Name: an automated microscopic scoring method for the &#947;-h2ax foci assay in human peripheral blood lymphocytes
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃŽÂ³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes at JoVE.com

המחברים רוצים להודות למשתתפי המחקר על תרומות הדם שלהם, כמו גם האחות V. פרינס לאיסוף דגימות דם. הסיוע הכספי של קרן המחקר הלאומית של דרום אפריקה (NRF) למחקר זה מוכר בזאת. דעות שהובעו, והמסקנות הגיעו, הן של המחברים ולא בהכרח להיות מיוחסות ל- NRF. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית (סבא"א), באמצעות פרויקט שיתוף פעולה טכני (מספר: URU6042) לתמיכה ב- W. Martínez-López, כמו גם בפרויקט המחקר המתואם E35010 (מספר חוזה: 22248).

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה למחקר ביו-רפואי של ועדת האתיקה של אוניברסיטת מערב קייפ - קוד BM18/6/12.
1. הכנת פתרונות48
<ol><li>פתרון קיבוע תאים (3% PFA ב- PBS)<ol>
<li>ללבוש את ציוד המגן האישי המתאים (PPE) ולעבוד במכסה אדים, להוסיף 20 גרם של paraformaldehyde ל 200 מ"ל של Hמזוקק 2O. לחמם את התערובת ל 60 °C כדי לסייע פירוק.</li>
		<li>לאחר PFA מומס, להוסיף 40 טיפות של 5 N NaOH בזהירות מעל 30 דקות כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. הסתגלו ל- pH 7 באמצעות 1 M HCl והשלימו עד לנפח סופי של 250 מ"ל עם H2O מזוקק (aliquots ניתן לאחסן ב -20 °C (20 °C) למשך שנה אחת). הוסף 25 מ"ל מפתרון זה ל- PBS של 41.7 מ"ל כדי להרשות לעצמו פתרון PFA של 3%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1% פתרון אלבומין סרום בקר (BSA): הוסף 10 גרם של BSA ל 1000 מ"ל של PBS ומערבבים עד להמסה. יש לאחסן ב-4 °C (72 שעות לכל היותר).</li>
	<li>פתרון Triton-X בריכוז של 1:500: הוסף 1 μL של Triton-X ל 500 μL של PBS, לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד לשימוש (מקסימום 24 שעות).</li>
	<li>פתרונות נוגדנים<ol>
<li>נוגדן ראשי - אנטי-γ-H2AX בריכוז של 1:500: הוסף 1 μL של אנטי-γ-H2AX ל 500 μL של פתרון 1% BSA, לאחסן ב 4 °C (24 שעות לכל היותר).</li>
		<li>נוגדן משני - DAM-TRITC בריכוז של 1:1000: הוסף 1 μL של DAM-TRITC ל 1000 μL של פתרון 1% BSA, לאחסן ב 4 °C (4 °C) עד לשימוש (מקסימום 24 שעות).</li>
	</ol>
</li>
	<li>שלמה רוזוול פארק מכון הזיכרון (cRPMI) מדיה<ol>
<li>הוסף סרום בקר עוברי מסונן (FBS) ופניצילין-סטרפטומיצין למדיה RPMI 1640 בבקבוק סטרילי כדי לתת ריכוז סופי של 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת דוגמאות
הערה: עבור פרוטוקול זה, דגימות דם שלמות היקפיות נאספות על ידי venipuncture בצינורות איסוף ליתיום-הפרין ממתנדבים בוגרים בריאים (בהסכמה מדעת - BM18/6/12 ועדת האתיקה של המחקר הביו-רפואי של ועדת האתיקה של אוניברסיטת מערב הכף). לפני תחילת, ודא כי הדם ואת מדיום הצפיפות של 1.077 גרם / מ"ל התאקלמו לטמפרטורת החדר.
<ol><li>בארון בטיחות ביולוגי מוכן, לדלל את הדם כולו ההיקפי בנפח 1:1 עם PBS בעדינות שכבה הדם המדולל על נפח שווה לשני כרכים של בינוני עם צפיפות של 1.077 גרם / מ"ל. חשוב בהדרגה שכבה את הדם על מדיום הצפיפות על ידי החזקת הצינור מנוקד ב 45 °, להבטיח כי הדם ואת הצפיפות בינוני לא לערבב.</li>
	<li>מעבירים בזהירות את ההשעיה לצנטריפוגה ומסתובבים ב-900 x גרם למשך 20 דקות. לאחר מכן, pipette השכבה 'מעונן' רק לצינור חרוטי סטרילי חדש ולמלא את הצינור עם PBS וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 1000 x g. לאחר מכן, לשאוף supernatant עם pipette, להיות זהיר לא להפריע את הכדור, resuspend גלולה PBMC בזהירות 1 מ"ל PBS ולמלא את הצינור עם PBS.</li>
	<li>חזור על שלב הכביסה לעיל פעמיים נוספות כדי להגיע לסך של שלוש כביסות.</li>
	<li>לספור את מספר PBMCs באמצעות hemocytometer, מודע לכך שכל mL של דם היקפי מתורם מבוגר יגרום לממוצע גס של 1 - 1.5 x 106 PBMCs49. לאחר הספירה, לדלל את גלולה PBMC לריכוז של 8 x 105 לימפוציטים ב 1 מ"ל של cRPMI. לאחר מכן הוסיפו כ-2 x 106 מחשבים אישיים או 2.5 מ"ל מפתרון PBMC המבודד לצינור סטרילי וחרוטי להקרנות.</li>
</ol>3. הקרנות לדוגמה
זהירות: לטפל ביחידת הקרינה על פי הנחיות הגנת הקרינה וללבוש dosimeter פיזי בכל עת. ודא כי מערכת ההקרנה בשימוש מכויל ולהגדיר כך המינונים הצפויים הנכונים מושגים.
<ol><li>הקרנת מחשבי PBMCs בטמפרטורת החדר באמצעות מקור 60Co. כיול (פרוטוקול TRS-398) עם תא Farmer 117 שעבורו גורם כיול קאמרית שהתקבל מהמכון הלאומי למטרולוגיה של דרום אפריקה (NMISA)50.<ol>
<li>לבדיקה זו, הנח את הצינורות החרוטיים בין גיליון אקרילי 5 מ"מ (המשמש להצטברות כניסת קרן) לבין חומר גב 50 מ"מ עם קצב המינון הנוכחי של 60Co מקור של 0.57 Gy/ min עבור 300 מ"מ × 300 מ"מ גודל שדה הומוגני 300 מ"מ ב 750 מ"מ מקור למרחק פני השטח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להקרין את ה- PBMCs עם מינונים מדורגים של 0.125, 0.500, 1.000, 1.500 ו 2.000 Gy, ולשמור על דגימות בקרה מוקרן מזויף, בחדר הבקרה, מקבל רק חשיפה לקרינה סביבתית.</li>
	<li>לדגור את הדגימות המוקרן במשך שעה אחת ב 37 °C בחממה לחה 5% CO2 על מנת להגיע למספר המרבי של מוקדי γ-H2AX. הערה: ניתן לשנות את זמן הדגירה בהתאם לתכנון ניסיוני.</li>
</ol>4. הכנת שקופיות
הערה: ראה איור 1 להגדרת שקופית.
<ol><li>הכן 3 שקופיות (חזרות טכניות) באמצעות שקופיות מצופות במשטח טעון חיובית כדי לשפר הידבקות לכל מצב הקרנה (או לכל צינור חרוט). מקם את השקופית לתוך מחזיק הקליפ, הוסף את כרטיס המסנן מעליה ולבסוף את המשפך. אבטחו את קטעי השקופיות והכניסו את הציטוצנטריפוגה.</li>
	<li>הוסף 250 μL של השעיית התא משפך (200,000 תאים / שקופית) ולסובב עבור 30 x g במשך 5 דקות באמצעות cytocentrifuge.</li>
	<li>לאחר cytocentrifugation, להסיר את השקופית מן מחזיק קליפ באמצעות עט הידרופובי, לצייר עיגול סביב הנקודה עם התאים על מנת לשמור על כתם immunofluorescent על התאים הכרוכים במהלך תהליך הכתם.</li>
</ol>5. קיבעון ואימונופלואורסצנטיות γ-H2AX מכתימים
הערה: כל הפתרונות מתווספים בקפידה ישירות לאזור התא המסומן על ידי מעגל הידרופובי. פתרונות כתמים מחולקים מעט מעל השקופית מבלי לאפשר לקצה הפיפטה לשבש את התאים. פתרונות אינם מתווספים לשקופית כולה.
