Name: an automated microscopic scoring method for the &#947;-h2ax foci assay in human peripheral blood lymphocytes
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃŽÂ³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes at JoVE.com

Forfatterne vil takke studiedeltakerne for deres bloddonasjoner, samt sykepleier V. Prince for blodprøvetaking. Den økonomiske bistanden fra Den sørafrikanske nasjonale forskningsstiftelsen (NRF) til denne forskningen er herved anerkjent. Meninger uttrykt, og konklusjoner kom frem til, er forfatternes og skal ikke nødvendigvis tilskrives NRF. Dette arbeidet ble finansielt støttet av Det internasjonale atomenergibyrået (IAEA), gjennom et teknisk samarbeidsprosjekt (antall: URU6042) for å støtte W. Martínez-López, samt Det koordinerte forskningsprosjektet E35010 (kontraktsnummer: 22248).

Denne studien ble godkjent av Biomedical Research Ethics Committee ved University of Western Cape Ethics Committee - Code BM18/6/12.
1. Utarbeidelse av løsninger48
<ol><li>Cellefikseringsløsning (3 % PFA i PBS)<ol>
<li>Bruk riktig personlig verneutstyr (PVU) og arbeid i en avtrekkshette, tilsett 20 g paraformaldehyd til 200 ml destillert H2O. Varm blandingen til 60 °C for å hjelpe oppløsningen.</li>
		<li>Når PFA er oppløst, tilsett 40 dråper 5 N NaOH forsiktig over 30 minutter og for å avkjøle til romtemperatur. Juster til pH 7 ved hjelp av 1 M HCl og utgjør et sluttvolum på 250 ml med destillert H2O (aliquots kan lagres ved -20 °C i 1 år). Tilsett 25 ml fra denne løsningen til 41,7 ml PBS for å ha råd til en 3 % PFA-løsning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1% Bovine Serum Albumin (BSA)-løsning: Tilsett 10 g BSA til 1000 ml PBS og bland til det er oppløst. Oppbevars ved 4 °C til bruk (maksimalt 72 timer).</li>
	<li>Triton-X-oppløsning i en konsentrasjon på 1:500: Tilsett 1 μL Triton-X til 500 μL PBS, oppbevar ved 4 °C til bruk (maksimalt 24 timer).</li>
	<li>Antistoff løsninger<ol>
<li>Primært antistoff - Anti-γ-H2AX i konsentrasjon på 1:500: Tilsett 1 μL anti-γ-H2AX til 500 μL 1% BSA-løsning, oppbevar ved 4 °C til bruk (maksimalt 24 timer).</li>
		<li>Sekundært antistoff - DAM-TRITC i konsentrasjon på 1:1000: Tilsett 1 μL DAM-TRITC til 1000 μL 1% BSA-oppløsning, oppbevar ved 4 °C til bruk (maksimalt 24 timer).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Komplette Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) Media<ol>
<li>Legg filtrert Fetal Bovine Serum (FBS) og Penicillin-Streptomycin til RPMI 1640 medier i en steril flaske for å gi en endelig konsentrasjon på 10% FBS og 1% Penicillin-Streptomycin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Forberedelse av prøver
MERK: For denne protokollen samles perifere fullblodsprøver ved venepunksjon i litium-heparin-innsamlingsrør fra friske voksne frivillige (med informert samtykke - BM18/6/12 Biomedisinsk forskningsetisk komité ved University of Western Cape Ethics Committee). Før du begynner, må du sørge for at blodet og tetthetsmediet på 1,077 g / ml er akklimatiserte til romtemperatur.
