αβ-specifik antikropp.</li>
	<li>Placera skakapparaten i kylskåpet och inkubera cellerna vid 2-8 °C i ca 15 minuter med skakningar.</li>
	<li>Tvätta cellerna med totalt 600 ml PBS/EDTA-buffert + 0,5% HSA. Centrifugera för att avlägsna den obundna antikroppen vid 200-500 × g i 15 min vid 2-8 °C. Resuspend ~5 × 108 celler/ml i PBS/EDTA buffert + 0,5% HSA med anti-biotinspecifika mikrober (7,5 ml/1 injektionsflaska).</li>
	<li>Placera skakapparaten i kylskåpet och inkubera cellerna vid 2-8 °C i ca 15 minuter med skakningar. Efter inkubation, centrifugera cellerna vid 200-500 × g i 15 min vid 2-8 °C för att avlägsna de obundna mikroberna. Återanvänd ~6 × 107 celler/ml i PBS/EDTA-buffert + 0,5% HSA och överför dem till en överföringspaketpåse.</li>
	<li>Montera slangsetet i den magnetiska cellseparationsanordningen av klinisk kvalitet genom att följa tillverkarens instruktioner, placera förpackningarna med PBS/EDTA-bufferten och överföringsförpackningen med cellprodukten i instrumentet och spika den när instrumentet instruerar den.</li>
	<li>Välj protokollet Utarmning 1.2 för utarmning av de märkta αβ T-cellerna.</li>
	<li>Centrifugera målfraktionen (berikade γδ T-celler) och återanvända cellerna i medium kompletterat med 10% humant AB-serum.</li>
	<li>Ta ett 0,5 ml-prov och utför ett cellantal och livskraft med AO/ PI-fläck. Föra cellerna till en slutlig koncentration på cirka 1 × 106 celler/ml. Ta ett prov på 5 × 106 celler av produkten för flödescytometrifenotypning efter utarmning.</li>
</ol>3. Samkultur med aAPCs
<ol><li>Bestråla 5 × 107 aAPCs/kolv vid 100 Gy på röntgengenererande instrumentet.</li>
	<li>Använd aAPCs i samkultur i ett 10:1-förhållande med γδ T-cellerna. Placera de bestrålade aAPC:erna (5 × 107 celler/kolven) och γδ T-cellerna (5 × 106 celler/kolven) i 1 L slutna bioreaktorkolvar med 1 L odlingsmedium kompletterat med 10 % humant AB-serum. Frö upp till 10 flaskor.</li>
	<li>Expandera cellerna i kultur i 10 dagar i en inkubator vid 37 °C och 5% CO2.</li>
	<li>Övervaka glukos- och laktatnivåerna var 3-4 dagar med hjälp av remsor, glukos och en laktatmätare.</li>
	<li>Om glukosen sjunker till 250 mg/dL, minska volymen i kolven till 200 ml med hjälp av en läkemedelspump genom steril svetsning av ett 1 L-överföringspaket till den röda linjen i den slutna systembioreaktorn.</li>
	<li>Blanda cellerna i de återstående 200 ml och ta ett 0,5 ml-prov för cellräkning och viabilitetsmätning med AO-PI-färgning. Om cellantalet är ≥109, dela upp en kolv i två flaskor och fyll varje kolv upp till 1 L med AIM-V kompletterat med 10% humant AB-serum. Om cellantalet är <109, mata cellerna med en ny liter odlingsmedium kompletterat med 10% humant AB-serum.</li>
	<li>Upprepa steg 3.6 för alla kolvar och återför dem till inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2. Upprepa steg 3,4-3,7 var 3:e till 4:e dag.</li>
</ol>4. Cellskörd
<ol><li>I slutet av 10 dagar i samkultur, skörda alla bioreaktorkolvar. Skörda 1 bioreaktorkolv i taget och slå samman alla celler i ett överföringspaket av lämplig storlek. Steril svetsa överföringsförpackningen till den röda linjen i den slutna bioreaktorn och använd läkemedelspumpen för att överföra cellerna till överföringsförpackningen.</li>
	<li>Ta bort följande kvalitetskontrollprover: 1% av läkemedlet (DP) för sterilitet genom blodkultur och gramfärgning; 0,5 ml för cellräkning och livskraft med hjälp av AO/PI; 5–10 × 106 celler för flödescytometri (se figur 1 för gatingstrategi); 0,5 ml för endotoxin; 0,5 ml för gramfärgning; 106 celler spikade i 10 ml använt medium för Mycoplasma testning.</li>
	<li>Centrifugera cellerna vid 200-500 × g i 15 min vid rumstemperatur och kassera supernatanten.</li>
	<li>Tvätta cellerna i en lösning av balanserad kristalloidlösning+ 0,5% HSA vid 200-500 × g i 15 min vid rumstemperatur. Återanvänd dem i en målvolym på 100-300 ml balanserad kristallformad lösning + 0,5% HSA.</li>