<ol><li>תקן את השקופיות ב- 3% PFA מוכן טרי במשך 20 דקות. הערה: ניתן לאחסן את השקופיות ב- PBS המכילות 0.5% PFA ב- 4 °C למשך יומיים לכל היותר לפני ביצוע החיסונים. לאחר מכן, לשטוף שקופיות בצנצנת קופלין עם PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן לכסות את התאים עם 100 μL של פתרון Triton-X קר במשך 10 דקות כדי לאפשר permeabilization.</li>
	<li>הטפו את תמיסת טריטון-X על נייר טישו ושטפו את השקופיות שלוש פעמים בתמיסת BSA של 1% למשך 10 דקות. פעולה זו נעשית כדי למנוע רקע לא רצוי על ידי חסימת כריכת נוגדנים לא-מדעיים.</li>
	<li>דגירה מחליקה בטמפרטורת החדר עם 100 μL של 1:500-מדולל אנטי-γ-H2AX נוגדן במשך שעה בתא לחות, מושג בקלות על ידי הוספת נייר טישו רטוב בבסיס תיבת אחסון שקופיות מלבנית.<ol>
<li>הטפו את תמיסת הנוגדנים על נייר טישו ובצעו שלוש שטיפות עם תמיסת BSA של 1% למשך 10 דקות בצנצנת קופלין כדי להסיר נוגדן ראשוני לא מאוגד ולמנוע כריכה לא ספציפית של הנוגדן המשני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה שקופיות עם 100 μL של 1:1000-מדולל DAM-TRITC פתרון נוגדן במשך שעה אחת בתא לחות. הטפו את תמיסה נוגדן על נייר טישו לשטוף את השקופיות PBS במשך 10 דקות שלוש פעמים.</li>
	<li>לבסוף לייבש את השקופיות מחוץ למעגל הידרופובי עם נייר טישו רך, ללא אבק ולהוסיף 1-2 טיפות של DAPI נפתר במדיום הרכבה מימית בעדינות לכסות את השקופית עם 24 x 50 מ"מ כיסוי להחליק, להבטיח כי אין בועות אוויר לכודים ומניחים במקרר ב 4 °C (5 °F) לילה. ניתן לאחסן שקופיות במהירות של 4 °C (70°F) למשך שבועיים לכל היותר לפני הסריקה.</li>
</ol>6. סריקה וניקוד אוטומטיים של שקופיות
הערה: מערכת הסריקה צריכה להיות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה (התקן מצמיד טעון) המחוברת לתפיסת מסגרת לדיגיטציה בזמן אמת של תמונות וידאו, שלב סריקה, כדור עקיבה לתנועות ידניות, עכבר תלת-ממד, מחשב מהיר וצג וכונן קשיח לאחסון בארכיון (איור 2).
<ol><li>כיוונון מסווג הערה: המסווג הוא קבוצה של פרמטרים המגדירים כיצד המערכת מזהה תאים. התוצאה היא ההכשרה המבוססת על שדות תמונה מסווגים מראש. מסווג הוא ספציפי עבור הגדלה מיקרוסקופ, סוג תא, ומעבדה. לכן מסווגים עשויים לדרוש שינויים בפרמטרים הבאים כדי להתאים אותם לתנאים הנוכחיים. מומלץ לבדוק את ההגדרות באמצעות שקופית הפניה לפני ההערכה.<ol>
<li>רכישת תמונה: השתמש במטרה יבשה פי 40 להדמיה. כדי להשיג איכות תמונה דומה בכל התאים, הגדר את זמן שילוב המצלמה למצב אוטומטי. הגדר את זמן האינטגרציה המרבי לשניה אחת לפחות עבור שני ערוצי הצבע (מצלמה להשיג 4.0). ערוץ האות נרכש עם 10 מטוסי מיקוד ו 14/40 מיקרומטר בין המטוסים.</li>
		<li>בחירת תאים: מחשבי PBMCs בטווח של 20.00 מיקרומטר2 ו 76.00 מיקרומטר2 מזוהים. הגדר את עומק הקשוב המרבי ל- 0.05 ואת יחס הגובה-רוחב המרבי ל- 1.4. הגדר את סף הרמה האפורה היחסית ל- 20%.</li>
		<li>עיבוד תאים: עבד את ערוץ הנגד DAPI באמצעות אלגוריתם מרבי של היסטוגרמה כדי להפחית את הרקע. ערוץ האות מעובד עם מסנן TopHat (חוזק 7, גורם החלקה 0) כדי להפחית את הרקע ולשפר את האותות.</li>
		<li>ספירת אותות: ספירת מוקדים באמצעות התכונה 'ספירת אובייקטים' של ההתקן. כדי להימנע מהערכה שגויה-חיובית של אותות הרקע הנותרים, רק האותות המראים לפחות 30% מהעוצמה בהשוואה לאובייקט הבהיר ביותר בתא נספרים.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנס/הנח שקופיות על משטח הסריקה האוטומטי או שלב השקופית, לאחר ניקוי עדין עם 70% אתנול, כדי להסיר אבק.</li>
	<li>הגדרת שקופית - פתיחת תפריט דו-שיח של הגדרת שקופית (איור 3)<ol>
<li>בחר את נתיב הנתוניםהנכון , פעולה זו מציינת היכן מאוחסנים קבצי השקופיות הנובעים מהחיפוש.</li>
		<li>תן לשקופית שם, יש לתת לכל שקופית שם ייחודי. אם סדרת שקופיות מוזנת בצורה של רשימה ממוספרת, ניתן להשתמש ב- '?' כתווים כלליים עבור מספר השקופית.</li>
		<li>בחר את המסווג המתאים, כמתואר בסעיף 1.1 - 1.4 (איור 4).</li>
		<li>בחר את חלון החיפוש ובחר מוגדר מראש אם קיימת הגדרת חלון חיפוש התואמת לעיגול התאים cytocentrifuge, בחר את ההגדרה המתאימה בעמודה גודל או בחר ידני אם אין הגדרת חלון חיפוש מוגדרת מראש זמינה. במקרה זה, אין להגדיר את העמודה גודל.</li>
		<li>בחר מספר תאים מרבי והוסף את המספר המרבי של תאים הדרושים לסריקה. החיפוש מסתיים גם אם חלון החיפוש שנבחר טרם נסרק לחלוטין ברגע שהגעת לספירת התאים המרבית. עבור יישומי ביו-דאודומטריה, די ניקוד אוטומטי של 1,000 תאים לשקופית, בהתחשב בכך ש-3 שקופיות לכל דגימת דם מוכנות. לחץ על אישור כדי לאשר את ההגדרות.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדרת סריקת שקופיות<ol>
<li>לחץ על לחצן חיפוש בסרגל הצדדי. אם ההגדרה חלון חיפוש ידני נבחרה בהגדרת שקופית, ייפתח דו-שיח המאפשר קביעת אזור הסריקה (איור 5). באמצעות המטרה 10x, בחר את אזור החיפוש המלבני בשקופית באופן אינטראקטיבי על-ידי תיקון שתי פינות בשדה החיפוש בלחיצה שמאלית של העכבר. ניתן לאשר זאת באמצעות לחצן אישור. אם חלון החיפוש מפנה לחלון חיפוש מוגדר מראש, שלב זה יושמט.</li>
		<li>המשתמש מתבקש להתאים מיקום התחלה של המוקד. לאחר מכן ייבחר אובייקט הפניה באופן אוטומטי, התוכנה תבקש מהמשתמש להתמקד ולמרכז גרעין הפניה (באמצעות המטרה 40x) עבור כל שקופית ולאשר הגדרות עם אישור. המערכת תעבור באופן אוטומטי לכל השקופיות ברצף. במידת הצורך, התאם את הגדרת התמונה החיה - זמן האינטגרציה עבור שלב זה (איור 5).</li>
		<li>בדוק את כל הגדרות המיקרוסקופ ואשר את בקשת המערכת עם אישור. המערכת תתחיל את הליך המיקוד והסריקה האוטומטי. לאחר השלמת הסריקה, הנתונים נשמרים במחשב לצורך ניתוחים. מערכת הסריקה נכבית באופן אוטומטי לאחר השלמת הסריקה. הערה: ודא כי הידית של צינור המיקרוסקופ נמצאת במצב המסיט את כל האור למצלמה.</li>
		<li>חיפוש סוף, החיפוש מסתיים אם החיפוש כולו נסרק, אם ספירת התאים המרבית הגיעה או אם החיפוש בוטל.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח שקופיות הערה: הסריקה שהושלמה מיוצגת באיור 6.<ol>
<li>לאחר השלמת הסריקה, לחץ על לחצן גלריה בסרגל הצדדי. סקור את הגלריה, המורכבת מתמונות קטנות של תאים שזוהו. בחלון זה (איור 7), ציין אם התאים המאוחסנים בגלריה לפי קריטריון שייבחרו מתפריט נפתח. תאים מוצגים בדרך כלל בסדר שבו הם זוהו.</li>
		<li>לחץ על דיאגרמת ערך היסטוגרמה/תכונה איכותית (איור 8) כדי לתת את התפלגות מדד האיכות עבור התאים שזוהו, כמו גם את האמצעים, ואת סטיית התקן של המוקדים.</li>
	</ol></li>
</ol>

