Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Bu protokol geliştirme için finansman sağladığı için Moffitt Kanser Merkezi'nden Hücresel İmmünoterapiler-Araştırmacı Başlatılan Denemeler Ödülü Intramural Finansman Fırsatı'na teşekkür ediyoruz. Dr. Claudio Anasetti'ye de bu projedeki paha biçilmez yardımları ve rehberliği için teşekkür ederiz. Son olarak, Dr. Justin Boucher'e makale hakkındaki görüşleri ve incelemesi için teşekkür ederiz.

NOT: IRB onayı alınmış, bağışçılardan bilgilendirilmiş onay alınmıştır.
1. Lenfosit izolasyonu
<ol><li>Aferez ürününü temiz bir odaya aktarın. NOT: Proses doğrulaması, ham hücresel malzeme toplama yönetmeliklerine uygun harici bir ticari satıcıdan normal donör aferez kullanılarak gerçekleştirildi.</li>
	<li>Sterilite testi, hücre sayısı ve hücre fenotipleme için örnekler toplayın.</li>
	<li>%1 insan serum albümini (HSA) ve ikincil bir salin çözeltisi (%0,9 sodyum klorür Enjeksiyon USP) veya Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi birincil ortamı kullanarak karşı akış santrifüjleme cihazında elütriat. Elütriasyon santrifüjleme hızını 900 × g olarak ayarlayın ve akış hızına ve zamana göre kesirleri toplayın.</li>
	<li>Kesir 2'den numuneleri toplayın ve aşağıdaki testleri yapın: sterilite testi için 2 mL; Acridine turuncu/propidium iyodür (AO/PI) kullanılarak hücre sayısı ve canlılık için 0,5 mL; Akış sitometrisi ile hücre fenotipleme için 5 × 106 hücre.</li>
	<li>5 μmol/L zoledronik asit ve 300 IU/mL IL-2 ile 1 L kapalı sistem biyoreaktörde 10 × 106 hücre/cm2'de kültürdeki hücrelerin saf lenfosit fraksiyonunu (fraksiyon 2) genişletin.</li>
	<li>%5 CO2 ile 37 °C'de ayarlanmış bir inkübatörde yedi gün kuluçkaya yatır.</li>
</ol>2. Alfa-beta (αβ) T hücre tükenmesi
<ol><li>1 L kapalı sistem biyoreaktör şişesinden hücreleri toplar. Kapalı sistem biyoreaktörün kırmızı çizgisine 1 L'lik bir transfer paketi steril kaynaklayın ve hücreleri transfer paketine aktarmak için uygun farmasötik pompayı kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki örnekleri alın: harcanan orta sterilite için 10 mL; AO/PI kullanarak hücre sayısı ve canlılık için 0,5 mL hücre; Akış sitometrisi için 5 × 106 hücre</li>
	<li>Hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) veya (PBS/etylenediaminetetraasetik asit (EDTA)) tampon + %0,5 HSA ve biyotinilasyonlu TCR αβ spesifik antikorda ~5 × 108 hücre/mL'de yeniden biriktirin.</li>
	<li>Çalkalayıcıyı buzdolabına yerleştirin ve hücreleri 2-8 °C'de yaklaşık 15 dakika sallanarak kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücreleri toplam 600 mL PBS/EDTA tampon + %0,5 HSA ile yıkayın. 200-500 × g'daki ilişkisiz antikorun 2-8 °C'de 15 dakika boyunca çıkarılması için santrifüj. PBS/EDTA tamponunda ~5 × 108 hücre/mL + anti-biotin spesifik mikrobeadlarla (7,5 mL/1 şişe) %0,5 HSA'yı yeniden biriktirin.</li>
	<li>Çalkalayıcıyı buzdolabına yerleştirin ve hücreleri 2-8 °C'de yaklaşık 15 dakika sallanarak kuluçkaya yatırın. kuluçkadan sonra, sınırsız mikropları çıkarmak için hücreleri 200-500 × g'da 2-8 ° C'de 15 dakika santrifüj edin. PBS/EDTA tamponu + %0,5 HSA'da ~6 × 107 hücre/mL'yi yeniden biriktirin ve bir transfer paketi torbasına aktarın.</li>