</ol>5. Släpp testning
<ol><li>Utföra kvalitetskontrolltestning av γδ T-cells DP för följande: renhet och identitet efter flödescytometri (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); livskraft genom AO/PI-färgning. endotoxin; Mykoplasmatestning genom polymeraskedjereaktion (PCR); sterilitet genom gramfärgning och aeroba och anaeroba blodkulturer; återstående K562-analys efter flödescytometri (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Moffit Cell Therapy Lab har utvecklat ett protokoll med en bifasisk expansion av mycket rena γδ T-celler för användning som DP i kliniska prövningar. Detta protokoll tillhandahåller en tillverkningsmetod enligt cGMP-riktlinjer i ett slutet system som ger en mycket ren γδ T-cell DP som framgångsrikt aktiveras och expanderas av zoledronsyra och WCB aAPCs. Detta protokoll har godkänts av FDA för tillverkning av en allogen γδ T-cell DP för AML-patienter. Med hjälp av friska donatorer utökade vi framgångsrikt den lilla populationen av donator γδ T-celler på bara 7 dagar från 2,06 ± 0,45% till 54,45 ± 28,34%. Efter 7-dagars expansion med zoledronsyra observerades att givaren 2 hade en ökning av NK-populationen.
Zoledronsyra hämmar farnesy difosfatsyntas (FDPS) i monocyter, vilket i sin tur leder till ackumulering av isopentenylpyrofosfat (IPP), vilket har korrelerats med en betydande ökning av spridningen av T-celler och naturliga NK-celler7,8,9. Denna ökade NK-population hindrar den andra fasen av expansionen med AAPCs, eftersom AAPCs endast kommer att bidra till ytterligare expansion av NK-celler. Därför ändrades givarkriterierna för att utesluta givare med hög NK-population. Efter utarmning av αβ T-cellerna berikades γδ T-cellerna ytterligare till 76,61 ± 27,51%. Detta unika protokoll innehåller en andra expansion som använder de Moffit-tillverkade AAPCs för att rikta in sig på CD8-, CD28- och CD127L-receptorerna i γδ T-cellerna. Denna andra expansionsfas med aAPCs gav en DP med ≥65% för CD3 + TCR γδ + T-celler, ≤1% TCRαβ T och <35% CD3-CD16 + CD56 + NK celler. På grund av användningen av AAPC-produkter som härletts i K562 var det nödvändigt att visa att dessa aAPC utgjorde <1 % av slutprodukten.
Moffit CTF utvecklade en flödescytometrisk analys som används för frisättningskriterierna för att mäta procentandelen av de återstående K562-cellerna i den slutliga DP. Denna flöde cytometriska analys mildrar alla problem med att använda cellytan antigener för att identifiera K562 celler. Eftersom aktiverade T-celler kan uttrycka CD71, utformade vi en strategi för att utesluta alla T-celler och NK-celler genom att gating på CD3- CD56- och CD16- populationer och sedan undersöka CD71 + celler, som skulle vara uteslutande K562 celler. Detta protokoll visar att γδ T-cellen DP ger 0,48 ± 0,42% av de kvarvarande K562-cellerna och uppfyller alla frisättningskriterier för ≥70% livskraft, Mycoplasma negativitet med PCR, inga organismer sett av gramfärgning, ≤2 EU/ml endotoxin och ingen tillväxtfinal (14 dagar) blodkultursterilitet.

Leukemi återfall är den främsta orsaken till dödlighet efter hematopoetisk cell transplantation (HCT) hos patienter med AML1,2,3. Bättre leukemifri överlevnad rapporterades med ökad återhämtning av blod γδ T-celler efter HCT utan ökad risk för Graft- versus- Host Disease (GVHD)4. Förmågan hos γδ T-celler att känna igen antigener på ett MHC-oberoende sätt och utveckla starka cytolytiska och Th1-liknande effektorfunktioner gör denna mindre subpopulation av T-celler idealisk för behandling av AML-patienter som genomgår allogen transplantation i riskzonen för återfall5. Med tanke på att Vγ9Vδ2 T-cellerna är en mindre delmängd av T-lymfocyter som sträcker sig från 0, 5% till 5% av T-cellerna i periferin6, bestämde vi oss för att upprätta ett robust system för att utöka denna sällsynta population av blodkroppar för att uppnå potentiellt terapeutiska doser för kliniska prövningar.