ג. שנק הוא עובד של MetaSystems קשה & תוכנה GmbH, Altlussheim, גרמניה.

פרוטוקול זה מתאר הליך צעד עבור הניקוד האוטומטי מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של γ-H2AX foci assay. זה ממחיש את התועלת של בדיקת המוקד כשיטה יעילה בזמן לניתוח מספר ה- DNA DSB המושרה בקרינה בלימפוציטים דם היקפיים כדי לבצע הערכת מינון ביולוגי בתרחיש של תאונת קרינה שבו אנשים עלולים להיחשף לרמות לא ידועות של IR.
בפרוטוקול ספציפי זה, מחשבים אישיים היו מוקרן במבחנה כדי לחקות חשיפה לקרינה in vivo. לאחר ההקרנה וזמן הדגירה של שעה אחת הושלמו, שקופיות נעשות באמצעות cytocentrifuge כדי ליצור נקודת ריכוז של תאים על השקופית. השימוש בציטוצנטריפוגה חיוני להשגת תנאים סטנדרטיים לניקוד אוטומטי. כאשר הושלם, עט הידרופובי משמש כדי להפוך את המעגל סביב התאים, כדי להפחית בזבוז של ריאגנטים על ידי מתן אפשרות למשתמש למקם את ריאגנטים מכתימים. סוג זה של עט יכול לשמש בטכניקות חיסוניות שונות כגון על מקטעי פרפין, קטעים קפואים ותכשירים ציטולוגיים. יתר על כן, חשוב לבחור עט הידרופובי התואם למערכות זיהוי מבוססות אנזימים ופלואורסצנטיות. לאחר הכנת שקופית, הקיבעון וההכתמה האימונופלואורסצנטית γ-H2AX התרחשו. בפרוטוקול זה, התאים קבועים באמצעות 3% PFA בפתרון PBS במשך 20 דקות. כדי שהחיסון יצליח, חיוני שהמורפולוגיה של התאים תישמר ושהאתרים האנטיגניים נגישים לריאגנטים לזיהוי הנמצאים בשימוש. PFA הוא סוכן עדין יחסית עבור קיבעון ומייצב תאים תוך שמירה על מבני חלבון51. ניסויי אופטימיזציה עם ריכוזי PFA גבוהים יותר ותקופת קיבעון ארוכה יותר הביאו להשפעה שלילית על איכות השקופית, אך אחסון נוסף (בן לילה) ב- 0.5% PFA עד 24 שעות הניב תוצאות טובות.
הנוגדן העיקרי, 2F3 חד שבטי המשמש בפרוטוקול זה מגיב לגרסת Histone H2AX כאשר זרחן בסרי 139 לאחר אינדוקציה DSB DNA. הנוגדן מסוגל להיקשר לשאריות הזרחן ללא תגובתיות צולבת עם היסטונים זרחניים אחרים52. מכיוון שמדובר בנוגדן חד שבטי ראשוני של העכבר, נבחר נוגדן משני נגד המינים המארחים של הנוגדן העיקרי תוך גידול במארח חלופי, כלומר חמור-נגד עכבר (DAM)-TRITC. בעוד כתמים אימונופלואורסצנטיים מבוססים על כריכת נוגדנים-אפיטופ ספציפית, מספר כוחות בין-מולקולריים יכולים גם לגרום להכתמת רקע לא ספציפית. על מנת להפחית כריכה לא ספציפית, חשוב להשתמש ריאגנט חסימה בפרוטוקולי כתמים immunofluorescent53; השתמשנו בפתרון BSA. יתר על כן, יש להקצות מספיק זמן לשלב חסימה זה על ידי השארת השקופיות בפתרון לפחות 20 דקות לפני כתמי נוגדנים ראשוניים ומשניים. בנוסף, פתרון BSA צריך לשמש גם כדילול עבור הנוגדנים העיקריים והמשניים. בהתאם אנטי-γ-H2AX ונוגדן משני המשמש להכתמה, יש לשקול בדיקת דילול נוגדנים שונים על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי. לניקוד מדויק יותר, ניתן לבצע כתמים כפולים, על ידי הוספת נוגדני חלבון נוספים לתיקון DNA DSB.
חיסרון מרכזי של סוג זה של ניתוח הוא הצורך לרכוש דגימות דם בהקדם האפשרי לאחר החשיפה, כמו המספר המרבי של מוקדים ידוע לרדת בחזרה לרמות נורמליות בתוך 48 שעות לאחר הקרנה. לכן, כאשר זמן תאונת הקרינה ודגמת הדם הבאה ידוע, זה יכול להיות שימושי לעבוד עם עקומות כיול שונות שנקבעו בנקודות זמן שונות לאחר הקרנה במבחנה (למשל, 4, 8, 12 ו 24 שעות). עם זאת, כפי שכבר צוין בסעיף המבוא של כתב היד, כוחו של γ-H2AX מוקדי assci טמון במטרות מיון ראשוניות ומהירות ויש להשתמש בו כדי לתעדף יותר זמן דוסומטריה ביולוגית ציטוגנטית. תרחיש משולב שבו משתמשים בסמנים ביולוגיים מרובים במקביל, ייצור את הערכת המינון האמינה ביותר ומעבדות ביו-דאודומטריה שונות ברחבי העולם איחדו כוחות כדי להקים רשתות ארציות שניתן להפעיל ולהשתמש בהן כדי לאפשר הערכות ביו-דומימטריות מקבילות מרובות על ידי מעבדות עם מומחיות שונה37,54,55 . בנוסף, נמשכות התפתחויות לניתוח מהיר במיוחד כגון מעבדה ניידת באתר התאונה56או בסמוך לו . שיטות ביו-מדידת ביולוגיות חדשות ומבטיחות מפותחות כל הזמן, מה שבתקווה יביא לתפוקה מהירה ואמינה עוד יותר בעתיד57.
עבור מערכת ניתוח התמונה האוטומטית, שקופיות מוכנסות או ממוקמות על פלטפורמת הסריקה האוטומטית או על שלב השקופית. לאחר מכן, תן שם ושמור את פרטי השקופית בתיקיה המתאימה במחשב המצורף. עבור ניסוי זה, גרעינים אוטומטיים וזיהוי מוקדים מבוססים על הגדרות המסווג המתאימות. ביצירת מסווג, ודא שהגדרות המסווג שנבחרו תואמות לסוג התא הנוכחי, לתנאי ההכנה ולהכתמת ה- immunofluorescent של המדגם. ערוצי פלורסנט מתאימים התואמים את ספקטרום העירור של הנוגדנים העיקריים והמשניים מוגדרים במסווג. המסווג מאפשר לקבוע פרמטרי ניקוד נוספים במידת הצורך (לדוגמה, גודל גרעין, עוצמת פלואורסצנטית, כמתואר בסעיף 6.1). אם שני חלבונים או יותר לתיקון דנ"א (למשל, γ-H2AX ו-53BP1) משולבים בניסוי, המערכת מסוגלת גם לזהות לוקליזציה משותפת של אותות. ראשית, המערכת רוכשת תמונות DAPI, מחילה עיבוד תמונה ומזהה גרעינים באמצעות קריטריונים מורפולוגיים המוגדרים במ המסווג. אותות TRITC נרכשים באמצעות 10 z-ערימות עם גודל צעד של 0.35 מ"מ בין מישורי המוקד47. המסווג השתמש בספירת המוקדים הישירים, שם ציון מספר האותות המובהקים של TRITC בתוך הגרעין. כאן, חשוב לקחת בחשבון כי עם הגדלת מינון הקרינה, אותות מוקד נוטים להתמזג לתוך אובייקטים גדולים יותר, וכתוצאה מכך לזלזל במספר המוקדים בפועל אם אובייקטים נספרים ישירות. זה לא נדרש לניתוח המתואר כאן, אבל צעד נוסף עם ספירת מוקדים מתוקן ניתן ליישם כדי לפתור בעיה זו. זה האחרון מאפשר למערכת להשיג את הגדלים של האותות שזוהו ושוקל אותם בהתאם. באמצעות שתי שיטות הספירה יכול לספק הערכה מציאותית יותר של מספר המוקדים בפועל במינונים גבוהים יותר.