	<li>Boru setini üreticinin talimatlarına uyarak klinik sınıf manyetik hücre ayırma cihazına takın, paketleri PBS/EDTA tamponu ve transfer paketini hücre ürünü ile birlikte cihaza yerleştirin ve cihaz tarafından talimat verildiğinde çivileyin.</li>
	<li>Etiketli αβ T hücrelerinin tükenmesi için Tükenme 1.2 protokolünü seçin.</li>
	<li>Hedef fraksiyonu (zenginleştirilmiş φδ T hücreleri) santrifüj edin ve hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş ortamda yeniden biriktirin.</li>
	<li>0,5 mL'lik bir örnek alın ve AO/PI lekesi ile hücre sayısı ve canlılık gerçekleştirin. Hücreleri yaklaşık 1 × 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona getirin. Akış sitometri fenotipleme sonrası tükenme için ürünün 5 × 106 hücresinden bir örnek alın.</li>
</ol>3. AAPC'lerle ortak kültür
<ol><li>X-ray üreten cihaza 100 Gy'de 5 × 107 aAPC/matara ışınlayın.</li>
	<li>AAPC'leri φδ T hücreleriyle 10:1 oranında birlikte kültür içinde kullanın. Işınlanmış aAPC'leri (5 × 107 hücre/şişe) ve φδ T hücrelerini (5 × 106 hücre/şişe) %10 insan AB serumu ile desteklenmiş 1 L kültür ortamına sahip 1 L kapalı sistem biyoreaktör şişelerine yerleştirin. 10 şişeye kadar tohum.</li>
	<li>37 °C ve %5 CO2'de bir inkübatörde 10 gün boyunca kültürdeki hücreleri genişletin.</li>
	<li>Şeritler, glikoz ve laktat ölçer kullanarak her 3-4 günde bir glikoz ve laktat seviyelerini izleyin.</li>
	<li>Glikoz 250 mg/dL'ye düşerse, kapalı sistem biyoreaktörün kırmızı çizgisine 1 L'lik bir transfer paketini steril kaynak yaparak bir farmasötik pompa kullanarak şişedeki hacmi 200 mL'ye düşürün.</li>
	<li>Kalan 200 mL'deki hücreleri karıştırın ve AO-PI boyama ile hücre sayımı ve canlılık ölçümü için 0,5 mL'lik bir örnek alın. Hücre sayısı ≥109 ise, bir şişeyi iki şişeye bölün ve her şişeyi% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş AIM-V ile 1 L'ye kadar doldurun. Hücre sayısı <109 ise, hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş taze bir litre kültür ortamı ile besleyin.</li>
	<li>Tüm şişeler için 3.6 adımını tekrarlayın ve 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre geri verin. 3,4-3,7 arası adımları her 3 ila 4 günde bir yineleyin.</li>
</ol>4. Hücre hasadı
<ol><li>Ortak kültürde 10 günün sonunda, tüm biyoreaktör şişelerini hasat edin. Bir seferde 1 biyoreaktör şişesi hasat edin ve tüm hücreleri uygun boyutta bir transfer paketine toplayın. Transfer paketini kapalı sistem biyoreaktörün kırmızı çizgisine steril olarak kaynaklayın ve hücreleri transfer paketine aktarmak için farmasötik pompayı kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki kalite kontrol örneklerini çıkarın: kan kültürü ve gram boyama ile sterilite için ilaç ürününün (DP)% 1'i; AO/PI kullanarak hücre sayımı ve canlılık için 0,5 mL; Akış sitometrisi için 5-10 × 106 hücre (gating stratejisi için Şekil 1'e bakın); Endotoksin için 0,5 mL; Gram boyama için 0,5 mL; Mycoplasma testi için 106 hücre 10 mL harcanan ortama yükseldi.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200-500 × g'da santrifüj edin ve üst yapıyı atın.</li>
	<li>Hücreleri dengeli kristaloid çözelti çözeltisi + 200-500'de% 0,5 HSA × g oda sıcaklığında 15 dakika yıkayın. Bunları 100-300 mL dengeli kristaloid çözelti + % 0,5 HSA hedef hacminde yeniden kullanın.</li>