Även om andra framgångsrikt har expanderat γδ T-celler med zoledronsyra och till och med aAPCs, har vi utvecklat en process som potentiellt kan expandera γδ T-celler med 229 749-faldiga. Expansionen är bifasisk: för det första erhålls lymfocyter genom elutriation med hjälp av separationsinstrumentet. Utrustningen ger ett slutet system som gör det möjligt att separera celler baserat på deras storlek, form och densitet genom motflödescentrifugering. Efter berikning för lymfocyter uppnås selektiv expansion av Vγ9Vδ2 T-celler genom behandling med zoledronsyra och IL-2 i 7 dagar. Omedelbart efter denna behandling utarmas TCR-αβ T-celler med hjälp av mikrobjödteknik, vilket möjliggör efterföljande expansion av γδ T-cellerna med K562-härledda aAPCs.
För processvalidering användes endast 5 × 106 zoledronsyraexpansionerade γδ T-celler för fas 2-samodlingsexpansionen med aAPCs. I denna andra expansionsfas aktiveras γδ T-celler med hjälp av en nuvarande god tillverkningssed (cGMP)-kompatibel working cellbank (WCB) av genetiskt konstruerade K562-härledda aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) som tillverkas vid Moffitt. Grunden för denna bifasiska expansion är baserad på zoledronsyrans förmåga att hämma farnesy difosfatsyntas (FDPS) i monocyter, vilket leder till ackumulering av isopentenylpyrofosfat, vilket direkt stimulerar Vγ2Vδ2-cellerna. I den andra fasen av expansionen ger K562-härledda aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) en robust stimulering till alla T-celler. Cellprodukten har dock redan berikats för γδ T-cellerna, vilket resulterar i en robust expansion av γδ T-cellerna.
Med hjälp av specifik utrustning och flaskor är processen ett funktionellt slutet system, vilket minskar risken för kontaminering. Dessutom underlättar 1 L-bioreaktorn för sluten system maximal tillväxt och expansion av celler i en total volym på 1 L medium med minimalt behov av utfodring. Fördelen med Moffitt-metoden är att den ger ett snabbt, reproducerbart och mycket genomförbart GMP-system för att producera en mycket ren, donator-härledd γδ T-cellprodukt för allogen administrering. Denna metod kan tillämpas på alla kliniska prövningar som syftar till att använda mänskliga γδ T-celler som uttrycker Vγ2Vδ2 T-cellreceptorer som adoptivimmunterapi för att medla immunitet mot mikrober och tumörer hos cancerpatienter med partiell och fullständig eftergift. Dessutom ger det en robust plattform för utveckling och produktion av γδ chimeriska antigenreceptorpositiva (CAR+) T-celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

Även om Vγ9Vδ2 T celler är en mindre delmängd av T lymfocyter, är denna population eftertraktad för sin förmåga att känna igen antigener på ett stort histokompatibilitet komplex (MHC)-oberoende sätt och utveckla stark cytolytisk effektor funktion som gör det till en idealisk kandidat för cancer immunterapi. På grund av den låga frekvensen av Gamma-Delta (γδ) T-celler i perifert blod utvecklade vi ett effektivt protokoll för att kraftigt expandera en mycket ren γδ T-cells läkemedelsprodukt för första-i-människa användning av allogena γδ T-celler hos patienter med akut myeloisk leukemi (AML). Med hjälp av friska donatoraferes som allogen cellkälla isoleras lymfocyterna med hjälp av en validerad anordning för en motflödescentrifugeringsmetod för att separera celler efter storlek och densitet. 
Den lymfocytrika fraktionen används, och γδ T-cellerna aktiveras företrädesvis med zoledronsyra (FDA-godkänd) och interleukin (IL)-2 i 7 dagar. Efter den förmånliga expansionen av γδ T-celler används en magnetisk cellseparationsanordning av klinisk kvalitet och TCRαβ-pärlor för att tömma förorenande T-cellsreceptorceller (TCR)αβ T-celler. De högt berikade γδ T-cellerna genomgår sedan en andra expansion med hjälp av konstruerade konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPCs) som härrör från K562-celler genetiskt konstruerade för att uttrycka enkedjevariabelfragment (scFv) för CD3 och CD28, 41BBL (CD137L) och IL15-RA-tillsammans med zoledronsyra och IL-2. Sådd hela dagen-7 berikade γδ T-celler i samkultur med aAPCs underlättar tillverkningen av mycket rena γδ T-celler med en genomsnittlig vikning expansion av >229,000-faldig från friskt donatorblod.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Presenteras är ett protokoll för expansion av Gamma-Delta (γδ) T cell läkemedel produkt. Lymfocyter isoleras genom elutriation och γδ-berikas med zoledronsyra och interleukin-2. Alpha-beta T-celler är uttömda med hjälp av en magnetisk separationsanordning av klinisk kvalitet. γδ-cellerna är samkulturerade med K562-härledda, konstgjorda antigenpresenterande celler och expanderade.

