Name: an automated microscopic scoring method for the &#947;-h2ax foci assay in human peripheral blood lymphocytes
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃŽÂ³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا المشاركين في الدراسة على تبرعاتهم بالدم، وكذلك الممرضة ف. برنس على جمع عينات الدم. 12- ويعترف بموجب هذا بالمساعدة المالية المقدمة من مؤسسة البحوث الوطنية لجنوب أفريقيا في هذا البحث. والآراء التي أعرب عنها والاستنتاجات التي تم التوصل إليها هي آراء أصحاب البلاغ ولا تنسب بالضرورة إلى الصندوق الوطني لرعاية المسنين. وقد دعم هذا العمل ماليا الوكالة الدولية للطاقة الذرية، من خلال مشروع للتعاون التقني (رقم: URU6042) لدعم و. مارتينيز لوبيز، فضلا عن مشروع البحوث المنسقة E35010 (رقم العقد: 22248).

س. شونك هو موظف في شركة ميتا سيستمز هارد آند سوفتوير غمب، ألتلوشيم، ألمانيا.

يصف هذا البروتوكول إجراء تدريجيا لتسجيل النقاط الآلي القائم على المجهر الفلوري لمقايس بؤر γ-H2AX. وهو يوضح فائدة فحص بؤر كوسيلة فعالة من حيث الوقت لتحليل عدد DSB الحمض النووي الناجم عن الإشعاع في الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي لإجراء تقييم الجرعة البيولوجية في سيناريو حادث الإشعاع حيث قد يتعرض الأفراد لمستويات غير معروفة من الأشعة تحت الحمراء.
وفي هذا البروتوكول المحدد، تم تشعيع مركبات ثنائي الفينيل متعددة البروم في المختبر لمحاكاة التعرض للإشعاع في الجسم الحي. بمجرد الانتهاء من التشعيع ووقت الحضانة لمدة ساعة واحدة ، يتم إجراء الشرائح باستخدام جهاز طرد مركزي للخلايا لإنشاء بقعة تركيز من الخلايا على الشريحة. استخدام جهاز الطرد الخلوي أمر حيوي لتحقيق شروط موحدة لتسجيل الآلي. عند الانتهاء، يتم استخدام قلم مسعور لجعل دائرة حول الخلايا، للحد من هدر الكواشف عن طريق السماح للمستخدم لترجمة الكواشف تلطيخ. يمكن استخدام هذا النوع من القلم في تقنيات مختلفة لاحتواء المناعة مثل أقسام البارافين والأقسام المجمدة ومستحضرات علم الخلايا. وعلاوة على ذلك، من المهم اختيار قلم مسعور متوافق مع أنظمة الكشف القائمة على الإنزيم والفلورسنت. بعد إعداد الشريحة ، حدث التثبيت والفلورة المناعية γ-H2AX. في هذا البروتوكول، يتم إصلاح الخلايا باستخدام 3٪ PFA في حل PBS لمدة 20 دقيقة. ولكي ينجح الاحتواء المناعي، من الضروري الاحتفاظ بمورفولوجيا الخلايا وأن تكون المواقع المضادة للجينات في متناول كاشفات الكشف المستخدمة. PFA هو عامل لطيف نسبيا لتثبيت واستقرار الخلايا مع الحفاظ على هياكل البروتين51. أدت تجارب التحسين مع تركيزات PFA أعلى وأوقات تثبيت أطول في تأثير سلبي على جودة الشريحة، ولكن المزيد من التخزين (بين عشية وضحاها) في 0.5٪ PFA تصل إلى 24 ساعة أسفرت عن نتائج جيدة.
الأجسام المضادة الأولية، 2F3 أحادية النسيلة المستخدمة في هذا البروتوكول يتفاعل مع البديل الهستون H2AX عندما الفوسفور في سيرين 139 بعد التعريفي DSB الحمض النووي. الأجسام المضادة قادرة على ربط بقايا الفوسفور مع عدم وجود التفاعل مع غيرها من histones الفوسفورية52. وبما أن هذا جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر الأساسي، فقد تم اختيار جسم مضاد ثانوي ضد الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الأولية أثناء تربيته في مضيف بديل، وهو الحمار المضاد للفأرة (DAM)-TRITC. في حين أن تلطيخ immunofluorescent يستند إلى ربط الأجسام المضادة محددة epitope، يمكن أن تؤدي العديد من القوى بين الجزيئيات أيضا في تلطيخ الخلفية غير محددة. من أجل الحد من الربط غير محددة، من المهم استخدام كاشف منع في بروتوكولات تلطيخ immunofluorescent53؛ استخدمنا حل BSA. وعلاوة على ذلك، ينبغي تخصيص وقت كاف لهذه الخطوة حظر عن طريق ترك الشرائح في الحل لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل تلطيخ الأجسام المضادة الأولية والثانوية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب استخدام محلول BSA كمثانة للأجسام المضادة الأولية والثانوية. اعتمادا على المضادة γ-H2AX والأجسام المضادة الثانوية التي تستخدم لتلطيخ, ينبغي للمرء أن تنظر في اختبار مختلف تمييع الأجسام المضادة من أجل تحديد التركيز الأمثل. لتسجيل أكثر دقة، يمكن إجراء تلطيخ مزدوج، عن طريق إضافة الحمض النووي DSB إضافية إصلاح الأجسام المضادة للبروتين.
ومن العيوب الرئيسية لهذا النوع من التحليل الحاجة إلى الحصول على عينات الدم في أقرب وقت ممكن بعد التعرض، حيث من المعروف أن الحد الأقصى لعدد البؤر ينخفض مرة أخرى إلى المستويات الطبيعية في غضون 48 ساعة بعد التشعيع. لذلك، عندما يعرف وقت وقوع حادث إشعاعي وأخذ عينات الدم اللاحقة، قد يكون من المفيد العمل مع منحنيات معايرة مختلفة تم تحديدها في نقاط زمنية مختلفة بعد التشعيع في المختبر (على سبيل المثال، 4 و8 و12 و24 ساعة). ومع ذلك، وكما سبق ذكره في قسم مقدمة المخطوطة، تكمن قوة المقايسة البؤرية γ-H2AX في أغراض الفرز الأولي والسريع وينبغي استخدامها لتحديد أولويات قياس الجرعات البيولوجية الجينية الخلوية الأكثر استهلاكا للوقت. سيناريو مشترك حيث يتم استخدام المؤشرات الحيوية متعددة قياس الجرعات الحيوية بالتوازي، وسوف تولد تقدير الجرعة الأكثر موثوقية ومختلف مختبرات قياس الجرعات الحيوية في جميع أنحاء العالم قد تضافرت جهودها لإنشاء شبكات على الصعيد الوطني التي يمكن تفعيلها واستخدامها للسماح تقييمات متعددة، محاكاة حيوية موازية من قبل مختبرات ذات خبرة مختلفة37،54،55 . بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال التطورات جارية لتحليل فائق السرعة مثل مختبر متنقل في أو بالقرب من موقع الحادث56. ويجري باستمرار تطوير أساليب جديدة واعدة لقياس الجرعات الحيوية، مما سيؤدي إلى إنتاجية أسرع وأكثر موثوقية في المستقبل57.