כדי להתחיל בסריקה אוטומטית, אזור הסריקה נקבע על-ידי שימוש במטרה 10x של המיקרוסקופ כדי ליצור אזור חיפוש מלבני על-ידי תיקון שתי פינות בשדה החיפוש בלחיצה שמאלית של העכבר (איור 5), ואחריו מיקוד מיקום ההתחלה. אובייקט ההפניה נבחר באופן אוטומטי, והתוכנה מבקשת מהמשתמש להתמקד ולמרכז גרעין הפניה (באמצעות המטרה 40x) עבור כל שקופית. לאחר תחילת החיפוש, המערכת תעבור למרכז חלון החיפוש של השקופית הראשונה שנבחרה ותבקש למרכז ולמקד את אובייקט ההפניה. אובייקט זה ישמש מאוחר יותר כהפניית מיקום לתיקון כל תזוזה במיקומים של התא. המטרה השנייה של שדה הייחוס היא כוונון האור האוטומטי, במצב אור משודר האור מותאם עד לרמת האור האופטימלית. במצב פלואורסצנטיות רמת האור קבועה, אך ניתן להגדיל את זמן האינטגרציה של מצלמת ה- CCD עד לאות הנדרש. כדי לאפשר התאמת אור נכונה, ההפניה צריכה להכיל אובייקטים עם כתמים אופייניים. חשוב לא להשתמש בשדה שיש בו חפצים בעוצמה גבוהה מאוד של כתמים. לאחר התאמת האור, המערכת מפעילה את הפוקוס האוטומטי של הרשת במיקום הרשת הקרוב ביותר לשדה הייחוס. הוא ממשיך למקד שדות ברשת רגילה, נע בהתפתלות לכיוון החזית והחלק האחורי של חלון החיפוש. הסריקה מתחילה עם השלמת מיקוד אוטומטי של הרשת. השלב מועבר בשדה תבנית מתפתל אחרי שדה כדי ללכוד נתונים. כאשר מזוהה תא, מיקומו ותמונת הגלריה שלו מאוחסנים ומוצגים על המסך וספירת התאים מתעדכנת. אם מתרחשת שגיאת מיקרוסקופ, שלב או מאכיל, החיפוש מבוטל באופן אוטומטי. השלב היחיד שבו יש התערבות ידנית של האופרטור, הוא במהלך הגדרת סריקת השקופיות. זו גם הנקודה שבה מתבצעת בדיקת בקרת איכות מהירה (בועות אוויר, מספרי תאים נמוכים, דהייה של חפצי הכתמת האות הפלואורסצנטיים) ושם ניתן להחליט לבטל את הסריקה של שקופית באיכות נחותה. חיפוש מסתיים אם השקופית כולה נסרקה, אם הגיעה ספירת התאים המרבית או אם החיפוש בוטל. לאחר השלמת הסריקה, הנתונים מוצגים כפי שניתן לראות ב- איור 6. כדי להציג תאים סרוקים, חלון הגלריה נפתח וניתן להציג כל תא (איור 7). זוהי נקודה נוספת שבה המפעיל יכול לבצע בקרת איכות על-ידי בדיקת המוקד של תמונות הגלריה ואת המספר הכולל של תאים שהבקיעו. אם תאים רבים מדי אינם ממוקדים או שתאים מעטים מדי זוהו על ידי המערכת כדי לבצע הערכת מינון מציאותית (למשל, 100 תאים במקום 1000 התאים המיועדים), אז יש לקבל את ההחלטה להוציא את השקופית ואת הניקוד האוטומטי מההערכה הסופית. כל הנתונים מסוכמים בהיסטוגרמה (איור 8), יחד עם מידע על ההפצה, האמצעים וסטיית התקן של מוקדי הציון עבור כל תא. היסטוגרמה יכולה לשמש גם כדי לבחור ולהציג אוכלוסיות משנה של גרעינים בהתבסס על הממצאים האוטומטיים לסקירה. ניתוחים סטטיסטיים על התוצאות מבוצעים לאחר ההתפלגות, ממוצע, ואת סטיית התקן של המוקד מספר לתא נרשמו באופן ידני. הגרף יכול לשמש כעקומת כיול לביצוע הערכת מינון של דגימת ביו-דאודומטריה. זה יכול להיעשות באמצעות המשוואה של קו המגמה כדי לבצע הערכה משוערת של המינון שהתקבל. כמו איור 9 ממחיש כי הסריקה האוטומטית רגישה מספיק כדי לזהות מוקדים המושרים במינונים נמוכים. יתר על כן, התוצאות מראות עלייה ליניארית ברורה של מספר המוקדים לתא עם מינון. יש לציין כי התוצאות מייצגות רק עבור המסווג המשמש, התוצאות יהיו שונות עבור פרמטרים מסווגים שונים. לכן, במקרה של ניתוח ביו-דאודומטריה, חשוב כי אותו מסווג והכנת שקופית ישמשו עבור דגימות biodosimetry כמו אלה ששימשו כדי להקים את עקומת הכיול המשמש לביצוע הערכת המינון. אמנם זה היה מחוץ לטווח של מחקר זה, חשוב לציין כי γ-H2AX foci assay יכול לשמש גם כדי לקבוע קרינות גוף חלקיות. רוב החשיפות לקרינה בשוגג הן חשיפות גוף לא הומוגניות או חלקיות, כאשר רק אזור מקומי בגוף קיבל חשיפה במינון גבוה. מספר מחקרים המחישו כי ניתן להשתמש בבדיקת המוקדים γ-H2AX כדי להעריך את שבר הגוף שהוקרן ואת המינון לשבר המוקרן42. כאשר הקרנה של כל הגוף מתרחשת, תהיה אינדוקציה אקראית של DNA DSB בכל התאים ואפשר לצפות למצוא התפלגות פואסון. בדומה לשיטות ציטוגנטיות שבהן האינדוקציה של סטיות כרומוזומליות נוטה להיות מפוזרת יתר על המידה בלימפוציטים דם היקפיים שבהם יש שפע גבוה של תאים עם סטיות מרובות ותאים עם גרורות רגילות, ניתוח פיזור של מוקדי γ-H2AX באמצעות שיטת פואסון מזוהמת המוצעת על פני התפלגות מוקדים מפוזרת58. האחרון אושר גם ב in vivo ניסויים עם מיניפיגים ומקוק רזוס59.