Expansion och anrikning av Gamma-Delta (γδ) T-celler från Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Gamma-Delta T-cellerna har kraftfull cytotoxisk aktivitet mot många cancertyper, inklusive akut myeloisk leukemi. Cirkulerande Gamma-Delta T celler i ett blod är dock relativt sällsynta, särskilt hos patienter med maligniteter. Infusionen av givaren härledda, X-vivo expanderade Gamma-Delta T celler, har löfte om att minska återkommande leukemi och förbättra överlevnaden för patienter med akut myeloisk leukemi.Den föreslagna metoden uppnår större än 200 000 gånger Gamma-Delta T cell expansion, når terapeutiskt relevanta doser av en mycket ren Gamma-Delta T cell produkt, i tre enkla steg. Så ligating en IEL till expansion, alfa beta T cell utarmning genom magnetisk sortering och bounty sekundär expansion med AAPCs. Den föreslagna metoden utökar nyttan av Gamma-Delta T-celler för sjukdomar som cancer och autoimmuna sjukdomar genom att snabbt skapa ett stort antal celler som kan användas från hyllan.Denna process kan anpassas för att expandera Gamma-Delta celler med olika anrikningsmetoder och lägga till ytterligare manipuleringar såsom transduktion. Att demonstrera proceduren kommer att vara lyst i LA, en cellterapitekniker, tre från mitt laboratorium. Börja med elutriation av effervescence-produktprovet, på motflödescentrifugeringsanordningen, med hjälp av ett primärt medium av Hanks balanserade saltlösning, med 1% humant serumalbumin och det sekundära mediet saltlösning eller DPBS.Med elutriationscentrifugeringshastigheten vid 900 gånger G samlar du fraktioner baserat på flödeshastighet och tid. Samla in proverna från fraktion två för att utföra sterilitetstestning, cellantal och cellfenotypning efter flödescytometri. Från fraktion två, expandera en ren lymfocytfraktion av celler i kultur vid 10 gånger 10 till de sjätte cellerna per centimeter i kvadrat, med fem mikromol per liter zoledronsyra och 300 enheter per milliliter Interleukin-2 i en en liter sluten systembioreaktor.Inkubera systemet i sju dagar vid 37 grader celsius, med 5% koldioxid. Efter inkubation, skörda celler från en liter sluten system bioreaktorkolv. För att göra det, steril svetsa en en liter överföringspaket till bioreaktorns röda linje och använd lämplig läkemedelspump för att överföra cellerna till överföringsförpackningen.Ta proverna för testning av förbrukad medelsterilitet, cellantal och cellfenotypning efter flödescytometri. Från det återstående provet suspenderar du cellerna vid fem gånger 10 till de åttonde cellerna per milliliter, i PBS-EDTA-buffert som innehåller 0, 5% HSA och biotinylerad T-cellsreceptor, alfa betaspecifik antikropp. Och inkubera cellerna vid två till åtta grader Celsius med skakningar.Efter 15 minuter, tvätta cellerna med 600 milliliter PBS-EDTA-buffert innehållande 0,5 HSA och centrifugera vid 200 till 500 gånger G i 15 minuter, vid två till åtta grader Celsius, för att avlägsna den obundna antikroppen. Suspendera sedan cellerna vid ungefär fem gånger 10 till de åttonde cellerna per milliliter, i PBS-EDTA-buffert som innehåller 0,5% HSA och 7,5 milliliter per flaska antibiotinspecifika mikrober. Som beskrivits tidigare, inkubera cellerna med skakning, innan du centrifugerar cell suspensionen för att ta bort de obundna mikroberna.Suspendera sex gånger 10 till de sjunde cellerna per milliliter i PBS-EDTA-buffert med 0,5%HSA. Samla dem i en överföringspaketpåse. Spika den när den instrueras av instrumentet.Installera sedan en slanguppsättning i den magnetiska cellseparationsanordningen av klinisk kvalitet. Placera förpackningarna med PBS-EDTA-bufferten och överföringsförpackningen med cellprodukten i instrumentet. Om du vill tömma de märkta alfa-beta-cellerna markerar du utarmningsprotokollet 1.2 i programvaran.Centrifugera sedan cellprodukten för att samla in målfraktionen berikad med Gamma-Delta T-celler. Suspendera de insamlade cellerna i mediet, kompletterat med 10% humant AB serum. Utför en cellräkning livskraft och flöde cytometri fenotypning efter utarmning.För cellerna till en slutlig koncentration på ungefär en gång 10 till de sjätte cellerna per milliliter. Bestråla fem gånger 10 till de sjunde konstgjorda antigenpresenterande cellerna eller AAPCs per kolv, med 100 grå på röntgengenererande instrumentet. Förbered en samkultur