بالنسبة لنظام تحليل الصور التلقائي، يتم إدخال الشرائح أو وضعها على منصة المسح الآلي أو مرحلة الشريحة. بعد ذلك، قم بتسمية تفاصيل الشريحة وحفظها في المجلد المناسب على الكمبيوتر المرفق. لهذه التجربة، يستند الكشف الآلي عن النوى والمفتوح على إعدادات المصنف المعنية. عند إنشاء مصنف، تأكد من تطابق إعدادات المصنف المحددة مع نوع الخلية الحالي وظروف التحضير وتلطيخ العينة immunofluorescent. يتم تعيين قنوات الفلورسنت المناسبة مطابقة الطيف الإثارة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية في المصنف. يسمح المصنف بوضع معلمات تسجيل إضافية إذا لزم الأمر (على سبيل المثال، حجم النواة، كثافة الفلورسنت، كما هو موضح في القسم 6.1). إذا تم الجمع بين اثنين أو أكثر من بروتينات إصلاح الحمض النووي (على سبيل المثال، γ-H2AX و 53BP1) في تجربة، فإن النظام قادر أيضا على اكتشاف التوطين المشترك للإشارات. أولا، يكتسب النظام صور DAPI، ويطبق معالجة الصور، ويحدد النوى باستخدام المعايير المورفولوجية المحددة في المصنف. يتم الحصول على إشارات TRITC باستخدام 10 z-مداخن مع حجم خطوة من 0.35 مم بين الطائرات المحورية47. استخدم المصنف عدد البؤر المباشر ، حيث يتم تسجيل عدد إشارات TRITC المتميزة داخل النواة. وهنا، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أنه مع زيادة جرعة الإشعاع، تميل إشارات البؤر إلى الاندماج في أجسام أكبر، مما يؤدي إلى التقليل من شأن عدد البؤر الفعلي إذا تم حساب الأجسام مباشرة. لم يكن مطلوبا للتحليل الموضح هنا، ولكن يمكن تنفيذ خطوة إضافية مع تصحيح عدد Foci لحل هذه المشكلة. هذا الأخير يسمح للنظام للحصول على أحجام الإشارات المكتشفة ويزن لهم وفقا لذلك. يمكن استخدام كل من طرق العد توفير تقدير أكثر واقعية من العدد الفعلي لل البؤر بجرعات أعلى.
لبدء المسح الآلي، يتم تحديد منطقة المسح باستخدام الهدف 10x من المجهر لجعل منطقة البحث مستطيلة عن طريق تحديد ركنين من أركان حقل البحث عن طريق النقر الأيسر من الماوس (الشكل 5) ، متبوعا بتركيز موضع البداية. يتم تحديد الكائن المرجعي تلقائيا، ويطالب البرنامج المستخدم بالتركيز على نواة مرجعية (باستخدام الهدف 40x) لكل شريحة وتوسيطها. بعد بدء البحث، سينتقل النظام إلى مركز نافذة البحث في الشريحة المحددة الأولى وسيطلب توسيط وتركيز الكائن المرجعي. سيتم استخدام هذا الكائن لاحقا كمرجع موضع لتصحيح أي إزاحة في موضع الخلية. الغرض الثاني من الحقل المرجعي هو ضبط الضوء التلقائي ، في وضع الضوء المرسل يتم ضبط الضوء حتى يتم الوصول إلى مستوى الضوء الأمثل. في وضع الفلورسينس يتم إصلاح مستوى الضوء، ولكن يمكن زيادة وقت تكامل كاميرا CCD حتى يتم قياس الإشارة المطلوبة. لتمكين ضبط الضوء الصحيح، يجب أن يحتوي المرجع على كائنات ذات تلطيخ نموذجي. من المهم عدم استخدام حقل يحتوي على قطع أثرية ذات كثافة تلطيخ عالية جدا. بعد ضبط الضوء، يبدأ النظام التركيز البؤري التلقائي للشبكة في موضع الشبكة الأقرب إلى الحقل المرجعي. وهي تواصل تركيز الحقول على شبكة منتظمة، وتتحرك في تعرج نحو الجزء الأمامي والخلف من نافذة البحث. يبدأ المسح الضوئي عند اكتمال التركيز البؤري التلقائي للشبكة. يتم نقل المرحلة في حقل نمط تعرج بعد حقل لالتقاط البيانات. عند اكتشاف خلية، يتم تخزين موضعها وصورة المعرض وعرضها على الشاشة ويتم تحديث عدد الخلايا. في حالة حدوث خطأ في المجهر أو المرحلة أو وحدة التغذية، يتم إلغاء البحث تلقائيا. الخطوة الوحيدة التي يوجد فيها تدخل يدوي من المشغل، هي أثناء إعداد مسح الشرائح. هذه هي أيضا النقطة التي يتم فيها فحص مراقبة الجودة السريع (فقاعات الهواء ، أرقام الخلايا المنخفضة ، تلاشي القطع الأثرية لتلطيخ الإشارات الفلورية) وحيث يمكن أن يتقرر إجهاض مسح شريحة ذات جودة رديئة. يتم إنهاء البحث إذا تم مسح الشريحة بأكملها ضوئيا، أو إذا تم الوصول إلى الحد الأقصى لعدد الخلايا، أو إذا تم إلغاء البحث. بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي ، يتم تقديم البيانات كما رأينا في الشكل 6. لعرض الخلايا الممسوحة ضوئيا، يتم فتح نافذة المعرض ويمكن عرض كل خلية (الشكل 7). هذه نقطة أخرى حيث يمكن للمشغل إجراء مراقبة الجودة عن طريق التحقق من تركيز صور المعرض والعدد الإجمالي للخلايا التي تم تسجيلها. إذا كان هناك عدد كبير جدا من الخلايا خارج التركيز أو تم الكشف عن خلايا قليلة جدا من قبل النظام لإجراء تقدير جرعة واقعية (على سبيل المثال، 100 خلية بدلا من الخلايا 1000 المقصود)، ثم ينبغي اتخاذ قرار لاستبعاد الشريحة والنتيجة التلقائية من التقييم النهائي. يتم تلخيص جميع البيانات في المدرجات التكرارية (الشكل 8) ، إلى جانب معلومات حول التوزيع والوسائل والانحراف المعياري لل البؤر المسجلة لكل خلية. ويمكن أيضا استخدام المدرجات التكرارية لاختيار وعرض مجموعات فرعية من النوى استنادا إلى النتائج الآلية للمراجعة. يتم إجراء التحليلات الإحصائية على النتائج بعد التوزيع، المتوسط، وقد تم تسجيل الانحراف المعياري للرقم البؤر لكل خلية يدويا. يمكن استخدام الرسم البياني كمنحنى معايرة لإجراء تقدير الجرعة لعينة قياس الجرعات الحيوية. ويمكن القيام بذلك باستخدام معادلة خط الاتجاه لإجراء تقدير تقريبي للجرعة المتلقاة. علاوة على ذلك الشكل 9 يوضح أن المسح الآلي حساس بما يكفي للكشف عن البؤر الناجمة بجرعات منخفضة. وعلاوة على ذلك، تظهر النتائج زيادة خطية واضحة لعدد البؤر لكل خلية مع الجرعة. وتجدر الإشارة إلى أن النتائج هي ممثل فقط للمصنف المستخدمة، وسوف تختلف النتائج لمعلمات مصنف مختلفة. لذلك، في حالة تحليل قياس الجرعات الحيوية، من المهم أن يتم استخدام نفس المصنف وإعداد الشريحة لعينات قياس الجرعة الحيوية مثل تلك التي تم استخدامها لإنشاء منحنى المعايرة الذي يستخدم لأداء تقدير الجرعة. في حين أنه كان خارج نطاق هذه الدراسة، من المهم أن نلاحظ أن γ-H2AX foci المقايسة يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد تشعيع الجسم الجزئي. معظم التعرضات العرضية للإشعاع هي التعرض غير المتجانس أو الجزئي للجسم، حيث لم تتلق سوى منطقة محلية من الجسم جرعة عالية من التعرض. أوضحت العديد من الدراسات أنه من الممكن استخدام γ-H2AX foci تقدير جزء الجسم الذي تم تشعيعه والجرعة إلى الكسر المشعع42. عندما يحدث تشعيع كامل الجسم ، سيكون هناك تحريض عشوائي من الحمض النووي DSB في جميع الخلايا ويمكن للمرء أن يتوقع العثور على توزيع بواسون. على غرار الطرق الخلوية حيث يميل تحريض الانحرافات الكروموسومية إلى أن يكون أكثر من مشتتة في الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي حيث توجد وفرة عالية من الخلايا مع انحرافات متعددة وخلايا مع metaphases العادية ، وتحليل تشتت بؤر γ H2AX باستخدام طريقة بواسون الملوثة المقترحة على توزيعات بؤر متفرقة58. وتأكد أيضا أن هذا الأخير في in vivo تجارب مع الخنازير الصغيرة والمكاك ريسوس59.