מאז גילויה, קרינה מייננת (IR) הפכה לכלי הכרחי בפרקטיקות הרפואיות והתעשייתיות הנוכחיות, כמו גם ביישומים חקלאיים וצבאיים. עם זאת, השימוש הנרחב ב- IR גם מגביר את הסיכון לחשיפת יתר של קרינה הן עבור עובדי קרינה מקצועיים והן עבור חברי הציבור. IR הוא מסרטן פיזי ידוע שיכול לגרום נזק לדנ"א באופן ישיר או עקיף, מה שמוביל לסיכונים בריאותיים משמעותיים 1,2. לכן, חשוב לבצע הערכת מינון, שכן מידת החשיפה מהווה צעד ראשוני חשוב בניהול תאונת הקרינה 1.
במקרה של מקרי חירום גרעיניים או רדיולוגיים בקנה מידה גדול, מספר הערכות המינון שצריכות להתבצע יכול לנוע בין כמה לאלפי אנשים בהתאם לגודל התאונה3. בתרחישים אלה, dosimetry פיזי עשוי גם להיות מעורפל (למשל, אם dosimeter אינו משוחק כראוי) או לא זמין, כאשר חברי הציבור מעורבים. בעוד תסמינים קליניים יכולים לשמש מיון, הם לא בהכרח ספציפיים לקרינה ויכולים לגרום לאבחון כוזב. לכן, מומלץ להשתמש dosimetry ביולוגי לצד dosimetry פיזי והערכות קליניות. שיטה זו מאפשרת ניתוח של שינויים הנגרמים מקרינה ברמה התאית ומאפשרת זיהוי חד משמעי של אנשים חשופים הזקוקים לטיפול רפואי4. לאחר מכן הרופא יכול להשתמש בהערכת מינון ביולוגי זו כדי להשלים שחזורי מינון פיזיים ואבחנות קליניות אחרות, על מנת לרשום את הטיפול הרפואי המתאים5. הצורך בדוזימטריה ביולוגית יהיה גבוה במיוחד עבור מיון וניהול רפואי של נפגעים כאשר תרחיש החשיפה אינו ידוע וכאשר הקורבנות הם אנשי ציבור. המטרה העיקרית של מיון היא להבחין ביעילות אנשים "מודאגים היטב", שיכולים להיות סימפטומים פרודרומליים אבל לא קיבלו מינון גבוה, מאנשים חשופים הזקוקים לעזרה רפואית מיידית וטיפול מיוחד. רמת הסף של מינון קרינה שיכולה לגרום למחלת קרינה היא בערך 0.75 - 1.00 Gy. לאחר מכן, אותם אנשים המקבלים > 2 Gy של חשיפה נמצאים בסיכון גבוה יותר לתסמונת קרינה חריפה וצריכים לקבל טיפול רפואי מהיר6,7. הערכות מינון ביולוגיות בזמן ומדויק לקורבנות שנקלעו לאש הצולבת של אסונות כאלה הן קריטיות. בנוסף, זה יכול גם לנחם ולהרגיע קורבנות חשופים מינימלית8.
רשויות הגנת הקרינה משתמשות בסמני ביו-דומימטריה שונים, המבוססים בעיקר על גילוי נזק ציטוגנטי, כגון כרומוזומים דיצנטריים או מיקרונוקלאי, בלימפוציטים אנושיים מתורבתים9. גילוי של נזק ציטוגנטי יכול להתבצע גם על ידי הפלואורסצנטי בהכלאה במקום (FISH) translocation assay10. עם זאת, החיסרון העיקרי של השיטות הציטוגנטיות הקונבנציונליות הוא זמן התפנית הארוך כדי להשיג את התוצאות במצב חירום8.
אחד השלבים המוקדמים ביותר בתהליך זיהוי DSB DNA הוא זרחן של וריאנט histone H2AX, המוביל להיווצרות של γ-H2AX, ואת הגיוס הבא של גורמי תיקון. בעשור האחרון, גילוי של מוקדי γ-H2AX הנגרמים מקרינה בלימפוציטים דם היקפיים באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קיבל תשומת לב גוברת ככלי דוזימטריה ביולוגיאמין 11,12,13,14,15. בהתאם לאיכות הקרינה וסוג התא, התשואה המרבית של מוקדי γ-H2AX מזוהה בתוך 0.5 - 1 שעה לאחר הקרנה16,17. הוא צפוי כי יש קשר הדוק בין מספר DNA DSB ו γ-H2AX מוקדים, כמו גם בין היעלמות של מוקדים ותיקון DSB. ניסויי מספריים בלייזר עם חיידק לייזר פעמו הוכיחו כי מוקדי γ-H2AX לוקליזציה לאתרים של DNA DSB18. למרות שזה נשאר נושא לדיון פעיל, אחד המחקרים המוקדמים ביותר עם 125הצעתי מתאם אחד על אחד בין המספר המחושב של התפוררות לתא (המייצג את מספר ה- DNA DSB המושרה בקרינה) לבין מספר מוקדי γ-H2AX שהשיגציון 19,20.
בעשור האחרון מימן האיחוד האירופי את הפרויקטים MULTIBIODOSE (כלים ביודוסימטריים רב-תחומיים לניהול נפגעים רדיולוגיים בקנה מידה גבוה) ואת RENEB (מימוש הרשת האירופית לביודו-מדביר) ליצירת רשת בת קיימא בדוסימטריה ביולוגית ורטרוספקטיבית21,22. פרויקט זה כלל מעבדות שונות ברחבי אירופה להערכת יכולות המענה לשעת חירום במקרה חירום רדיולוגי14,21,22. γ-H2AX מוקדי assay יש מספר יתרונות ניכרים, כגון זמן עיבוד מהיר, הפוטנציאל לעיבוד אצווה המאפשר תפוקה גבוהה, כמו גם הרגישות הגבוהה שלה אם נעשה שימוש בתוך כמה שעות לאחר החשיפה13,23,24. הרגישות הגבוהה של הבדיקה בטווח המינון הנמוך הביאה למספר מחקרים שבהם נעשה שימוש בבחינת המוקדים γ-H2AX כאינדיקטור להשפעת החשיפה לקרינה רפואית, הן בהקרנות והן ביישומי הדמיה אבחנתית25,26,27,28,29,30. מאפיינים אלה הופכים את מוקדי γ-H2AX לאלטרנטיבה תחרותית ביותר לשיטות אחרות למיון מוקדם בתאונות גרעיניות גדולות כדי להפריד בין אלה שנחשפו באופן קריטי לאנשים בסיכון נמוך. מספר ניסויי אופטימיזציה המחישו כי זה אפשרי לבצע את γ-H2AX foci assay עם כמויות קטנות של דם, כגון המחקר של Moquet ואח 'שדיווח כי זה אפשרי לבצע את γ-H2AX foci assay עם רק טיפת דם (דקירת אצבע)31. גישה דומה שימשה בפיתוח מערכת RABIT (כלי ביודוסמטריה אוטומטית מהירה) אוטומטית לחלוטין אשר עברה אופטימיזציה למדידת תשואות γ-H2AX מדגימות דם שמקורן באצבעות אצבע32,33. בסך הכל, התוצאות של מחקרי MULTIBIODOSE ו- RENEB בין השוואה מצביעים על כך שבדיוח המוקדים γ-H2AX יכול להיות כלי מיון שימושי מאוד בעקבות חשיפה לקרינה חריפה (עד 24 שעות)12,13,14. במחקר בין-השוואה לטווח במינון נמוך, ניתן להבחין במינון נמוך עד 10 מ"ג ג'י לבין דגימות בקרה מוקרן מזויף, המדגיש את הרגישות של הבחינה בטווח המינון הנמוך34. חשוב לציין כי הרגישות הגבוהה של הבחינה נכונה במיוחד עבור לימפוציטים, מה שהופך אותם לאחד מסוגי התאים המתאימים ביותר להערכת חשיפות במינון נמוך. לימפוציטים הם בעיקר תאים שאינם רוכבי אופניים ומייצגים אוכלוסייה סינכרונית. האחרון נמנע ביטוי של γ-H2AX קשורה לשכפול DNA, אשר מפחית באופן משמעותי את הרגישות של ה- assay לזהות DSB המושרה קרינה במהלך G2 ו- S-שלב של מחזור התא35. בנוסף לרגישות שלה למינונים נמוכים עבור לימפוציטים, זמן התפנית של בדיקת המוקדים γ-H2AX הוא מהיר משמעותית מאשר טכניקות ציטוגנטיות כגון בדיקת דיצנטרי מיקרונוקלאוס, שכן זה לא דורש גירוי של לימפוציטים. לכן, ניתן להשיג תוצאות בתוך כמה שעות לעומת כמה ימים לטכניקות ציטוגנטיות. חיסרון מרכזי של בדיקת ההיעלמות המהירה של אות המוקדים γ-H2AX, שבדרך כלל יופחת לרמות הבסיס בתוך ימים לאחר החשיפה לקרינה בהתאם לקינטיקה לתיקון הדנ"א36. לכן, היישום המתאים ביותר של הבדיקה בהקשר ביודוסמטריה הוא למטרות מיון ראשוניות ולתעדף יותר זמן ציטוגנטי דוזימטריה ביולוגית מעקב עבור קורבנות מסוימים. עם זאת, עבור ביו-דאודומטריה מדויקת ואפקטים ארוכי טווח, יש להסתמך על טכניקות ציטוגנטיות כגון ניתוחי FISH בשלושה צבעים לגילוי סטיות כרומוזומליות יציבות במקרה שהחשיפה התרחשה לפני מספר שנים10.
כחלק ממספר יוזמות ביו-דוסיאמטריות, נבדקו מספר מבחנים למטרות מיון ליד γ-H2AX כדי להיפטר מאנשים במצבי חירום רדיולוגיים רחבי היקף; כגון בדיקת המיקרונוקלוס של בלוק ציטוקינזיס, תהודה פרמגנטית אלקטרונית (EPR), בדיקת חלבון בסרום (SPA), בדיקת כתמי עור (SSA), זוהר מגורה אופטית (OSL), כמו גם ניתוח ביטוי גנים 37,38. γ-H2AX מוקדי assci ניתן להשתמש כמותית להערכה של היווצרות DNA DSB ותיקון39. עם זאת, ההסתה תלויה בזמן מכיוון שרמת מוקדי γ-H2AX משתנה עם הזמן לאחר ההקרנה עקב תיקון ה- DNA DSB קינטיקה40. מחקר השוואתי המחיש כי ניקוד מיקרוסקופי עם קיבולת z-שלב מציע את התוצאות המדויקות ביותר לאחר 1 Gy של הקרנה, בעוד cytometry זרימה רק נותן תוצאות אמינות במינונים גבוהים יותר של IR41. ישנם דיווחים רבים על פיתוח פתרונות ניתוח תמונה לשימוש ניקוד אוטומטי42,43,44,45,46. בפרוטוקול זה, פלטפורמת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה משמשת לניתוח מוקדי γ-H2AX בלימפוציטים של דם היקפי. השימוש במערכת ניקוד אוטומטית מונע הטיית ניקוד בין-מעבדתית ובין-משקיפה, בעוד שהיא עדיין מאפשרת רגישות מספקת כדי לזהות מינונים מתחת ל-1 Gy47. היתרון העיקרי של מערכת זו בהשוואה לתוכנת קוד פתוח בחינם לניקוד מוקדי הוא העובדה כי התהליך המלא מסריקת שקופיות ללכידה וניקוד הוא אוטומטי. הרעיון של מסווגים הניתנים לערעור ואחסן על-ידי המשתמש מבטיח יכולת רבייה המוסיפה מידה לא משוחדת של איכות לתוצאות. לכן, עבודה זו ממחישה כיצד ניתן להשיג תוצאות מוקדי γ-H2AX באמצעות שיטת סריקה וניקוד מיקרוסקופית אוטומטית אשר ניתן להשתמש בה כאשר דגימות דם מאנשים שעלולים להיות חשופים יתר על המידה מתקבלות על ידי מעבדות רדיוביולוגיה למטרות dosimetry ביולוגיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin - BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips (Size 24 x 50 mm)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td>Glass2C29M2450Rec</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials (1.2 mL)</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>607101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC370-12-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin Clips</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin filter cards</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin Funnels</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM-TRITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A16022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-Fluroshield</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Kimix</td>
			<td>ETD901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>&#160;200ul (312012) and 1000ul (313012)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid- HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium&#8211;heparin collection tubes</td>
			<td>The Scientific Group</td>
			<td>367526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaSystems - Metafer</td>
			<td>Metasystems</td>
			<td>Azio Imager Z2: 195-041848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoPen</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline Tablets</td>
			<td>Separations</td>
			<td>SH30028,02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>P11037 and P1033</td>
			<td>X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45&#176; angles to help reduce glass breakage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613402 / 100 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>BE12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (15ml)</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>601002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Tra adhesive slides &#8211; corner clipped</td>
			<td>SMM Technologies</td>
			<td>3800200E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated microscopic scoring method for the &#947;-h2ax foci assay in human peripheral blood lymphocytes