<ol><li>I et forberedt biosikkerhetsskap fortynner du det perifere fullblodet i et 1:1-volum med PBS og legger forsiktig det fortynnede blodet på et likt volum til to volumer medium med en tetthet på 1,077 g / ml. Det er viktig å gradvis legge blodet på tetthetsmediet ved å holde røret skrått ved 45°, og sikre at blod- og tetthetsmediet ikke blandes.</li>
	<li>Overfør suspensjonen forsiktig til en sentrifuge og spinn på 900 x g i 20 minutter. Deretter pipetterer du det "overskyete" laget bare til et nytt sterilt konisk rør og fyller røret med PBS og sentrifuge i 10 minutter ved 1000 x g. Deretter aspirerer du supernatanten med en pipette, er forsiktig med å ikke forstyrre pelletsen, resuspenderer PBMC-pellet forsiktig i 1 ml PBS og fyller røret med PBS.</li>
	<li>Gjenta vasketrinnet ovenfor to ganger til for å komme til totalt tre vasker.</li>
	<li>Tell antall PBMCer ved hjelp av et hemocytometer, klar over at hver ml perifert blod fra en voksen donor vil resultere i et grovt gjennomsnitt på 1 - 1,5 x 106 PBMCer49. Etter telling fortynner du PBMC-pellet til en konsentrasjon på 8 x 105 lymfocytter i 1 ml cRPMI. Tilsett deretter omtrent 2 x 106 PBMCer eller 2,5 ml fra den isolerte PBMC-løsningen i et sterilt, konisk rør for bestråling.</li>
</ol>3. Prøvebestråling
FORSIKTIG: Håndter strålingsenheten i henhold til retningslinjene for strålevern og bruk til enhver tid et fysisk dosimeter. Forsikre deg om at bestrålingssystemet som brukes er kalibrert og satt opp slik at de riktige forventede dosene oppnås.
<ol><li>Bestråle PBMCer ved romtemperatur ved hjelp av en 60Co-kilde. Kalibrer (TRS-398-protokollen) med et Farmer 117-kammer der en kammerkalibreringsfaktor hentet fra National Metrology Institute of South Africa (NMISA)50.<ol>
<li>For denne analysen plasserer du de koniske rørene mellom et 5 mm akrylark (brukes til stråleinngangsoppbygging) og 50 mm ryggscattermateriale med den nåværende 60Co-kildedosehastigheten på 0,57 Gy/min i en 300 mm × 300 mm homogen feltstørrelse ved 750 mm Kilde til overflateavstand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestråle PBMC-ene med graderte doser på 0,125, 0,500, 1,000, 1500 og 2000 Gy, og opprettholde de sham-bestrålede kontrollprøvene, i kontrollrommet, og mottar bare omgivelsesstrålingseksponering.</li>
	<li>Inkuber de bestrålede prøvene i 1 time ved 37 °C i en fuktet 5 % CO 2-inkubator for å nå maksimalt antall γ-H2AX foci. MERK: Inkubasjonstiden kan endres i henhold til eksperimentell design.</li>
</ol>4. Skyv forberedelsene
MERK: Se figur 1 for lysbildeoppsett.
<ol><li>Forbered 3 lysbilder (tekniske repetisjoner) ved hjelp av lysbilder belagt med en positivt ladet overflate for å forbedre vedheft per bestrålingstilstand (eller per konisk rør). Plasser lysbildet i klipsholderen, legg til filterkortet oppå det, og til slutt trakten. Fest glideklipsene og plasser dem i cytocentrifugen.</li>
	<li>Tilsett 250 μL av celleopphenget i trakten (200 000 celler/lysbilde) og spinn i 30 x g i 5 minutter ved hjelp av en cytocentrifuge.</li>
	<li>Etter cytocentrifugation, fjern lysbildet fra klipsholderen og bruk en hydrofob penn, tegn en sirkel rundt stedet med cellene for å beholde immunfluorescerende flekk på de bundne cellene under fargingsprosessen.</li>
</ol>5. Fiksering og immunfluorescens γ-H2AX farging
MERK: Alle løsninger legges forsiktig direkte til celleområdet som er merket med en hydrofob sirkel. Fargingsløsninger dispenseres litt over lysbildet uten at pipettespissen forstyrrer cellene. Løsninger legges IKKE til i hele lysbildet.