وقد أصبح الإشعاع المؤين منذ اكتشافه أداة لا غنى عنها في الممارسات الطبية والصناعية الحالية، وكذلك في التطبيقات الزراعية والعسكرية. ومع ذلك، فإن الاستخدام الواسع النطاق للأشعة تحت الحمراء يزيد أيضا من خطر التعرض المفرط للإشعاع لكل من العاملين المهنيين في مجال الإشعاع وكذلك لأفراد الجمهور. الأشعة تحت الحمراء هي مادة مسرطنة مادية معروفة يمكن أن تسبب تلف الحمض النووي بطريقة مباشرة أو غير مباشرة ، مما يؤدي إلى مخاطر صحية كبيرة 1،2. لذلك ، من المهم إجراء تقييم الجرعة ، لأن درجة التعرض تشكل خطوة أولية مهمة في إدارة حادث الإشعاع 1.
في حالة حدوث حالات طوارئ نووية أو إشعاعية واسعة النطاق ، يمكن أن يتراوح عدد تقييمات الجرعة التي تحتاج إلى إجراء من بضعة إلى آلاف الأشخاص اعتمادا على حجم الحادث3. في هذه السيناريوهات، قد يكون قياس الجرعات المادية غامضا أيضا (على سبيل المثال، إذا لم يتم ارتداء مقياس الجرعات بشكل صحيح) أو غير متوفر، عندما يشارك أفراد الجمهور. في حين يمكن استخدام الأعراض السريرية للفرز ، إلا أنها ليست بالضرورة محددة للإشعاع ويمكن أن تؤدي إلى تشخيص خاطئ. لذلك ، من المستحسن استخدام قياس الجرعات البيولوجية جنبا إلى جنب مع قياس الجرعات الفيزيائية والتقييمات السريرية. تسمح هذه الطريقة بتحليل التغيرات الناجمة عن الإشعاع على المستوى الخلوي وتمكن من تحديد الأفراد المعرضين بشكل لا لبس فيه الذين يحتاجون إلى علاج طبي4. يمكن للطبيب بعد ذلك استخدام هذا التقييم الجرعة البيولوجية لاستكمال إعادة بناء الجرعة المادية والتشخيصات السريرية الأخرى, من أجل وصف الرعاية الطبية المناسبة5. وستكون الحاجة إلى قياس الجرعات البيولوجية عالية بشكل خاص بالنسبة لفرز الإصابات وإدارتها طبيا عندما لا يكون سيناريو التعرض معروفا جيدا وعندما يكون الضحايا من أفراد الجمهور. والغرض الرئيسي من الفرز هو التمييز الفعال بين الأشخاص "القلقين بشكل جيد"، الذين يمكن أن تكون لديهم أعراض برودرومال ولكنهم لم يتلقوا جرعة عالية، وبين الأشخاص المعرضين الذين يحتاجون إلى مساعدة طبية فورية ورعاية متخصصة. مستوى عتبة الجرعة الإشعاعية التي يمكن أن تسبب مرض الإشعاع هو حوالي 0.75 - 1.00 Gy. ثم, هؤلاء الأفراد الذين يتلقون > 2 Gy التعرض هم أكثر عرضة للإصابة بمتلازمة الإشعاع الحاد وينبغي أن تتلقى العلاج الطبي الفوري6,7. وتكون تقديرات الجرعة البيولوجية الدقيقة في الوقت المناسب للضحايا الذين وقعوا في مرمى نيران هذه الكوارث حاسمة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن أيضا الراحة وطمأنة الضحايا المعرضين الحد الأدنى8.
تستخدم سلطات الحماية من الإشعاع علامات قياس الجرعات الحيوية المختلفة ، والتي تستند بشكل رئيسي إلى اكتشاف الضرر الوراثي الخلوي ، مثل الكروموسومات ثنائية المركز أو النوى الدقيقة ، في الخلايا الليمفاوية البشرية المستزرعة9. الكشف عن الضرر الوراثي الخلوي يمكن أيضا أن يتم عن طريق الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) نقل المقايسة10. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي للطرق الوراثية الخلوية التقليدية هو وقت التحول الطويل للحصول على النتائج في حالة الطوارئ8.
واحدة من أقدم الخطوات في عملية التعرف على الحمض النووي DSB هو الفوسفور من البديل الهستون H2AX، مما يؤدي إلى تشكيل γ-H2AX، والتوظيف اللاحقة لعوامل الإصلاح. على مدى العقد الماضي، تلقى الكشف عن بؤر γ-H2AX الناجمة عن الإشعاع في الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي باستخدام المجهر المناعي اهتماما متزايدا كأداة قياس الجرعات البيولوجية الموثوقة11،12،13،14،15. اعتمادا على جودة الإشعاع ونوع الخلية، يتم الكشف عن العائد الأقصى من بؤر γ-H2AX في غضون 0.5 - 1 ساعة بعد التشعيع16،17. ومن المتوقع أن يكون هناك ارتباط وثيق بين عدد الحمض النووي DSB و بؤر γ-H2AX، وكذلك بين اختفاء البؤر وإصلاح DSB. وقد أظهرت تجارب مقص الليزر مع ميكروب ليزر نبضي أن γ-H2AX بؤر توطين لمواقع الحمض النووي DSB18. في حين أنه لا يزال موضوعا للنقاش النشط، واحدة من الدراسات الأولى مع 125اقترحت علاقة واحدة إلى واحد بين العدد المحسوب من التفكك لكل خلية (قابلة لتمثيل لعدد من الحمض النووي الناجم عن الإشعاع DSB) وعدد بؤر γ-H2AX التي تم تسجيلها19،20.
على مدى العقد الماضي، مول الاتحاد الأوروبي مشروعي MULTIBIODOSE (أدوات قياس الأعماق الحيوية متعددة التخصصات لإدارة الإصابات الإشعاعية على نطاق واسع) ومشروع RENEB (تحقيق الشبكة الأوروبية لقياس الجرعات الحيوية) لإنشاء شبكة مستدامة في مجال قياس الجرعات البيولوجية وال بأثر رجعي21,22. وشمل هذا المشروع مختبرات مختلفة في جميع أنحاء أوروبا لتقييم قدرات الاستجابة لحالات الطوارئ في حالة الطوارئ الإشعاعية14,21,22. و γ-H2AX foci المقايسة لديها عدد من المزايا الكبيرة، مثل وقت المعالجة السريعة، وإمكانية معالجة دفعة السماح لسرعة الإنتاجية العالية، فضلا عن حساسيتها العالية إذا استخدمت في غضون ساعات قليلة بعد التعرض13,23,24. أدت الحساسية العالية للمقايسة في نطاق الجرعة المنخفضة إلى عدد من الدراسات التي استخدم فيها اختبار بؤر γ-H2AX كمؤشر على تأثير التعرض للإشعاع الطبي ، سواء في العلاج الإشعاعي أو في تطبيقات التصوير التشخيصي25,26,27,28,29,30. وهذه الخصائص تجعل من γ-H2AX foci asay بديلا تنافسيا للغاية للأساليب الأخرى للفرز المبكر في الحوادث النووية الكبيرة لفصل الأشخاص المعرضين بشدة عن الأفراد ذوي المخاطر المنخفضة. وقد أوضحت العديد من التجارب التحسين أنه من الممكن إجراء γ-H2AX foci المقايسة مع كميات صغيرة من الدم، مثل دراسة موكيه وآخرون الذين أفادوا أنه من الممكن إجراء γ-H2AX foci المقايسة مع قطرة دم فقط (وخز الإصبع)31. وقد استخدم نهج مماثل في تطوير نظام RABIT (أداة القياس البيولوجي الآلي السريع) المؤتمت بالكامل والذي تم تحسينه لقياس غلة γ-H2AX من عينات الدم المشتقة من عصا الإصبع32,33. وبشكل عام، تشير نتائج الدراسات المقارنة بين MULTIBIODOSE وRENEB إلى أن اختبار بؤر γ-H2AX يمكن أن يكون أداة فرز مفيدة للغاية بعد التعرض للإشعاع الحاد مؤخرا (حتى 24 ساعة)12,13,14. في دراسة مقارنة بين نطاق الجرعة المنخفضة ، يمكن تمييز جرعة منخفضة يصل إلى 10 mGy عن عينات التحكم