קרינה מייננת היא גורם רב עוצמה לנזק לדנ"א ומסרטן מתועד היטב. dosimetry ביולוגית כוללת גילוי של השפעות ביולוגיות הנגרמות על ידי חשיפה לקרינה מייננת כדי לבצע הערכת מינון בודדת. הדבר רלוונטי במסגרת מקרי חירום קרינתיים, שבהם הערכות בריאות ותכנון טיפול קליני לנפגעים חשופים הם קריטיים. מאז שברי גדיל כפול DNA (DSB) נחשבים הצורה הקטלנית ביותר של נזק DNA הנגרמת על ידי קרינה, פרוטוקול זה מציג שיטה לזהות DNA DSB בדגימות דם. המתודולוגיה מבוססת על זיהוי של חלבון תיקון DNA זרחן פלואורסצנטי, כלומר, γ-H2AX. השימוש בפלטפורמת מיקרוסקופיה אוטומטית כדי להבקיע את מספר מוקדי γ-H2AX לתא מאפשר ניתוח סטנדרטי עם ירידה משמעותית בזמן המפנה. לכן, לבדיקת γ-H2AX יש פוטנציאל להיות אחת מההצקות המהירות והרגישות ביותר לדוסימטריה ביולוגית. בפרוטוקול זה, דגימות דם שלמות ממתנדבים בוגרים בריאים יעובדו ויוקרן במבחנה על מנת להמחיש את השימוש ב- γ-H2AX מוקדי בדיקה אוטומטיים ורגישים ליישומי ביו-דאודומטריה. מערכת סריקת שקופיות אוטומטית ופלטפורמת ניתוח עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב משמשת, המאפשרת ניקוד מהיר ואוטומטי של DNA DSB עם רמה מופחתת של הטיה.