<ol><li>Fest lysbildene i nylagde 3% PFA i 20 minutter. MERK: Lysbildene kan oppbevares i PBS som inneholder 0,5 % PFA ved 4 °C i maksimalt 2 dager før immunstaining utføres. Deretter vasker du lysbilder i en Coplin-krukke med PBS i 5 minutter, og dekker deretter cellene med 100 μL av den kalde Triton-X-løsningen i 10 minutter for å tillate permeabilisering.</li>
	<li>Vipp Triton-X-oppløsningen av på silkepapir og vask lysbildene tre ganger i 1 % BSA-oppløsning i 10 minutter. Dette gjøres for å forhindre uønsket bakgrunn ved å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding.</li>
	<li>Inkuber lysbilder ved romtemperatur med 100 μL av det 1:500-fortynnede primære anti-γ-H2AX antistoffet i 1 time i et fuktig kammer, lett oppnådd ved å legge til vått vevspapir ved foten av en rektangulær skyveboks.<ol>
<li>Tips antistoffoppløsningen av på vevspapir og utfør tre vasker med 1% BSA-oppløsning i 10 minutter i en Coplin-krukke for å fjerne ubundet primært antistoff og for å forhindre ikke-spesifikk binding av sekundært antistoff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkuber lysbilder med 100 μL av den 1:1000-fortynnede sekundære DAM-TRITC antistoffløsningen i 1 time i det fuktige kammeret. Vipp antistoffløsningen av på vevspapir og vask lysbildene i PBS i 10 minutter tre ganger.</li>
	<li>Tørk til slutt lysbildene utenfor den hydrofobe sirkelen med mykt, støvfritt vevpapir og tilsett 1-2 dråper DAPI løst i et vandig monteringsmedium og dekk forsiktig lysbildet med en 24 x 50 mm dekselglidning, og sørg for at det ikke er noen fanget luftbobler og plasser i kjøleskapet ved 4 ° C over natten. Lysbilder kan oppbevares ved 4 °C i maksimalt 2 uker før skanning.</li>
</ol>6. Automatisert skanning og scoring av lysbilder
MERK: Skannesystemet må ha et fluorescerende mikroskop, et ccd-kamera med høy oppløsning (ladet koblet enhet) koblet til en rammegriper for digitalisering av videobilder i sanntid, et skannetrinn, styrekule for manuelle bevegelser, 3D-mus, rask PC og skjerm og harddisk for arkivering (figur 2).
<ol><li>Oppsett av klassifiserer MERK: Klassifisereren er et sett med parametere som definerer hvordan systemet oppdager celler. Det er et resultat av opplæringen basert på forhånds klassifiserte bildefelt. En klassifiserer er spesifikk for en mikroskopforstørrelse, celletype og laboratorium. Klassifiserere kan derfor kreve endringer i følgende parametere for å tilpasse dem til gjeldende forhold. Det anbefales å teste innstillingene med et referanselysbilde før evaluering.<ol>
<li>Bildeanskaffelse: Bruk et 40x tørt mål for avbildning. Hvis du vil oppnå sammenlignbar bildekvalitet i alle celler, setter du kameraintegreringstiden til automatisk modus. Sett maksimal integrasjonstid til minst 1 sekund for begge fargekanalene (kameraforsterkning 4.0). Signalkanalen er anskaffet med 10 fokusplan og 14/40 μm mellom planene.</li>
		<li>Cellevalg: PBMCer innenfor et område på 20,00 μm2 og 76,00 μm2 oppdages. Sett maksimal konkavitetsdybde til 0,05 og det maksimale størrelsesforholdet til 1,4. Sett den relative grå nivåterskelen til 20 %.</li>
		<li>Cellebehandling: Behandle DAPI-tellerstainkanalen med en maksimumsalgoritme for histogram for å redusere bakgrunnen. Signalkanalen behandles med et TopHat-filter (styrke 7, utjevningsfaktor 0) for å redusere bakgrunnen og for å forbedre signalene.</li>
		<li>Signaltelling: Tell foci ved hjelp av objekttellingsfunksjonen på enheten. For å unngå falsk positiv evaluering av gjenværende bakgrunnssignaler telles bare de signalene som viser minst 30 % av intensiteten sammenlignet med det lyseste objektet i cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sett inn / plasser lysbilder på den automatiserte skanneplattformen eller skyvetrinnet, etter forsiktig rengjort med 70% etanol, for å fjerne støv.</li>
	<li>Lysbildeoppsett – Åpne dialogmenyen for lysbildeoppsett (Figur 3)<ol>
<li>Velg riktig databane, som angir hvor lysbildefilene som er et resultat av søket, lagres.</li>
		<li>Gi lysbildet et navn, hvert lysbilde må ha et unikt navn. Hvis en serie lysbilder angis i form av en nummerert liste, kan ?-en brukes som jokertegn for lysbildenummeret.</li>
		<li>Velg riktig klassifiserer, som beskrevet i pkt. 1.1 - 1.4 (Figur 4).</li>
		<li>Velg søkevinduet og velg Forhåndsdefinert hvis det finnes en søkevindudefinisjon som samsvarer med cytocentrifuge-cellesirkelen, velger den respektive definisjonen i Størrelse-kolonnen eller velger Manuell hvis det ikke finnes noen forhåndsdefinert definisjon av søkevinduet. I dette tilfellet trenger ikke Størrelse-kolonnen å angis.</li>
