Name: an automated microscopic scoring method for the &#947;-h2ax foci assay in human peripheral blood lymphocytes
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 8 min 23 s
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लेखक अध्ययन प्रतिभागियों को उनके रक्तदान के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही रक्त नमूना संग्रह के लिए नर्स वी प्रिंस । इस शोध के प्रति दक्षिण अफ्रीकी राष्ट्रीय अनुसंधान प्रतिष्ठान (एनआरएफ) की वित्तीय सहायता को स्वीकार किया जाता है । व्यक्त की राय, और निष्कर्ष पर पहुंचे, लेखकों के उन है और जरूरी नहीं कि एनआरएफ के लिए जिंमेदार ठहराया जा रहे हैं । इस काम को अंतरराष्ट्रीय परमाणु ऊर्जा एजेंसी (आईएईए) द्वारा डब्ल्यू मार्टिनेज-लोपेज़ के साथ-साथ समन्वित अनुसंधान परियोजना E35010 (अनुबंध संख्या: 22248) का समर्थन करने के लिए तकनीकी सहयोग परियोजना (संख्या: URU6042) के माध्यम से आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था।

सी Schunck मेटासिस्टम्स हार्ड एंड सॉफ्टवेयर जीएमबीएच, अल्तालुशेम, जर्मनी के कर्मचारी हैं ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin - BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips (Size 24 x 50 mm)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td>Glass2C29M2450Rec</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials (1.2 mL)</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>607101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC370-12-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin Clips</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin filter cards</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin Funnels</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM-TRITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A16022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-Fluroshield</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Kimix</td>
			<td>ETD901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>&#160;200ul (312012) and 1000ul (313012)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid- HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium&#8211;heparin collection tubes</td>
			<td>The Scientific Group</td>
			<td>367526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaSystems - Metafer</td>
			<td>Metasystems</td>
			<td>Azio Imager Z2: 195-041848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoPen</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline Tablets</td>
			<td>Separations</td>
			<td>SH30028,02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>P11037 and P1033</td>
			<td>X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45&#176; angles to help reduce glass breakage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613402 / 100 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>BE12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (15ml)</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>601002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Tra adhesive slides &#8211; corner clipped</td>
			<td>SMM Technologies</td>
			<td>3800200E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated microscopic scoring method for the &#947;-h2ax foci assay in human peripheral blood lymphocytes