المشععة ، مما يسلط الضوء على حساسية المقايسة في نطاق الجرعة المنخفضة34. من المهم ملاحظة أن الحساسية العالية للمقايسة صحيحة بشكل خاص للخلايا الليمفاوية ، مما يجعلها واحدة من أنسب أنواع الخلايا لتقييم التعرض للجرعات المنخفضة. الخلايا الليمفاوية هي أساسا خلايا غير ركوب الدراجات وتمثل السكان متزامن. هذا الأخير يتجنب التعبير عن γ-H2AX يرتبط مع تكرار الحمض النووي، مما يقلل بشكل كبير من حساسية المقايسة للكشف عن DSB الناجم عن الإشعاع خلال G2 و S-المرحلة من دورة الخلية35. بالإضافة إلى حساسيته للجرعات المنخفضة للخلايا الليمفاوية ، فإن وقت التحول في فحص بؤر γ-H2AX أسرع بكثير من التقنيات الجينية الخلوية مثل المقايسة ثنائية المركز والنووية الدقيقة ، لأنها لا تتطلب تحفيز الخلايا الليمفاوية. لذلك، يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعات قليلة مقارنة مع بضعة أيام للتقنيات الوراثية الخلوية. ومن العيوب الرئيسية للمقايسة الاختفاء السريع لإشارة بؤر γ-H2AX، التي عادة ما تنخفض إلى مستويات خط الأساس في غضون أيام بعد التعرض للإشعاع اعتمادا على الحركية إصلاح الحمض النووي36. ولذلك، فإن أنسب تطبيق للمقايسة في سياق قياس الجرعات الحيوية هو لأغراض الفرز الأولية وإعطاء الأولوية لمتابعة قياس الجرعات البيولوجية الجينية الخلوية الأكثر استهلاكا للوقت بالنسبة لبعض الضحايا. ومع ذلك ، لقياس الجرعات الحيوية بأثر رجعي دقيق والآثار على المدى الطويل ، يجب على المرء الاعتماد على التقنيات الجينية الخلوية مثل تحليلات FISH ثلاثية الألوان للكشف عن الانحرافات الكروموسومية المستقرة في حالة حدوث التعرض قبل عدة سنوات10.
وكجزء من عدة مبادرات لقياس الجرعات الحيوية، تم تقييم العديد من المقاييس لأغراض الفرز بجانب المقايسة البؤرية γ-H2AX لفرز الأشخاص في حالات الطوارئ الإشعاعية الواسعة النطاق؛ مثل المقايسة ثنائية المركز، و المقايسة الميكرونوكليوس كتلة السيتوكينيز، الرنين المغناطيسي الإلكترون (EPR)، فحص بروتين المصل (SPA)، فحص بقع الجلد (SSA)، التلألؤ المحفز بصريا (OSL)، فضلا عن تحليل التعبير الجيني 37،38. يمكن استخدام γ-H2AX foci المقايسة كميا لتقييم تشكيل الحمض النووي DSB وإصلاح39. ومع ذلك ، فإن المقايسة تعتمد على الوقت حيث يختلف مستوى بؤر γ-H2AX مع مرور الوقت بعد التشعيع بسبب الحركية إصلاح الحمض النووي DSB40. وأوضحت دراسة مقارنة أن التهديف المجهري مع قدرة z-المرحلة يقدم النتائج الأكثر دقة بعد 1 غي من الإشعاع، في حين أن قياس التدفق الخلوي يعطي فقط نتائج موثوقة بجرعات أعلى من الأشعة تحت الحمراء41. هناك العديد من التقارير عن تطوير حلول تحليل الصور لاستخدامها في تسجيل الآلي42،43،44،45،46. في هذا البروتوكول، يتم استخدام منصة المجهر الفلوري الآلي عالية الإنتاجية لتحليل بؤر γ-H2AX في الخلايا الليمفاوية الطرفية في الدم. استخدام نظام التهديف التلقائي يتجنب التحيز التهديف بين المختبر وبين المراقبين، في حين أنه لا يزال يسمح حساسية كافية للكشف عن جرعات أقل من 1 غي47. الميزة الأساسية لهذا النظام مقارنة مع البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر لتسجيل بؤر هو حقيقة أن العملية الكاملة من مسح الشرائح لالتقاط وتسجيل الآلي. مفهوم المصنفات القابلة للتعريف والمستور يضمن القابلية لإعادة الإنتاج مما يضيف درجة غير متحيزة من الجودة إلى النتائج. ولذلك، يوضح هذا العمل كيف يمكن الحصول على نتائج بؤر γ-H2AX باستخدام طريقة المسح المجهري الآلي والتهديف التي يمكن استخدامها عندما يتم تلقي عينات الدم من الأفراد الذين يحتمل أن يكونوا أكثر تعرضا من قبل مختبرات البيولوجيا الإشعاعية لأغراض قياس الجرعات البيولوجية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin - BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips (Size 24 x 50 mm)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td>Glass2C29M2450Rec</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials (1.2 mL)</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>607101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC370-12-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin Clips</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin filter cards</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin Funnels</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM-TRITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A16022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-Fluroshield</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Kimix</td>
			<td>ETD901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>&#160;200ul (312012) and 1000ul (313012)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid- HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium&#8211;heparin collection tubes</td>
			<td>The Scientific Group</td>
			<td>367526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaSystems - Metafer</td>
			<td>Metasystems</td>
			<td>Azio Imager Z2: 195-041848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoPen</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline Tablets</td>
			<td>Separations</td>
			<td>SH30028,02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>P11037 and P1033</td>
			<td>X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45&#176; angles to help reduce glass breakage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613402 / 100 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>BE12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (15ml)</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>601002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Tra adhesive slides &#8211; corner clipped</td>
			<td>SMM Technologies</td>
			<td>3800200E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated microscopic scoring method for the &#947;-h2ax foci assay in human peripheral blood lymphocytes