</ol>5. Sürüm testi
<ol><li>Aşağıdakiler için δδ T hücresi DP'nin kalite kontrol testini gerçekleştirin: akış sitometrisine göre saflık ve kimlik (Canlı/ Ölü, CD45, CD3, TCR αβ, TCR φδ, CD20, CD56, CD16); AO/PI boyama ile uygulanabilirlik; endotoksin; Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile mikoplazma testi; gram boyama ve aerobik ve anaerobik kan kültürleri ile sterilite; kalıntı K562, akış sitometrisine göre test edilir (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Moffit Hücre Terapi Laboratuvarı, klinik çalışmalarda DP olarak kullanılmak üzere son derece saf φδ T hücrelerinin bifazik genişlemesi ile bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol, zoledronik asit ve WCB aAPC'ler tarafından başarıyla etkinleştirilen ve genişletilen son derece saf bir φδ T hücre DP'si veren kapalı bir sistemde cGMP yönergeleri altında bir üretim yöntemi sağlar. Bu protokol, AML hastaları için allogeneik δ t hücre DP'si üretimi için FDA tarafından onaylanmıştır. Sağlıklı donörler kullanarak, donör φδ T hücrelerinin küçük popülasyonu sadece 7 günde 2,06'dan %0,45'± 54,45'e ± %28,34'e başarıyla genişlettik. Zoledronik asit ile 7 günlük genişlemeden sonra donör 2'nin NK popülasyonunda artış olduğu gözlendi.
Zoledronik asit, monositlerde farnesil difosfat sintazını (FDPS) inhibe eder ve bu da T hücrelerinin ve doğal NK hücrelerinin çoğalmasında önemli bir artışla ilişkili olan izopentenil pirofosfatın (IPP) birikmesine yol açar7,8,9. Bu artan NK popülasyonu, AAPC'ler yalnızca NK hücrelerinin daha fazla genişlemesine katkıda bulunacağından, AAPC'lerle genişlemenin 2. Bu nedenle, donör kriterleri yüksek NK popülasyonu olan bağışçıları hariç tutacak şekilde değiştirilmiştir. αβ T hücrelerinin tükenmesi sonrasında δδ T hücreleri %27,51 ± 76,61'e zenginleştirilmiştir. Bu benzersiz protokol, φδ T hücrelerindeki CD8, CD28 ve CD127L reseptörlerini hedeflemek için Moffit tarafından üretilen aAPC'leri kullanan ikinci bir genişletme içerir. AAPC'lerle yapılan bu ikinci genişleme aşaması, CD3+TCR φδ+ T hücreleri için %65, ≤1 TCRαβ T ve %<35 CD3-CD16+CD56+ NK hücreleri için %≥65 dp verdi. K562 türevi aAPC'lerin kullanımı nedeniyle, bu APC'lerin nihai ürünün% 1'ini <1'ini oluşturduğunu göstermek gerekiyordu.
Moffit CTF, son DP'deki artık K562 hücrelerinin yüzdesini ölçmek için serbest bırakma kriterleri için kullanılan bir akış sitometrik testi geliştirdi. Bu akış sitometrik tahlili, K562 hücrelerini tanımlamak için hücre yüzey antijenlerinin kullanılmasıyla ilgili tüm sorunları azaltır. Aktif T hücreleri CD71'i ifade edebildiği için, CD3- CD56 ve CD16- popülasyonlarını eleyerek ve daha sonra sadece K562 hücreleri olacak CD71+ hücrelerini inceleyerek tüm T hücrelerini ve NK hücrelerini dışlamak için bir strateji tasarladık. Bu protokol, δδ T hücre DP'sinin artık K562 hücrelerinin% 0.48'ini ± 0.42 verdiğini ve %≥70 canlılık, PCR ile Mycoplasma olumsuzluğu, gram boyama ile görülen organizmalar, ≤2 AB/mL endotoksin ve büyüme finali (14 gün) kan kültürü sterilitesinin tüm salınım kriterlerini karşıladığını göstermektedir.