आयनीकरण विकिरण डीएनए क्षति का एक शक्तिशाली प्रेरक और एक अच्छी तरह से प्रलेखित कार्सिनोजन है। जैविक डोसिमेट्री में व्यक्तिगत खुराक मूल्यांकन करने के लिए आयनीकरण विकिरण के संपर्क में आने से प्रेरित जैविक प्रभावों का पता लगाना शामिल है। यह विकिरण आपात स्थिति के ढांचे में प्रासंगिक है, जहां स्वास्थ्य आकलन और उजागर पीड़ितों के लिए नैदानिक उपचार की योजना महत्वपूर्ण हैं । चूंकि डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) को विकिरण-प्रेरित डीएनए क्षति का सबसे घातक रूप माना जाता है, इसलिए यह प्रोटोकॉल रक्त नमूनों में डीएनए डीएसबी का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। यह कार्यप्रणाली फ्लोरोसेंट लेबल वाले फॉस्फोरिलेटेड डीएनए रिपेयर प्रोटीन, नामत γ-एच2एक्स का पता लगाने पर आधारित है । प्रति सेल γ-एच2एएक्स फोसी की संख्या स्कोर करने के लिए एक स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म का उपयोग टर्न-अराउंड समय में महत्वपूर्ण कमी के साथ एक मानकीकृत विश्लेषण की अनुमति देता है। इसलिए, γ-H2AX परख जैविक dosimetry के लिए सबसे तेज और संवेदनशील परख में से एक होने की क्षमता है । इस प्रोटोकॉल में, स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों से पूरे रक्त नमूनों को संसाधित किया जाएगा और बायोडोसिमिट्री अनुप्रयोगों के लिए स्वचालित और संवेदनशील γ-H2AX फोसी परख के उपयोग को समझाने के लिए विट्रो में विकिरणित किया जाएगा। एक एकीकृत फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ एक स्वचालित स्लाइड स्कैनिंग सिस्टम और विश्लेषण मंच का उपयोग किया जाता है, जो पूर्वाग्रह की कम डिग्री के साथ डीएनए डीएसबी के तेज, स्वचालित स्कोरिंग की अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल के लिए, मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीएमबीसी) को चार स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों के पूरे रक्त से अलग किया गया था और 0.125, 0.250, 0.500, 1.000 और 2.000 जीवाई की विकिरण खुराक के संपर्क में थे। इसके बाद 5 प्रतिशत सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे तक नमूने लिए गए। फिक्सेशन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के बाद, स्लाइड स्वचालित रूप से स्कैन और रन बनाए जाते हैं। आंकड़े 6,7, और 8 उपयोगकर्ता को सॉफ्टवेयर आउटपुट का प्रतिनिधित्व देते हैं। स्कैन पूरा होने के बाद एक विश्लेषण खिड़की दिखाई देती है, जिससे फोसी का अवलोकन होता है। गैलरी सभी foci एक इंटरैक्टिव मेनू है कि outliers को नष्ट कर सकते है और अंत में एक विस्तृत डेटा सारांश के साथ एक हिस्टोग्राम दिया जाता है के साथ रन बनाए देता है ।
γ-किरणों के संपर्क में आने के बाद γ-H2AX फोसी यील्ड चित्र 9में प्रस्तुत की जाती है । बढ़ती खुराक के साथ γ-H2AX foci की संख्या में धीरे-धीरे वृद्धि हुई थी। यह ग्राफ न केवल खुराक निर्भरता और परख की संवेदनशीलता को स्पष्ट करता है, बल्कि फिट का उपयोग खुराक अनुमान लगाने के लिए भी किया जा सकता है जब एक नमूना किसी व्यक्ति से प्राप्त होता है जो अज्ञात खुराक के संपर्क में आया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस व्यक्ति के लिए किसी के पास नकली-विकिरणित नियंत्रण या पृष्ठभूमि फोसी स्तर नहीं होगा। इसलिए, चित्रा 9 में नकली-विकिरणित नियंत्रण नमूनों का 0 जीवाई मूल्य शामिल है, जो इस अध्ययन में चार वयस्क दानदाताओं के लिए 0.57 ± 0.23 Gy था।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig01.jpg"> चित्रा 1- साइटो सेंट्रलाइजेशन के लिए स्लाइड्सकीतैयारी। क्लिप धारक में स्लाइड रखें, इसके ऊपर फिल्टर कार्ड जोड़ें, और अंत में फ़नल करें। स्लाइड क्लिप सुरक्षित और साइटोसेंट्रफ्यूज में जगह है। साइटोसेंट्रफ्यूगेशन के बाद, क्लिप धारक से स्लाइड को हटा दें और हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके कोशिकाओं के साथ घटनास्थल के चारों ओर एक सर्कल बनाएं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig02.jpg"> चित्र 2: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया स्वचालित स्कैनिंग प्लेटफ़ॉर्म, जिसमें फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से जुड़ा एक स्वचालित स्कैनर होता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig03.jpg"> चित्रा 3:स्लाइड सेटअप के लिए मेनू। साइडबार में सेटअप बटन पर क्लिक करके संवाद खोलें। परिणाम फ़ाइलों के लिए लक्ष्य निर्देशिका का चयन करें या दर्ज <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig03large.jpg" target="_blank">करें कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig04.jpg"> चित्रा 4:क्लासिफायर सेटअप मेनू। सुनिश्चित करें कि चयनित क्लासिफायर सेटिंग्स वर्तमान सेल प्रकार, तैयारी की स्थिति और नमूने के धुंधला पैटर्न से मेल खाती हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig05.jpg"> चित्रा 5:मैनुअल सर्च विंडो के लिए सेटअप मेनू। विंडो स्लाइड सेटअप में चुना गया था; एक बातचीत स्कैन क्षेत्र के निर्धारण के लिए अनुमति खोलने के लिए होगा । 10x उद्देश्य का उपयोग करके, स्लाइड पर आयताकार खोज क्षेत्र माउस के बाएं क्लिक द्वारा खोज क्षेत्र के दो कोनों को ठीक करके इंटरैक्टिव रूप से चुना जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig06.jpg"> चित्र 6:विश्लेषण विंडो, एक बार स्कैन पूरा हो जाने के बाद, विश्लेषण विंडो स्कैन के परिणामों को दिखाती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig07.jpg"> चित्रा 7:चयनित स्लाइड के लिए गैलरी देखें। गैलरी टैब साइड बार पर पाया जाता है। छवि गैलरी में पता लगाया कोशिकाओं की छोटी छवियों के होते हैं, एक संयुक्त DAPI-TRITC छवि के रूप में प्रदर्शित । प्रत्येक छवि के निचले बाएं और दाएं कोने में प्रत्यक्ष फोसी गिनती और सही फोसी काउंट प्रदर्शित किए जाते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig07large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig08.jpg"> चित्रा 8:चयनित स्लाइड के लिए हिस्टोग्राम छवियां। हिस्टोग्राम पर सही क्लिक करके यह विंडो खोली जाती है। हिस्टोग्राम पर क्लिक करके, हिस्टोग्राम टैब शीट एक डेटा सारांश प्रदान करता है जो विश्लेषण कोशिकाओं के मतलब, मानक विचलन, भिन्नता के गुणांक, न्यूनतम, अधिकतम और औसत मूल्यों को सूचीबद्ध करता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig08large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig09.jpg"> चित्रा 9: 60सह γ-किरणों के संपर्क में लिम्फोसाइट्स के लिए खुराक के एक समारोह के रूप में γ-H2AX foci की संख्या। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन दाताओं के बीच अंतरविभाजनीय भिन्नता का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । डेटा चार स्वस्थ स्वयंसेवकों के मानक विचलन ± γ-H2AX foci की औसत संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig09large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