الإشعاع المؤين هو محفز قوي لتلف الحمض النووي ومسرطن موثق جيدا. ويشمل قياس الجرعات البيولوجية الكشف عن الآثار البيولوجية الناجمة عن التعرض للإشعاع المؤين لإجراء تقييم الجرعة الفردية. وهذا أمر وثيق الصلة بالموضوع في إطار حالات الطوارئ الإشعاعية، حيث تكون التقييمات الصحية والتخطيط للعلاج السريري للضحايا المعرضين للخطر حاسمة. وبما أن فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي (DSB) تعتبر الشكل الأكثر فتكا من تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع، يقدم هذا البروتوكول طريقة للكشف عن الحمض النووي DSB في عينات الدم. وتستند المنهجية إلى الكشف عن بروتين إصلاح الحمض النووي المسمى الفوسفوري الفلوري، أي γ-H2AX. استخدام منصة المجهر الآلي لتسجيل عدد من بؤر γ-H2AX لكل خلية يسمح بتحليل موحد مع انخفاض كبير في الوقت بدوره حولها. ولذلك، فإن γ-H2AX يمكن أن يكون واحدا من أسرع القياسات وأكثرها حساسية لقياس الجرعات البيولوجية. في هذا البروتوكول، سيتم معالجة عينات الدم الكامل من المتطوعين البالغين الأصحاء وإشعاعها في المختبر من أجل توضيح استخدام الفحص الآلي والحساس γ-H2AX لتطبيقات قياس الجرعات الحيوية. يتم استخدام نظام مسح الشرائح الآلي ومنصة التحليل مع المجهر الفلوري المتكامل ، والذي يسمح بتسجيل سريع وتلقائي ل DSB الحمض النووي بدرجة منخفضة من التحيز.