עבור פרוטוקול זה, תאים מונונוקלאריים דם היקפי אנושי (PMBCs) היו מבודדים מדם שלם של ארבעה מתנדבים בוגרים בריאים ונחשפו למינוני קרינה של 0.125, 0.250, 0.500, 1.000 ו 2.000 Gy. לאחר מכן, הדגימות היו דגירה במשך שעה אחת ב 37 °C (5 °F) בחממה 5% CO2 לח. בעקבות קיבעון והכתמת אימונופלואורסצנטיות, השקופיות נסרקות באופן אוטומטי ומבקיעות. איורים 6, 7 ו- 8 נותנים ייצוג של מה שהתוכנה מפיקה למשתמש. חלון ניתוח מופיע לאחר השלמת הסריקה, מה שנותן סקירה כללית של המוקדים שהבקיעו. הגלריה נותנת את כל המוקדים שקיבלו ציון עם תפריט אינטראקטיבי שיכול למחוק חריגים ולבסוף ניתנת היסטוגרמה עם סיכום נתונים מפורט.
מניית המוקדים γ-H2AX לאחר חשיפה לקרני γ מוצגת באיור 9. חלה עלייה הדרגתית במספר מוקדי γ-H2AX עם מינון הולך וגדל. גרף זה אינו רק ממחיש את התלות במנה ואת הרגישות של ההבחנה, אלא ניתן להשתמש בהתאמה גם כדי לבצע הערכת מינון כאשר מדגם מתקבל מאדם שנחשף למנה לא ידועה. חשוב לציין כי אחד לא יהיה שליטה מוקרן מזויף או רמות מוקדי רקע עבור אדם זה. לכן, איור 9 כולל את הערך 0 Gy של דגימות בקרה מוקרן מזויף, אשר היה 0.57 ± 0.23 Gy עבור ארבעת התורמים הבוגרים במחקר זה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig01.jpg"> איור 1: הכנת שקופיותלצנטריפוגה ציטו. מקם את השקופית לתוך מחזיק הקליפ, הוסף את כרטיס המסנן מעליה ולבסוף את המשפך. אבטחו את קטעי השקופיות והכניסו את הציטוצנטריפוגה. לאחר cytocentrifugation, להסיר את השקופית ממחזיק קליפ ולצייר עיגול סביב המקום עם התאים באמצעות עט הידרופובי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig02.jpg"> איור 2: פלטפורמת הסריקה האוטומטית ששימשה בפרוטוקול זה, המכילה סורק אוטומטי המחובר למיקרוסקופ פלואורסצנטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig03.jpg"> איור 3: תפריט להגדרת שקופיות. פתח את תיבת הדו-שיח על-ידי לחיצה על לחצן SETUP בסרגל הצד. בחר או הזן את ספריית היעד עבור קבצי התוצאות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig03large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig04.jpg"> איור 4: תפריט הגדרת מסווג. ודא שהגדרות המסווג שנבחרו תואמות לסוג התא הנוכחי, לתנאי ההכנה ולדפוסי הכתמים של המדגם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig05.jpg"> איור 5: תפריט התקנה עבור חלון חיפוש ידני. החלון נבחר בהגדרת שקופית; ייפתח דיאלוג המאפשר קביעת אזור הסריקה. באמצעות המטרה 10x, אזור החיפוש המלבני בשקופית נבחר באופן אינטראקטיבי על-ידי תיקון שתי פינות בשדה החיפוש בלחיצה שמאלית של העכבר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig06.jpg"> איור 6: חלון הניתוח, לאחר השלמת הסריקה, חלון הניתוח מציג את תוצאות הסריקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig07.jpg"> איור 7: תצוגת גלריה עבור השקופית שנבחרה. הכרטיסיה גלריה נמצאת בסרגל הצדדי. גלריית התמונות מורכבת מתמונות קטנות של התאים שזוהו, המוצגות כתמונה משולבת של DAPI-TRITC. בפינה השמאלית הימנית התחתונה של כל תמונה מוצגים ספירת המוקדים הישירה וספירת המוקדים המתוקנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig08.jpg"> איור 8: תמונות היסטוגרמה עבור השקופית שנבחרה. חלון זה נפתח על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על היסטוגרמה. על ידי לחיצה על היסטוגרמה, גליון הכרטיסיות היסטוגרמה מספק סיכום נתונים המפרט את הממוצע, סטיית התקן, מקדם השונות, הערכים המינימליים, המקסימליים והחניים של התאים המנותחים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig09.jpg"> איור 9: מספר מוקדי γ-H2AX כפונקציה של מינון ללימפוציטים שנחשפו ל-60 קרני γ Co. סרגלי השגיאה הם סטיות התקן המייצגות את השונות הבין-ממדית בין התורמים. הנתונים מייצגים את המספר הממוצע של מוקדי γ-H2AX ± סטיית התקן של ארבעה מתנדבים בריאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃŽÂ³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes at JoVE.com

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

פרוטוקול זה מציג את הכנת השקופית ואת הניקוד האוטומטי של γ-H2AX foci בדיקה על לימפוציטים דם היקפיים. כדי להמחיש את השיטה והרגישות של ההסתה, לימפוציטים מבודדים היו מוקרן במבחנה. שיטה אוטומטית זו של זיהוי DNA DSB שימושית עבור יישומי dosimetry ביולוגיים מהירים ותפוקה גבוהה.