		<li>Velg Maksimalt celleantall, og legg til maksimalt antall celler som må skannes. Søket avsluttes selv om det valgte søkevinduet ennå ikke er skannet fullstendig så snart maksimalt celleantall er nådd. For biodosimimetriapplikasjoner er automatisert skåring av 1000 celler per lysbilde tilstrekkelig, med tanke på at 3 lysbilder per blodprøve er forberedt. Klikk OK for å bekrefte innstillingene.</li>
	</ol></li>
	<li>Oppsett av lysbildeskanning<ol>
<li>Klikk Søk-knappen på sidelinjen. Hvis innstillingen Manuelt søkevindu ble valgt i lysbildeoppsettet, åpnes en dialog som gjør det mulig å bestemme skanneområdet (Figur 5). Ved å bruke 10x-målsettingen velger du det rektangulære søkeområdet på lysbildet interaktivt ved å rette to hjørner av søkefeltet ved å venstreklikke på musen. Dette kan bekreftes med OK-knappen. Hvis søkevinduet refererer til et forhåndsdefinert søkevindu, utelates dette trinnet.</li>
		<li>Brukeren blir bedt om å justere en fokusstartposisjon. Et referanseobjekt velges deretter automatisk, og programvaren ber brukeren om å fokusere og midtstille en referansekjerne (ved hjelp av 40x-målet) for hvert lysbilde og bekrefte innstillingene med OK. Systemet flyttes automatisk til alle lysbilder sekvensielt. Juster om nødvendig Live Image Setup - Integration Time for dette trinnet ( Figur5).</li>
		<li>Kontroller alle mikroskopinnstillinger, og bekreft systemmeldingen med OK. Systemet vil starte den automatiserte fokuserings- og skanneprosedyren. Når skanningen er fullført, lagres dataene på datamaskinen for analyser. Skannesystemet slås automatisk av etter at skanningen er fullført. MERK: Kontroller at spaken på mikroskoprøret er i en posisjon som avleder alt lys til kameraet.</li>
		<li>Søket avsluttes hvis hele søket er skannet, hvis maksimalt celleantall er nådd eller hvis søket er avbrutt.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse av lysbilder MERK: Den fullførte skanningen vises i figur 6.<ol>
<li>Når skanningen er fullført, klikker du Galleri-knappen på sidefeltet. Se gjennom galleriet, som består av små bilder av oppdagede celler. I dette vinduet (Figur 7) angir du om cellene som er lagret i galleriet, skal velges fra en rullegardinmeny. Celler vises vanligvis i den rekkefølgen de er oppdaget.</li>
		<li>Klikk på Kvalitets histogram/funksjonsverdidiagram (figur 8) for å gi fordelingen av kvalitetsmålet for de oppdagede cellene, samt midler og standardavviket for foci-skår.</li>
	</ol></li>
</ol>

C. Schunck er ansatt i MetaSystems Hard &Software GmbH, Altlussheim, Tyskland.

Denne protokollen beskriver en trinnvis prosedyre for den automatiserte fluorescerende mikroskopibaserte skåringen av γ-H2AX foci-analysen. Den illustrerer nytten av foci-analysen som en tidseffektiv metode for å analysere antall strålingsinduserte DNA DSB i perifere blodlymfocytter for å utføre en biologisk dosevurdering i et strålingsulykkesscenario der individer kan bli utsatt for ukjente nivåer av IR.
I denne spesifikke protokollen ble PBMCer bestrålet in vitro for å etterligne en in vivo-strålingseksponering. Når bestrålingen og inkubasjonstiden på en time er fullført, lages lysbilder ved hjelp av en cytocentrifuge for å skape et konsentrasjonssted for celler på lysbildet. Bruken av en cytocentrifuge er avgjørende for å oppnå standardiserte forhold for automatisert scoring. Når den er ferdig, brukes en hydrofob penn til å lage en sirkel rundt cellene, for å redusere svinn av reagenser ved å la brukeren lokalisere fargereagensene. Denne typen penn kan brukes i ulike immundempende teknikker som på parafinseksjoner, frosne seksjoner og cytologipreparater. Videre er det viktig å velge en hydrofob penn som er kompatibel med enzym- og fluorescerende baserte deteksjonssystemer. Etter lysbildeforberedelse oppstod fiksering og immunfluorescens γ-H2AX farging. I denne protokollen er cellene løst ved hjelp av 3% PFA i en PBS-løsning i 20 minutter. For at immunoppnåelse skal lykkes, er det viktig at morfologien til cellene beholdes og at de antigene stedene er tilgjengelige for deteksjonsreagensene som brukes. PFA er et relativt skånsomt middel for fiksering og stabiliserer celler samtidig som proteinstrukturer bevares51. Optimaliseringsforsøk med høyere PFA-konsentrasjoner og lengre fikseringstider resulterte i en negativ innvirkning på lysbildekvaliteten, men videre lagring (over natten) på 0,5% PFA opptil 24 timer ga gode resultater.