لهذا البروتوكول، تم عزل خلايا الدم المحيطي البشري أحادية النووية (PMBCs) من الدم الكامل لأربعة متطوعين بالغين أصحاء وتعرضت لجرعات إشعاعية من 0.125 و0.250 و0.500 و1.000 و2.000 Gy. وبعد ذلك، تم احتضان العينات لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطوبة 2 CO 5٪. بعد التثبيت وتلطيخ immunofluorescence ، يتم مسح الشرائح تلقائيا وسجلها. الأرقام 6و 7 و 8 تعطي تمثيلا لما مخرجات البرنامج للمستخدم. تظهر نافذة تحليل بمجرد اكتمال الفحص، مما يعطي لمحة عامة عن البؤرة المسجلة. المعرض يعطي جميع بؤر سجل مع القائمة التفاعلية التي يمكن حذف القيم المتطرفة وأخيرا يتم إعطاء مخطط بياني مع ملخص البيانات التفصيلية.
يتم عرض γ-H2AX بؤر العائد بعد التعرض للأشعة γ في الشكل 9. وكانت هناك زيادة تدريجية في عدد بؤر γ-H2AX بجرعة متزايدة. لا يوضح هذا الرسم البياني اعتماد الجرعة وحساسية المقايسة فحسب ، بل يمكن أيضا استخدام الملاءمة لإجراء تقدير الجرعة عند تلقي عينة من فرد تعرض لجرعة غير معروفة. من المهم أن نلاحظ أن المرء لن يكون لها السيطرة صورية الإشعاع أو مستويات بؤر الخلفية لهذا الفرد. ولذلك، يشمل الشكل 9 القيمة 0 Gy لعينات التحكم المشععة، التي كانت 0.57 ± 0.23 Gy للمتبرعين البالغين الأربعة في هذه الدراسة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig01.jpg"> الشكل 1: إعداد الشرائح للطردالمركزيالخلوي. ضع الشريحة في حامل القصاصة، وأضف بطاقة التصفية فوقها، وأخيرا القمع. تأمين مقاطع الشرائح ومكان في جهاز الطرد الخلوي. بعد الطرد الخلوي، قم بإزالة الشريحة من حامل القصاصة وارسم دائرة حول المكان باستخدام الخلايا القلم الكاره للماء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig02.jpg"> الشكل 2: منصة المسح الآلي التي استخدمت في هذا البروتوكول، والتي تحتوي على ماسح ضوئي آلي متصل بمجهر فلوري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig03.jpg"> الشكل 3: قائمة لإعداد الشرائح. افتح الحوار بالنقر فوق الزر SETUP في الشريط الجانبي. حدد أو أدخل الدليل المستهدف لملفات النتائج <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig04.jpg"> الشكل 4: قائمة إعداد المصنف. تأكد من تطابق إعدادات المصنف المحددة مع نوع الخلية الحالي وظروف التحضير وأنماط تلطيخ العينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig05.jpg"> الشكل 5: قائمة الإعداد لنافذة البحث اليدوي. تم تحديد الإطار في إعداد الشريحة؛ سيفتح حوار يسمح بتحديد منطقة المسح الضوئي. باستخدام الهدف 10x، يتم تحديد منطقة البحث المستطيلة على الشريحة بشكل تفاعلي عن طريق إصلاح ركنين من حقل البحث عن طريق النقر الأيسر للفأرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig06.jpg"> الشكل 6: نافذة التحليل ، بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي ، تظهر نافذة التحليل نتائج الفحص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig06large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig07.jpg"> الشكل 7: عرض المعرض للشريحة المحددة. تم العثور على علامة التبويب معرض على الشريط الجانبي. يتكون معرض الصور من صور صغيرة للخلايا التي تم اكتشافها ، معروضة كصورة DAPI-TRITC مجتمعة. في الزاوية اليسرى والأي اليمنى السفلى من كل صورة يتم عرض عدد البؤر المباشرة وعدد البؤر المصححة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig08.jpg"> الشكل 8:صور المدرج التكراري للشريحة المحددة. يتم فتح هذه النافذة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الرسم البياني. بالنقر على الرسم البياني، توفر ورقة علامة التبويب المدرج التكراري ملخص بيانات يسرد متوسط الانحراف المعياري ومعامل التباين والقيم الدنيا والحد الأقصى والوسيط للخلايا التي تم تحليلها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig08large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig09.jpg"> الشكل 9: عدد بؤر γ-H2AX كدالة لجرعة الخلايا الليمفاوية المعرضة ل 60كو γ الأشعة. أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية التي تمثل التباين بين الجهات المانحة. وتمثل البيانات متوسط عدد بؤر γ-H2AX ± الانحراف المعياري لأربعة متطوعين أصحاء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig09large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃŽÂ³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes at JoVE.com