שיטת ניקוד מיקרוסקופית אוטומטית לבדיקת מוקדי γ-H2AX בלימפוציטים אנושיים היקפיים

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

שמי ד"ר שנקרי נאיר, ואני פוסט-דוקטורנט באגף לביופיזיקה של קרינה במחלקה לרפואה גרעינית ב-NRF, iThemba LABS. בסרטון זה, אנו להדגים את השימוש אוטומטי Gamma H2AX מוקדי בדיקה על לימפוציטים דם היקפיים אנושיים לשימוש ביישומי סימטריה אצווה. סיכוני הקרינה לכוח אדם נשלטים בקפדנות.קרינה מייננת משפיעה ישירות על מבנה הדנ"א על ידי גרימת שבירות דנ"א. במיוחד שבירות כפולות גדיל. אחד השלבים המוקדמים ביותר בתהליך זיהוי שבירת גדיל כפול DNA הוא זרחן של וריאנט histone, H2AX, וגיוס חלבוני תיקון.וידאו זה יתווה את השימוש במיקרוסקופיה כדי להבקיע את מספר מוקדי גאמא-H2AX רן-גרעין באמצעות מערכת סריקת שקופיות אוטומטית ופלטפורמת ניתוח, המשלבת את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. לימפוציטים מבודדים מדם שלם. לדלל דם שלם עם PBS ביחס של אחד לאחד, ולאחר מכן בעדינות להניח את הדם המדולל על נפח אחד של מדיום הדרגתי צפיפות.בהדרגה שכבה את הדם על ידי החזקת הצינור מנוקד ב 45 מעלות. מעבירים את המתלים לצנטריפוגה ומסתובבים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות ב-900 ג'י לאחר צנטריפיקציה ייווצרו ארבע שכבות. העבירו בזהירות את השכבה העכורה המכילה את הלימפוציטים לצינור חרוט סטרילי חדש.לשטוף את הלימפוציטים עם PBS ולספור באמצעות hemocytometer. לאחר המספר הכולל של לימפוציטים נקבעים, לדלל את הלימפוציט ואת ההשעיה לריכוז של כ 800, 000 לימפוציטים במיליליטר אחד של RPMI מלא. הדגימות ומוכנות לקרינה שלנו.הלימפוציטים מוקרנים בקרני גמא ממקור קובלט 60, ולאחר מכן מדגירים במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני. עבור כל מצב הקרנה או צינור, שלוש שקופיות מוכנות. מקם החלקה לתוך מחזיק הקליפ, ואחריו כרטיס המסנן, ולבסוף את המשפך.אבטחו את קטעי השקופיות והכניסו לצנטריפוגה הציטו. מוסיפים 250 מיקרוליטרים של ההשעיה של התא על כל משפך ומסתובבים במשך 30 G במשך חמש דקות. השימוש בצנטריפוגה ציטו חיוני כדי לקבל תנאים סטנדרטיים על אוטומציה שקופיות.לאחר סיבוב, להסיר את השקופיות מהקליפ ולאחר מכן באמצעות העט הידרופובי, לצייר עיגול סביב הנקודה שבה התאים נמצאים. כעת, לאחר שהשקופיות נוצרו, יש לתקן את התאים לשקופית כך שהכתמים האימונופלואורסצנטיים יוכלו להתרחש. התאים קבועים באמצעות 3%paraformaldehyde, או PFA, ופתרון PBS במשך 20 דקות.לאחר קיבוע לשטוף שקופיות בצנצנת קופלין עם PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן, לכסות את התאים עם טריטון X כדי לאפשר permeabilization. שלב permeabilization מסיר שומנים ממברנה תאית יותר כדי לאפשר נוגדנים להיכנס לגרעין התא.מעתה והלאה, אנו משתמשים בפתרון חסימה העשוי מ- 1%BSA ב- PBS, כדי לשטוף שקופיות כדי להפחית איגודים פוטנציאליים שאינם ספציפיים. לאחר שלושה שלבי שטיפה של 10 דקות עם 1%BSA ו- PBS, השקופיות דוגרות בטמפרטורת החדר עם נוגדן H2AX עיקרי נגד גמא למשך שעה אחת בתא הלחות, מושג בקלות על ידי הוספת נייר טישו רטוב בבסיס תיבת האחסון של השקופית המלבנית. לאחר הדגירה עם נוגדן ראשוני, להטות את הנוזל ולשטוף שקופיות שוב בתמיסת 1%BSA.דגירה שקופיות עם אחד עד אלף מדולל חמור משני נוגדן TRITC נגד עכבר במשך שעה אחת בתא לחות. הסר את הנוגדן לפני ביצוע שלוש, 10 דקות שטיפות PBS. מכסים את צנצנת קופלין בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור למשך שלבי הכביסה.הסר את השקופיות ולנגב PBS עודף מחוץ למעגל הידרופובי עם נייר טישו ללא אבק. לבסוף, להוסיף טיפה אחת עד שתי טיפות של DAPI הביא זיכוי הרכבה בינונית בעדינות לכסות את השקופיות עם פתק הכיסוי. ודא כי אין בועות אוויר לכודות ולאחר מכן לאחסן דגימות במקום חשוך בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.נגב בעדינות שקופיות עם 70% אתנול והנח שקופיות על פלטפורמת הסריקה האוטומטית, או שלב השקופית, המחובר למיקרוסקופ ZED-2 של תמונות ציריות zite. בחר את הגדרת הסיווג תחת הכרטיסיה MetaCyte כדי לערוך את המסווג. המסווג שנבחר ישמש את המערכת לסריקה וציון של השקופיות, והוא מבוסס על קבוצה של פרמטרים מוגדרים מראש, אשר יקבעו כיצד המערכת בוחרת תאים ומבקיעה מוקדים.ניתן למטב ולאמן את המסווג בהתבסס על מספר שדות תמונה מסווגים מראש. בהתאם להגדלת המיקרוסקופ, סוג הנוגדנים המשמשים להכתמה, ניתן למטב מסווג אחר. לכן מסווגים בדרך כלל משתנים ממעבדה למעבדה, אבל אנחנו ניתן סקירה של הצעדים הבסיסיים ביותר שננקטו בחשבון כאשר יש להתאים את מערך המסווג.תחת הכרטיסיה לכידה, ניתן למצוא את המסנן שישמש, כאן DAPI ו- TRITC, עם זמן שילוב מרבי של 1.04 שניות. האחרון מבוסס על המסווג המקורי שסופק על ידי החברה ומאוחר יותר מותאם לעוצמת הנוגדנים וגמא הרקע H2AX, או אות TRITC, בסוג תא ספציפי זה, כלומר לימפוציטים. תחת הכרטיסיה חשיפה, זמן השילוב המינימלי מוגדר.המסווג תמיד יישאר בתוך זמן האינטגרציה המינימלי והמקסימלי, מה שמונע חשיפה מוגזמת או תת-חשיפה של השקופית. תחת הכרטיסיה בחירת תאים, אזורי האובייקט המינימלי והמקסימלי הוגדרו בהתבסס על הגודל והצורה של התאים המנותחים. לדוגמה, ערך ההקמה שנקבע מראש ויחס הרוחב-גובה הם ספציפיים ללימפוציטים, אשר בדרך כלל יש צורות עגולות.תחת הכרטיסיה תכונות, באפשרותך לשנות את תצוגת הגלריה וההיסטוגרמה, וכן לקבוע מה המיקרוסקופ צריך להבקיע. המערכת יכולה להבקיע פריטים רבים, בהתאם לתכונות שהמשתמש בחר. דוגמה לכך היא הסף של האופן שבו התוכנה מבקיעה אובייקטים בודדים.לאחר זיהוי מסווג מתאים, בחר את ההגדרה בסרגל הצד והעניק לכל שקופית שם ייחודי, ולאחר מכן את בחירת המסווג המתאים. בחר ספירת תאים מרבית והוסף את מספר התאים המרבי הדרוש לסריקה. החיפוש מסתיים גם אם חלון החיפוש שנבחר טרם נסרק לחלוטין, ברגע שתגיע לספירת התאים המרבית.עבור יישומי ביו-דיסימיטריה, די ניקוד אוטומטי של 1,000 תאים לשקופית, בהתחשב בכך ששלוש שקופיות לכל דגימת דם מוכנות. לחץ על אישור'כדי לאשר את ההגדרות. כדי לסרוק שקופיות, בחר חיפוש בסרגל הצד.אם ההגדרה חלון חיפוש ידני'נבחרה בהגדרת השקופית, תיבת דו-שיח תפתח קו לקביעת אזור הסריקה. באמצעות המטרה 10 פעמים אזור החיפוש המלבני בשקופית נבחר באופן אינטראקטיבי על-ידי תיקון שתי פינות של שדה החיפוש בלחיצה השמאלית של העכבר. ניתן לאשר זאת באמצעות לחצן אישור.כוונן מיקום התחלה של מיקוד. התוכנה תבקש מיקוד ומרכז גרעין הפניה באמצעות המטרה 40 פעמים עבור כל שקופית ולאשר הגדרות עם אישור. המערכת תעבור באופן אוטומטי לכל הצדדים ברצף. במידת הצורך, התאימו את 'הגדרת תמונה חיה' ואת זמן האינטגרציה'עבור שלב זה.בדוק את כל הגדרות המיקרוסקופ. ודא כי הידית של צינור המיקרוסקופ נמצאת במצב שמסיט את כל האור למצלמה ולאשר את הנחיית המערכת עם אישור. המערכת מפעילה את המוקד האוטומטי של הרשת במיקום הרשת הקרוב ביותר לשדה הייחוס. הוא ממשיך להתמקד בשדה ברשת הרגילה, נע בהתפתלות לכיוון החזית והחלק האחורי של חלון החיפוש.הסריקה מתחילה עם השלמת המוקד האוטומטי של הרשת. השלב מועבר בשדה תבנית מתפתל אחרי שדה כדי ללכוד נתונים. כאשר מזוהה תא, הוא ממוקם ותמונת גלריה מאוחסנת ומוצגת במסך וספירת התאים מתעדכנת.החיפוש מסתיים אם החיפוש כולו נסרק, אם הגיעה ספירת התאים המרבית או אם החיפוש בוטל. לאחר השלמת הסריקה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הסרגל בתחתית ופתח דוגמה. סקור את הגלריה, המורכבת מתמונות קטנות של תאים שזוהו.בחלון זה באפשרותך לציין את התאים המאוחסנים בגלריה באמצעות קריטריון שייבחרו מהתפריט הנפתח. תאים מוצגים בדרך כלל בסדר שבו הם זוהו. לחץ על דיאגרמת ערך תכונה של היסטוגרמה איכותית כדי לתת את ההתפלגות של התאים שזוהו, כמו גם את האמצעים, ואת סטיית התקן של מוקדי הציון.כאן אנו משווים את האפור האפס לעומת 1.5 דוגמאות אפורות. זוהי בדרך כלל שקופית פקד, עם ערך ממוצע של 0.124 מוקדים לתא, כאשר התא לא הוקרן. בהקשר ביו-דיס-דיסמטריה, זה מצביע על כך שאדם לא נחשף לקרינה במינון גבוה.בגרף, אנו יכולים לראות כי רוב התאים יש כמעט אפס מוקדים לתא, ואין צד של התפלגות נורמלית. כאשר אנו משווים את זה למנה של 1.5 אפור, ניתן לראות בבירור כי זוהי מדגם מוקרן. בהקשר ביו-דיס-דיסמטריה, הפצה נורמלית זו היא סימן ברור לכך שהדגימה נחשפה לקרינה.הסריקה האוטומטית רגישה מספיק כדי לזהות מוקדים במינונים נמוכים. התוצאות מראות עלייה ליניארית ברורה של מספר המוקדים לתא עם מינון. השיטה האוטומטית של זיהוי שבירת גדיל כפול DNA שימושית עבור יישומי דיסימטריה ביולוגית מהירה וגבוהה.תודה שצפיתם.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

הזרקת עורק Intra-כסל עבור דוגמנות יעילה וסלקטיבי של מיקרוסקופיים עצם גרור

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

תא היקפי של דם מונאפרור (PBMC) חרט הומניזציה מודל Xenograft עבור מחקר הטרנסג-אונקולוגיה (I-O)

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

בידוד תאים חד-גרעיניים של דם היקפי אנושי ותאי T מסוג CD4+ מחולי תסמונת סזארי לצורך פרופיל תעתיק

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...