Det primære monoklonale antistoffet fra 2F3 som brukes i denne protokollen reagerer på histonevarianten H2AX når fosforyleres ved Serine 139 etter DNA DSB-induksjon. Antistoffet er i stand til å binde seg til fosforylater uten kryssreaktivitet med andre fosforylaterte histoner52. Siden dette er et primært monoklonalt antistoff for mus, ble et sekundært antistoff valgt mot vertsartene til det primære antistoffet mens det ble reist i en alternativ vert, nemlig esel-antimus (DAM)-TRITC. Mens immunfluorescerende farging er basert på spesifikk antistoff-epitopbinding, kan flere intermolekylære krefter også resultere i ikke-spesifikk bakgrunnsfarging. For å redusere ikke-spesifikk binding er det viktig å bruke et blokkerende reagens i immunfluorescerende fargingsprotokoller53; vi brukte en BSA-løsning. Videre bør tilstrekkelig tid tildeles dette blokkeringstrinnet ved å la lysbildene stå i løsningen i minst 20 minutter før primær og sekundær antistofffarging. I tillegg bør BSA-løsningen også brukes som fortynningsmiddel for de primære og sekundære antistoffene. Avhengig av anti-γ-H2AX og sekundært antistoff som brukes til farging, bør man vurdere å teste forskjellige antistofffortynninger for å bestemme den optimale konsentrasjonen. For mer presis scoring kan en dobbel farging utføres ved å legge til ytterligere DNA DSB reparasjon protein antistoffer.
En stor ulempe ved denne typen analyse er behovet for å skaffe blodprøver så snart som mulig etter eksponering, da maksimalt antall foci er kjent for å redusere tilbake til normale nivåer innen 48 timer etter bestråling. Derfor, når tidspunktet for strålingsulykke og påfølgende blodprøvetaking er kjent, kan det være nyttig å arbeide med forskjellige kalibreringskurver som er etablert på forskjellige tidspunkter etter in vitro bestråling (f.eks. 4, 8, 12 og 24 timer). Men som allerede nevnt i introduksjonsdelen av manuskriptet, ligger styrken til den γ-H2AX foci-analysen i innledende, raske triageformål, og den bør brukes til å prioritere mer tidkrevende cytogenetisk biologisk dosimetri. Et kombinert scenario der flere biodosimimetribiomarkører brukes parallelt, vil generere den mest pålitelige doseestimering og ulike biodosimetrilaboratorier over hele verden har gått sammen om å sette opp landsomfattende nettverk som kan aktiveres og brukes til å tillate flere parallelle biodosimetry vurderinger av laboratorier med forskjellig kompetanse37,54,55 . I tillegg pågår utviklingen for superrask analyse som et mobilt laboratorium på eller i nærheten av ulykkesstedet56. Nye, lovende biodosimimetrimetoder utvikles kontinuerlig, noe som forhåpentligvis vil resultere i enda raskere og mer pålitelig gjennomstrømning i fremtiden57.