Lösemi nüks, AML1,2,3 hastalarında hematopoetik hücre nakli (HCT) sonrası mortalitenin önde gelen nedenidir. Daha iyi lösemisiz sağkalım, HCT sonrası kan φδ T hücrelerinin grefte karşı Konak Hastalığı (GVHD)4 riski olmadan iyileşmesinin artmasıyla bildirilmiştir. φδ T hücrelerinin antijenleri MHC'den bağımsız bir şekilde tanıma ve güçlü sitolitik ve Th1 benzeri efektör fonksiyonlar geliştirme yeteneği, T hücrelerinin bu küçük alt nüfusunu nüks riski altındaki allogeneik transplantasyon geçiren AML hastalarının tedavisi için ideal hale getirmektedir5. Vφ9Vδ2 T hücrelerinin, çevre6'daki T hücrelerinin% 0,5 ila% 5'i arasında değişen küçük bir T lenfosit alt kümesi olduğu göz önüne alındığında, klinik çalışmalar için potansiyel olarak terapötik dozlar elde etmek için bu nadir kan hücresi popülasyonunu genişletmek için sağlam bir sistem kurmak için yola çıktık.
Diğerleri zoledronik asit ve hatta aAPC'ler kullanarak φδ T hücrelerini başarıyla genişletmiş olsa da, φδ T hücrelerini potansiyel olarak 229.749 kat genişletebilen bir süreç geliştirdik. Genişleme bifaziktir: ilk olarak, lenfositler ayırma aleti kullanılarak elutriasyon ile elde edilir. Ekipman, hücrelerin boyutlarına, şekillerine ve yoğunluklarına göre ters akış santrifüjleme ile ayrılmasını sağlayan kapalı bir sistem sağlar. Lenfositler için zenginleştikten sonra, Vφ9Vδ2 T hücrelerinin seçici genişlemesi zoledronik asit ve IL-2 ile 7 gün boyunca tedavi ile elde edilir. Bu tedaviden hemen sonra, TCR-αβ T hücreleri mikrobead teknolojisi kullanılarak tükenerek K562 türevi aAPC'lerle δδ T hücrelerinin daha sonra genişlemesine izin verilir.
Proses doğrulaması için, aAPC'lerle faz-2 ortak kültür genişlemesi için sadece 5 × 106 zoledronik asit genişletilmiş φδ T hücresi kullanıldı. Genişlemenin bu ikinci aşamasında, φδ T hücreleri, Moffitt'te üretilen genetik olarak tasarlanmış K562 türevi aAPC'lerin (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) mevcut İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) uyumlu Çalışma Hücresi Bankası (WCB) kullanılarak etkinleştirilir. Bu bifazik genişlemenin mantığı, zoledronik asidin monositlerde farnesil difosfat sintazını (FDPS) inhibe etme yeteneğine dayanır ve Vφ2Vδ2 hücrelerini doğrudan uyaran izopentenil pirofosfat birikimine yol açmaktadır. Genişlemenin ikinci aşamasında, K562 türevli aAPC'ler (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) tüm T hücrelerine sağlam bir uyarım sağlar. Bununla birlikte, hücre ürünü zaten φδ T hücreleri için zenginleştirilmiştir, bu da φδ T hücrelerinin sağlam bir şekilde genişlemesine neden olur.