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

يقدم هذا البروتوكول إعداد الشريحة والتهديف الآلي للاختبارات البؤرية γ-H2AX على الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي. لتوضيح طريقة وحساسية المقايسة ، تم تشعيع الخلايا اللمفاوية المعزولة في المختبر. هذه الطريقة الآلية للكشف عن الحمض النووي DSB مفيدة لتطبيقات قياس الجرعات البيولوجية سريعة وعالية الإنتاجية.

طريقة تسجيل مجهرية آلية لإجراء فحص foci γ-H2AX في الخلايا الليمفاوية الطرفية للدم البشري

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

اسمي الدكتور شانكاري ناير، وأنا زميل ما بعد الدكتوراه في قسم الفيزياء الحيوية الإشعاعية في قسم الطب النووي في NRF، iThemba LABS. في هذا الفيديو، سوف نظهر استخدام فحص بؤر غاما H2AX الآلي على الخلايا الليمفاوية الطرفية في الدم البشري لاستخدامه في تطبيقات التماثل الدفعي. يتم التحكم في مخاطر الإشعاع على الموظفين بشكل صارم.الإشعاع المؤين يؤثر بشكل مباشر على بنية الحمض النووي عن طريق تحفيز فواصل الحمض النووي. فواصل مزدوجة حبلا خاصة. واحدة من أقدم الخطوات في عملية التعرف على كسر الحمض النووي المزدوج حبلا هو phospohorilization البديل الهستون، H2AX، وتوظيف البروتينات إصلاح.سيحدد هذا الفيديو استخدام المجهر لتسجيل عدد نواة جاما-H2AX foci ren-nucleus باستخدام نظام مسح الشرائح الآلي ومنصة التحليل، ودمج المجهر الفلوري. يتم عزل الخلايا الليمفاوية من الدم كله. تمييع الدم كله مع برنامج تلفزيوني في نسبة واحد إلى واحد، ثم وضع الدم المخفف بلطف على حجم واحد من متوسط الانحدار الكثافة.طبقة الدم تدريجيا عن طريق عقد أنبوب مائلة في 45 درجة. نقل التعليق إلى جهاز طرد مركزي وتدور في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في 900 G.After المركزية أربع طبقات سوف تشكل. نقل بعناية طبقة غائمة تحتوي على الخلايا الليمفاوية في أنبوب مخروطي عقيم جديد.غسل الخلايا الليمفاوية مع برنامج تلفزيوني والعد باستخدام مقياس الدم. بمجرد تحديد العدد الإجمالي للخلايا الليمفاوية ، قم بتمييع الخلايا الليمفاوية والتعليق إلى تركيز حوالي 800،000 خلية لمفاوية في ملليلتر واحد من RPMI الكامل. العينات وجاهزة للإشعاع لدينا.يتم تشعيع الخلايا الليمفاوية بأشعة غاما من مصدر الكوبالت 60 ، وبعد ذلك يتم احتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطبة بنسبة 5٪. لكل حالة تشعيع أو أنبوب، يتم إعداد ثلاث شرائح. ضع الشريحة في حامل القصاصة، متبوعة ببطاقة التصفية، وأخيرا القمع.مقاطع الشرائح الآمنة ومكان في جهاز الطرد المركزي الخلوي. أضف 250 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل قمع وتدور لمدة 30 G لمدة خمس دقائق. استخدام الطرد المركزي الخلوي ضروري للحصول على شروط موحدة على أتمتة الشرائح.نسج مرة واحدة، وإزالة الشرائح من مقطع ومن ثم استخدام القلم الكاره للماء، رسم دائرة حول المكان الذي توجد فيه الخلايا. الآن بعد أن تم إجراء الشرائح ، تحتاج الخلايا إلى إصلاحها على الشريحة بحيث يمكن أن يحدث تلطيخ المناعة. يتم إصلاح الخلايا باستخدام 3٪ بارافورمالديهايد، أو PFA، وحل برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.بعد تثبيت غسل الشرائح في جرة كوبلين مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق. ثم، تغطية الخلايا مع تريتون X للسماح permeabilization. خطوة permeabilization يزيل المزيد من الدهون الغشاء الخلوي للسماح للأجسام المضادة للحصول على داخل نواة الخلية.من هنا فصاعدا، نستخدم حل حظر مصنوع من 1٪ BSA في PBS، لغسل الشرائح من أجل تقليل الربط غير المحدد المحتمل. بعد ثلاث خطوات غسل من 10 دقائق مع 1٪ BSA و PBS، يتم احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة مع واحد إلى 500 الأجسام المضادة الأولية المضادة غاما H2AX لمدة ساعة واحدة في غرفة الترطيب، وإنجازها بسهولة عن طريق إضافة ورق الأنسجة الرطبة في قاعدة مربع تخزين الشرائح مستطيلة. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، قم ببقشيش السائل واغسل الشرائح مرة أخرى في محلول 1٪ BSA.احتضان الشرائح مع واحد إلى ألف المخفف حمار الثانوية المضادة للفأرة TRITC الأجسام المضادة لمدة ساعة واحدة في غرفة الترطيب. إزالة الأجسام المضادة قبل إجراء ثلاث أو 10 دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني. قم بتغطية جرة كوبلين في رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء طوال مدة خطوات الغسيل.إزالة الشرائح ومسح برنامج تلفزيوني الزائدة خارج دائرة الكاره للماء مع ورقة الأنسجة الخالية من الغبار. وأخيرا، إضافة قطرات واحدة إلى قطرتين من DAPI أدى إلى الإذعان تصاعد المتوسطة وتغطية الشرائح بلطف مع زلة الغطاء. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين ومن ثم تخزين العينات في مكان مظلم في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.امسح الشرائح برفق باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪، وضع الشرائح على منصة المسح الآلي، أو مرحلة الشريحة، المرفقة بصور المحور zite ZED-2 المجهر. حدد إعداد التصنيف ضمن علامة التبويب MetaCyte لتحرير المصنف. سيتم استخدام المصنف المحدد من قبل النظام لمسح وتسجيل الشرائح ، ويستند إلى مجموعة من المعلمات المحددة مسبقا ، والتي ستحدد كيفية اختيار النظام للخلايا وعشرات بؤر.يمكن تحسين المصنف وتدريبه استنادا إلى عدد من حقول الصور المصنفة مسبقا. اعتمادا على تكبير المجهر ، ونوع والأجسام المضادة التي تستخدم لتلطيخ ، يمكن تحسين مصنف مختلف. لذلك تختلف المصنفات بشكل عام من مختبر إلى آخر ، لكننا سنعطي لمحة عامة عن الخطوات الأساسية التي يتم اتخاذها للنظر في وقت يجب تعديل إعداد المصنف.