genom att placera de bestrålade AAPCs och Gamma-Delta T-cellerna i förhållandet 10 är till en, i en liter slutna system bioreaktorkolvar.Med en liter odlingsmedium, kompletterat med 10% humant AB serum, frö upp till 10 flaskor. Inkubera kulturen vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 10 dagar, med en screening av glukos- och laktatnivåer var tredje till fjärde dag med hjälp av remsor, glukos och en laktatmätare. Om glukosnivån sjunker till 215 milligram per deciliter, minska volymen i kolven till 200 milliliter.Blanda cellerna i de återstående 200 ml media och ta bort ett 0,5 ml-prov för cellräkning och livskraftmätning genom akridinorange eller propidiumjodidfärgning. Om cellantalet är lika med, eller mer än 10 till nionde, dela innehållet i en kolv i två och fyll varje kolv upp till en liter med AIM-V medium, kompletterat med 10% humant AB serum. Om cellantalet är mindre än 10 till nionde, mata cellerna med en färsk en liter odlingsmedium, kompletterat med 10% humant AB-serum, och returnera kolvarna till inkubatorn.I slutet av 10 dagar i samkultur, skörda bioreaktorkolvarna en i taget och dra alla celler i ett överföringspaket av lämplig storlek. Efter att ha tagit bort kvalitetskontrollerna, centrifugera cellerna vid 200 till 500 gånger G i 15 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten. Tvätta cellerna i en lösning av balanserad kristalloidlösning, kompletterad med 0,5% HSA vid 200 till 500 gånger G i 15 minuter vid rumstemperatur.Suspendera dem igen i en målvolym på 100 till 300 milliliter balanserad kristalllösning med 0,5%HSA. Cellerna separerade från post counterflow centrifugeringsfraktionen. Två gav en ren lymfocytpopulation, med en utmärkt genomsnittlig livskraft på 95,80%Gamma-Delta T celler specifika expansion, med zoledronsyra berodde på den ursprungliga andelen naturliga killer celler närvarande i lymfocytfraktionen efter elutriation.Berikningen av Gamma-Delta T-cells läkemedelssubstans, med T-cells receptor alfa beta utarmning var konsekvent. Gamma-Delta T-cells läkemedelsprodukten tillverkad av tre friska givare, uppfyllde frisättningskriteriumet för mindre än 1% av T-cells receptor alfa beta positiva T-celler, med ett genomsnitt på 0,11% CD20 positiva B-celler och 0,00%T-cells receptor alfa betapositiva T-celler. Den genomsnittliga andelen naturliga mördarceller i slutprodukten var cirka 17,06%, vilket uppfyllde frisättningskriteriet på mindre än 35%Cell yta färgning och flöde cytometrisk analys, användes för att karakterisera identitet, renhet och processföroreningar av läkemedelssubstansen och läkemedelsprodukten.Den andra återexpansionen som uppnåddes från samkulturen av AAPC och Gamma-Delta T-cells läkemedelssubstans, genererade en Gamma-Delta T-cells läkemedelsprodukt som uppfyllde alla frisättningskriterier. Patoner som berikar T-cellspopulationen påverkar produktens expansion och egenskaper. Det krävs tillräcklig hänsyn och undersökning av anrikningsmetoderna innan deras anrikningsprocess inleds.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering av mänskliga Endothelial celler från Normal kolon och kolorektal carcinom - ett förbättrat protokoll

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Morfologi-baserade åtskillnad mellan friska och sjukliga celler utnyttja Fourier transformer och självorganiserande kartor

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extraktion av vattenhaltiga metaboliter från odlade anhängare celler för Metabolomic analys av capillary Electrophoresis-masspektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolering och expansion av cytotoxiska Cytokin-inducerad Killer T-celler för cancerbehandling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolering av humana mononukleära celler i perifert blod och CD4+ T-celler från patienter med Sézarys syndrom för transkriptomisk profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering och funktionell bedömning av mänskliga bröstcancerstamceller från cell- och vävnadsprover

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Generering och expansion av primära, maligna pleuramesoteliom tumörlinjer

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Realtidsdetektering och fångst av invasiva cellsubpopulationer från samkulturer

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...