Belirli ekipman ve şişelerin kullanımıyla, işlem işlevsel olarak kapalı bir sistemdir, böylece kontaminasyon riskini azaltır. Ek olarak, 1 L kapalı sistem biyoreaktör, minimum beslenme ihtiyacı ile toplam 1 L orta hacimde hücrelerin maksimum büyümesini ve genişlemesini kolaylaştırır. Moffitt yönteminin avantajı, allogeneik uygulama için son derece saf, donör türevi bir φδ T hücre ürünü üretmek için hızlı, tekrarlanabilir ve son derece uygulanabilir bir GMP sistemi sağlamasıdır. Bu yöntem, kısmi ve tam remisyonlu kanser hastalarında mikroplara ve tümörlere karşı bağışıklığa aracılık etmek için Vφ2Vδ2 T hücre reseptörlerini benimseyen immünoterapi olarak ifade eden insan δδ T hücrelerini kullanmayı amaçlayan herhangi bir klinik çalışmaya uygulanabilir. Ek olarak, δ oksimerik antijen reseptörü pozitif (CAR+) T hücrelerinin geliştirilmesi ve üretimi için sağlam bir platform sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

Vφ9Vδ2 T hücreleri T lenfositlerinin küçük bir alt kümesi olmasına rağmen, bu popülasyon antijenleri büyük bir histocompabilite kompleksinde (MHC) bağımsız bir şekilde tanıma ve kanser immünoterapisi için ideal bir aday haline getiren güçlü sitolitik efektör fonksiyonu geliştirme yeteneği için aranmaktadır. Periferik kandaki Gama-Delta (φδ) T hücrelerinin düşük sıklığı nedeniyle, akut miyeloid lösemi (AML) hastalarında allogeneik δδ T hücrelerinin insanda ilk kullanımı için son derece saf bir φδ T hücreleri ilaç ürününü büyük ölçüde genişletmek için etkili bir protokol geliştirdik. Allojenik bir hücre kaynağı olarak sağlıklı donör aferez kullanılarak, lenfositler hücreleri boyut ve yoğunluğa göre ayırmanın karşı akış santrifüjleme yöntemi için doğrulanmış bir cihaz kullanılarak izole edilir. 
Lenfosit bakımından zengin fraksiyon kullanılır ve δ T hücreleri tercihen zoledronik asit (FDA onaylı) ve interlökin (IL)-2 ile 7 gün boyunca aktive edilir. φδ T hücrelerinin tercihli genişlemesinden sonra, kirletici T hücre reseptörü (TCR)αβ T hücrelerini tükenmek için klinik sınıf manyetik hücre ayırma cihazı ve TCRαβ boncukları kullanılır. Yüksek oranda zenginleştirilmiş φδ T hücreleri daha sonra CD3 ve CD28, 41BBL (CD137L) ve IL15-RA-ile zoledronik asit ve IL-2 için tek zincirli değişken parçayı (scFv) ifade etmek üzere genetik olarak tasarlanmış K562 hücrelerinden (AAPC' ler) türetilen tasarlanmış yapay antijen sunum hücreleri (AAPC'ler) kullanılarak ikinci bir genişlemeden geçer. Tüm gün-7 zenginleştirilmiş φδ T hücrelerinin aAPC'lerle birlikte üretilmesi, sağlıklı donör kanından ortalama 229.000 kat > kat genişlemesi ile son derece saf φδ T hücrelerinin üretimini kolaylaştırır.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Sunulan Gama-Delta (φδ) T hücreli ilaç ürününün genişletilmesi için bir protokoldür. Lenfositler elütriasyon ile izole edilir ve zoledronik asit ve interlökin-2 ile zenginleştirilir. Alfa-beta T hücreleri klinik sınıf manyetik ayırma cihazı kullanılarak tükeniyor. δδ hücreleri K562 türevi, yapay antijen sunan hücrelerle birlikte kültürlenir ve genişletilir.

Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Gama-Delta T hücreleri akut miyeloid lösemi de dahil olmak üzere birçok kanser türüne karşı güçlü sitotoksik aktiviteye sahiptir. Bununla birlikte, bir kandaki dolaşımdaki Gama-Delta T hücreleri, özellikle maligniteleri olan hastalarda nispeten nadirdir. Donör türevi, X-vivo genişletilmiş Gama-Delta T hücrelerinin infüzyonu, löseminin tekrarlamasını azaltma ve akut miyeloid lösemili hastaların hayatta kalmalarını iyileştirme sözüne sahiptir.Önerilen yöntem, üç kolay adımda, son derece saf bir Gama-Delta T hücre ürününün terapötik olarak ilgili dozlarına ulaşarak 200.000 kat Gama-Delta T hücre genişlemesinden daha fazlasını elde eder. Yani bir IEL'yi genişlemeye, alfa beta T hücre tükenmesine manyetik sıralama ve AAPC'lerle ödül ikincil genişleme ile bağlama. Önerilen yöntem, gama-delta T hücrelerinin kanser ve otoimmün hastalıklar gibi hastalıklar için faydasını hızla raftan kullanılabilecek çok sayıda hücre oluşturarak genişletir.Bu işlem, farklı zenginleştirme yöntemleri kullanılarak gama-delta hücrelerini genişletmek ve transdüksiyon gibi ek manipülasyonlar eklemek için uyarlanabilir. Prosedürü göstermek LA'de, bir hücre terapisi teknolojisti, üç tane laboratuvarımdan alınacak. Efervescence ürün örneğinin, karşı akış santrifüjleme cihazında, %1 insan serum albümin ve ikincil salin çözeltisi veya DPBS ortamı ile Hanks dengeli tuz çözeltisinin birincil ortamını kullanarak elütriasyonu ile başlayın.900 kat G'de elütriasyon santrifüjleme hızı ile akış hızına ve zamana göre kesirleri toplayın. Akış sitometrisi ile sterilite testi, hücre sayısı ve hücre fenotipleme yapmak için örnekleri ikinci fraksiyondan toplayın. İkinci fraksiyondan, kültürdeki hücrelerin saf bir lenfosit fraksiyonunu 10 kez 10'da santimetre kare başına altıncı hücrelere genişletin, bir litre kapalı sistem biyoreaktörde litre zoledronik asit başına beş mikromol ve Interleukin-2 mililitresi başına 300 birim.Sistemi 37 santigrat derecede yedi gün boyunca kuluçkaya yatırın, %5 karbondioksit ile. Kuluçkadan sonra, bir litre kapalı sistem biyoreaktör şişesinden hücreleri hasat edin. Bunu yapmak için, steril bir litrelik transfer paketini biyoreaktörün kırmızı çizgisine kaynaklayın ve hücreleri transfer paketine aktarmak için uygun farmasötik pompayı kullanın.Harcanan orta sterilite, hücre sayısı ve hücre fenotiplemenin akış sitometrisi ile test için örnekleri alın. Kalan örnekten, %0,5 HSA ve biyotinillenmiş T hücre reseptörü, alfa beta spesifik antikor içeren PBS-EDTA tamponunda, hücreleri mililitre başına beş çarpı 10 ila sekizinci hücrede yeniden askıya alın. Ve hücreleri 2 ila 8 santigrat derecede sallanarak kuluçkaya yatır.15 dakika sonra, sınırsız antikoru çıkarmak için hücreleri 0,5 HSA ve 200 ila 500 kez G'de santrifüj içeren 600 mililitre PBS-EDTA tamponu ile 15 dakika boyunca iki ila sekiz santigrat derecede yıkayın. Daha sonra, %0,5 HSA ve anti-biotin spesifik mikrobead şişesi başına 7,5 mililitre içeren PBS-EDTA tamponunda, hücreleri mililitre başına yaklaşık beş kez 10 ila sekizinci hücrede yeniden askıya alın. Daha önce açıklandığı gibi, sınırsız mikropları çıkarmak için hücre süspansiyonu santrifüjlemeden önce hücreleri sallama ile kuluçkaya yatırın.PBS-EDTA tamponunda mililitre başına 6 kez 10 ile %0,5 HSA ile yedinci hücreleri yeniden askıya alın. Onları bir transfer paketi çantasına toplayın. Alet tarafından talimat verildiğinde çivile.Ardından, klinik sınıf manyetik hücre ayırma cihazına bir boru seti takın. Paketleri PBS-EDTA arabelleği ve hücre ürünü içeren transfer paketini cihaza yerleştirin. Etiketli alfa beta T hücrelerinin tükenmesi için yazılımdaki tükenme 1.2 protokolünü seçin.Ardından, Gama-Delta T hücreleriyle zenginleştirilmiş hedef fraksiyonu toplamak için hücre ürününü santrifüj edin. Toplanan hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş ortamda yeniden askıya alın. Hücre sayısı canlılığı ve akış sitometri fenotipleme sonrası tükenme gerçekleştirin.Hücreleri mililitre başına altıncı hücrelere yaklaşık bir kez 10 kez son konsantrasyona getirin. X-ışını üreten cihaz üzerinde 100 gride, şişe başına yedinci Yapay Antijen sunan Hücrelere veya AAPC'lere beş kez 10 kez ışınlayın. Işınlanmış AAPC'leri ve Gama-Delta T hücrelerini bir litre kapalı sistem biyoreaktör şişelerinde 10'a bir oranında yerleştirerek bir ortak kültür hazırlayın.% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş bir litre kültür ortamı ile 10 şişeye kadar tohum. Kültürü 37 santigrat derecede ve 10 gün boyunca% 5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın, şeritler, glikoz ve laktat ölçer kullanarak her üç ila dört günde bir glikoz ve laktat seviyelerinin taranmasını sağlar. Glikoz seviyesi desilitre başına 215 miligrama düşerse, şişedeki hacmi 200 mililitreye düşürün.Kalan 200 mililitrelik ortamdaki hücreleri karıştırın ve akridin turuncu veya propidium iyodür boyama ile hücre sayımı ve canlılık ölçümü için 0,5 mililitrelik bir örnek çıkarın. Hücre sayısı eşitse veya dokuzuncuya 10'dan fazlaysa, bir şişenin içeriğini ikiye bölün ve her şişeyi% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş AIM-V ortamı ile bir litreye kadar doldurun. Hücre sayısı 10 ila dokuzuncudan azsa, hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş taze bir litre kültür ortamı ile besleyin ve şişeleri inkübatöre geri verin.Ortak kültürde 10 günün sonunda, biyoreaktör şişelerini teker teker hasat edin ve tüm hücreleri uygun boyutta bir transfer paketine çekin. Kalite kontrol örneklerini çıkardıktan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 ila 500 kez G'de santrifüjleyin ve üstnatantı atın. Hücreleri, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 ila 500 kez G'de% 0,5 HSA ile desteklenmiş dengeli bir kristaloid çözelti çözeltisinde yıkayın.%0,5 HSA ile 100 ila 300 mililitre dengeli kristaloid çözelti hedef hacminde yeniden askıya alın. Hücreler, karşı akış sonrası santrifüjleme kesirinden ayrıldı. İkisi saf lenfosit popülasyonu verdi, mükemmel ortalama canlılığı ile 95.80% Gama-Delta T hücrelerine özgü genişleme, zoledronik asit ile elutriasyondan sonra lenfosit fraksiyonunda bulunan doğal öldürücü hücrelerin başlangıç yüzdesi bağlıydı.Gama-Delta T hücreli ilaç maddesinin T hücre reseptörü alfa beta tükenmesi ile zenginleştirilmesi tutarlıydı. Üç sağlıklı donörden üretilen Gama-Delta T hücreli ilaç ürünü, ortalama %0,11 CD20 pozitif B hücresi ve %0,00 T hücreli reseptör alfa beta pozitif T hücrelerinin %1'inden daha az salınım kriterini karşıladı. Nihai üründeki doğal öldürücü hücrelerin ortalama yüzdesi% 35'ten az hücre yüzeyi boyama ve akış sitometrik analizinin salınım kriterini karşılayan yaklaşık% 17.06 idi, ilaç maddesinin ve ilaç ürününün kimliğini, saflığını ve işlem saflıklarını karakterize etmek için kullanılmıştır.AAPC ve Gama-Delta T hücreli uyuşturucu maddesinin ortak kültüründen elde edilen ikinci yeniden genişleme, tüm salınım kriterlerini karşılayan bir Gama-Delta T hücreli ilaç ürünü üretti. T hücre popülasyonu zenginleştiren pathonlar ürünün genişlemesini ve özelliklerini etkiler. Zenginleştirme sürecini başlatmadan önce, zenginleştirme yöntemlerinin yeterince değerlendirilmesi ve araştırılması gerekmektedir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Yalıtım Normal kolon ve kolorektal Karsinom - gelişmiş bir iletişim kuralı üzerinden insan endotel hücrelerinin

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Sağlıklı ve patolojik arasında ayrım morfoloji tabanlı kullanarak Fourier dönüşümleri ve kendi kendini düzenleyen haritalar hücreleri

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Kanser Tedavisi için Sitotoksik Sitokin Kaynaklı Katil T Hücrelerinin İzolasyon ve Genişlemesi

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Primer, Malign Plevral Mezotelyoma Tümör Hatlarının Oluşumu ve Genleşmesi

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...