ضمن Capture'tab، يمكن للمرء أن يجد عامل التصفية الذي سيتم استخدامه، هنا DAPI وTRITC، مع أقصى وقت للتكامل من 1.04 ثانية. ويستند هذا الأخير على المصنف الأصلي الذي تم توفيره من قبل الشركة وتعديله في وقت لاحق لكثافة الأجسام المضادة والخلفية غاما H2AX، أو إشارة TRITC، في هذا النوع من الخلايا المحددة، وهي الخلايا الليمفاوية. تحت علامة التبويب التعرض، يتم تعريف الحد الأدنى لوقت التكامل.سيبقى المصنف دائما ضمن الحد الأدنى والحد الأقصى لوقت التكامل، مما يمنع التعرض الزائد أو الناقص للشريحة. ضمن Selection'tab الخلية، تم تعريف مناطق الكائن الحد الأدنى والحد الأقصى استنادا إلى حجم وشكل الخلايا التي يتم تحليلها. على سبيل المثال، قيمة التقعر المحددة مسبقا ونسبة العرض إلى الارتفاع محددة للخلايا الليمفاوية، والتي تحتوي بشكل عام على أشكال مستديرة.ضمن علامة التبويب ميزات، يمكنك تغيير العرض وعرض المدرج التكراري، بالإضافة إلى تحديد ما يحتاجه المجهر للتسجيل. يمكن للنظام تسجيل العديد من العناصر ، اعتمادا على الميزات التي حددها المستخدم. مثال على ذلك هو عتبة كيفية تسجيل البرنامج للكائنات الفردية.بمجرد التعرف على مصنف مناسب، حدد الإعداد في الشريط الجانبي وأعط كل شريحة اسما فريدا، متبوعا بتحديد المصنف المناسب. حدد الحد الأقصى لعدد الخلايا'، ثم أضف الحد الأقصى لعدد الخلايا المطلوب فحصها. يتم إنهاء البحث حتى إذا لم يتم مسح إطار البحث المحدد بالكامل بعد، بمجرد الوصول إلى الحد الأقصى لعدد الخلايا.بالنسبة لتطبيقات التماثل البيولوجي، فإن التسجيل الآلي ل 1000 خلية لكل شريحة يكفي، بالنظر إلى أنه يتم إعداد ثلاث شرائح لكل عينة دم. انقر فوق موافق'لتأكيد الإعدادات. لمسح الشرائح ضوئيا، حدد بحث'في الشريط الجانبي.إذا تم تحديد الإعداد "إطار البحث اليدوي" في إعداد الشريحة، فسيفتح مربع حوار خطا لتحديد منطقة المسح الضوئي. باستخدام هدف 10 مرات يتم تحديد منطقة البحث مستطيلة على الشريحة بشكل تفاعلي عن طريق تحديد ركنين من حقل البحث بواسطة النقرة اليسرى من الماوس. يمكن تأكيد ذلك باستخدام الزر موافق.ضبط موضع بدء التركيز. سيقوم البرنامج بمطالبة التركيز ومركز نواة مرجعية باستخدام هدف 40 مرة لكل شريحة وتأكيد الإعدادات مع موافق. سينتقل النظام تلقائيا إلى جميع الجوانب بشكل تسلسلي. إذا لزم الأمر، ضبط إعداد صورة مباشرة'و"وقت التكامل" لهذه الخطوة.تحقق من جميع إعدادات المجهر. تأكد من أن رافعة أنبوب المجهر في وضع يحول كل الضوء إلى الكاميرا ويؤكد مطالبة النظام مع موافق. يبدأ النظام التركيز التلقائي للشبكة في موضع الشبكة الأقرب إلى الحقل المرجعي. هو يستمر أن يركز مجال على الشبكة نظامية, يتحرك في متعرج نحو الجبهة وخلف من البحث نافذة.يبدأ المسح الضوئي عند اكتمال التركيز التلقائي للشبكة. يتم نقل المرحلة في حقل نمط تعرج بعد حقل لالتقاط البيانات. عندما يتم الكشف عن خلية، يتم وضعها ويتم تخزين صورة المعرض وعرضها في الشاشة ويتم تحديث عدد الخلايا.يتم إنهاء البحث إذا تم مسح البحث بأكمله ضوئيا، أو إذا تم الوصول إلى الحد الأقصى لعدد الخلايا، أو إذا تم إلغاء البحث. عند اكتمال الفحص، انقر بزر الماوس الأيمن على الشريط الموجود في الأسفل وافتح عينة. مراجعة المعرض، الذي يتكون من صور صغيرة للخلايا المكتشفة.في هذه النافذة يمكنك تحديد الخلايا المخزنة في المعرض عن طريق المعيار ليتم اختيارها من القائمة المنسدلة. يتم عرض الخلايا بشكل عام بالترتيب الذي تم الكشف عنها. انقر على الرسم البياني جودة 'أو ميزة قيمة Diagram'لإعطاء توزيع الخلايا المكتشفة، فضلا عن وسائل، والانحراف المعياري لل البؤر سجل.هنا نقارن بين العينات الرمادية صفر مقابل 1.5. هذه عادة شريحة تحكم، بقيمة متوسطة تبلغ 0.124 بؤرة لكل خلية، حيث لم يتم تشعيع الخلية. وفي سياق عدم التماثل البيولوجي، يشير ذلك إلى أن الشخص لم يتعرض لجرعة عالية من الإشعاع.في الرسم البياني، يمكننا أن نرى أن غالبية الخلايا لديها تقريبا صفر بؤر لكل خلية، وليس هناك جانب من التوزيع الطبيعي. عندما نقارن هذا بجرعة من 1.5 رمادي، يمكن أن نرى بوضوح أن هذه عينة مشععة. وفي سياق التماثل البيولوجي، يشكل هذا التوزيع الطبيعي علامة واضحة على أن العينة قد تعرضت للإشعاع.المسح الآلي حساس بما يكفي للكشف عن البؤر الناجمة عن جرعات منخفضة. تظهر النتائج زيادة خطية واضحة لعدد البؤر لكل خلية مع الجرعة. الطريقة الآلية للكشف عن كسر حبلا مزدوجة الحمض النووي مفيدة لتطبيقات عسر التماثل البيولوجي سريع وعالي الإنتاجية.شكرا لك على المشاهدة

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

داخل الحرقفي حقن الشريان للنمذجة فعالة وانتقائية مجهرية العظام الانبثاث

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

نموذج الفأر من التعب المستحث بواسطة الطرفية تشعيع

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Osteosarcoma متلازمة لي-Fraumeni الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث المستمدة من المريض باستخدام النمذجة

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

نموذج الأوناوجراف ة الدم المحيطي البشري (PBMC) غير المشروع لأبحاث الأورام المناعية المترجمة (I-O)

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

الآلي التفاضلية النووية التفضيل الملطخة اختبار لتحديد دقيق للسمية الخلوية الميتوك

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في عينات بلازما الدم من مرضى السرطان

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...