यह प्रोटोकॉल परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स पर γ-H2AX फोसी परख की स्लाइड तैयारी और स्वचालित स्कोरिंग प्रस्तुत करता है। परख की विधि और संवेदनशीलता को समझाने के लिए, विट्रो मेंअलग-थलग लिम्फोसाइट्स को विकिरणित किया गया था। डीएनए डीएसबी डिटेक्शन की यह स्वचालित विधि तेज और उच्च थ्रूपुट जैविक दोसिमेत्री अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी है।

मानव परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में γ-H2AX Foci परख के लिए एक स्वचालित सूक्ष्म स्कोरिंग विधि

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

सूक्ष्म अस्थि मेटास्टेसिस के कुशल और चयनात्मक मॉडलिंग के लिए इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी इंजेक्शन

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

थकान के एक माउस मॉडल परिधीय विकिरण से प्रेरित

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

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Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Oncogene निर्भरता में सी-फोस और Dusp1 की भूमिका के मूल्यांकन के लिए तरीके

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

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एक मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) अनुवाद इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी (आई-ओ) अनुसंधान के लिए मानवीकृत Xenograft मॉडल Engraft

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

इन विट्रो परख से अध्ययन ट्यूमर-मैक्रोफेज इंटरेक्शन

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

मिटोकन साइटोटॉक्सीसिटी के सटीक निर्धारण के लिए एक स्वचालित अंतर परमाणु स्टेनिंग परख

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

मानव पेट के कैंसर कोशिकाओं में डीएनए क्षति और मरम्मत Foci के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

कैंसर रोगियों के रक्त प्लाज्मा नमूनों में सेल मुक्त डीएनए का पता लगाना

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं और CD4 + T कोशिकाओं को सेज़ारी सिंड्रोम रोगियों से ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए अलग करना

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...