For det automatiserte bildeanalysesystemet settes lysbilder inn eller plasseres på den automatiserte skanneplattformen eller lysbildetrinnet. Deretter gir du lysbildedetaljene et navn og lagrer dem i riktig mappe på den tilkoblede datamaskinen. For dette eksperimentet er automatisert kjerner og foci-deteksjon basert på de respektive klassifisererinnstillingene. Når du oppretter en klassifiserer, må du kontrollere at de valgte klassifisererinnstillingene samsvarer med gjeldende celletype, tilberedningsbetingelser og immunfluorescerende farging av prøven. Passende fluorescerende kanaler som samsvarer med eksitasjonsspekteret til de primære og sekundære antistoffene, er satt i klassifisereren. Klassifisereren gjør det mulig å angi flere poengparametere om nødvendig (f.eks. kjernestørrelse, fluorescerende intensitet, som beskrevet i avsnitt 6.1). Hvis to eller flere DNA-reparasjonsproteiner (f.eks. γ-H2AX og 53BP1) kombineres i et eksperiment, er systemet også i stand til å oppdage samlokaliseringer av signaler. For det første kjøper systemet DAPI-bilder, bruker bildebehandling og identifiserer kjerner ved hjelp av morfologiske kriterier som er angitt i klassifisereren. TRITC-signalene innhentes ved hjelp av 10 z-stabler med en trinnstørrelse på 0,35 mm mellomfokusplanene 47. Klassifisereren brukte Direct Foci Count, der antallet distinkte TRITC-signaler i kjernene scores. Her er det viktig å ta hensyn til at med økende strålingsdose har foci-signaler en tendens til å fusjonere inn i større gjenstander, noe som resulterer i en underestimering av det faktiske foci-tallet hvis objekter telles direkte. Det var ikke nødvendig for analysen som er beskrevet her, men et ekstra trinn med Korrigert Foci Count kan implementeres for å løse dette problemet. Sistnevnte gjør at systemet kan oppnå størrelsene på de oppdagede signalene og veier dem deretter. Bruk av begge tellemetodene kan gi en mer realistisk estimering av det faktiske antallet foci ved høyere doser.
For å starte automatisert skanning bestemmes skanneområdet ved å bruke 10x-målet til mikroskopet for å lage et rektangulært søkeområde ved å fikse to hjørner av søkefeltet ved å venstre museklikk (Figur 5), etterfulgt av å fokusere startposisjonen. Referanseobjektet velges automatisk, og programvaren ber brukeren om å fokusere og midtstille en referansekjerne (ved hjelp av 40x-målet) for hvert lysbilde. Når søket har begynt, flyttes systemet til midten av søkevinduet i det første merkede lysbildet, og ber om å midtstille og fokusere referanseobjektet. Dette objektet vil senere bli brukt som en posisjonsreferanse for å korrigere eventuelle skift i cellens plassering. Det andre formålet med referansefeltet er automatisk lysjustering, i overført lysmodus justeres lyset til det optimale lysnivået er nådd. I fluorescensmodus er lysnivået fast, men integrasjonstiden til CCD-kameraet kan økes til det nødvendige signalet måles. For å aktivere riktig lysjustering, bør referansen inneholde gjenstander med typisk farging. Det er viktig å ikke bruke et felt som har artefakter med svært høy fargeintensitet. Etter lysjusteringen starter systemet autofokuset for rutenettet nærmest referansefeltet. Det fortsetter å fokusere felt på et vanlig rutenett, beveger seg i en meander mot forsiden og baksiden av søkevinduet. Skanningen begynner når autofokusen for rutenettet er fullført. Fasen flyttes i et meandermønsterfelt etter felt for å registrere data. Når en celle oppdages, lagres plasseringen og galleribildet på skjermen, og celleantallet oppdateres. Hvis det oppstår en mikroskop-, stadium- eller materfeil, avbrytes søket automatisk. Det eneste trinnet der det er en manuell inngripen fra operatøren, er under lysbildeskanningsoppsettet. Dette er også punktet der en rask kvalitetskontroll finner sted (luftbobler, lave celletall, falming av fluorescerende signalfargingsgjenstander) og hvor det kan bestemmes å avbryte skanningen av et lysbilde av dårligere kvalitet. Et søk avsluttes hvis hele lysbildet er skannet, hvis maksimalt celleantall er nådd, eller hvis søket er avbrutt. Når skanningen er fullført, presenteres dataene som vist i Figur 6. Hvis du vil vise skannede celler, åpnes Galleri-vinduet, og hver celle kan vises (Figur 7). Dette er et annet punkt der operatøren kan utføre en kvalitetskontroll ved å kontrollere fokuset på galleribildene og totalt antall celler som er scoret. Hvis for mange celler er ute av fokus eller for lite celler ble oppdaget av systemet for å gjøre en realistisk doseestimering (f.eks. 100 celler i stedet for de tiltenkte 1000 cellene), bør beslutningen tas for å utelukke lysbildet og den automatiske poengsummen fra den endelige evalueringen. Alle data summeres i histogrammer (Figur 8), sammen med informasjon om fordelingen, midlene og standardavviket for foci-poeng for hver celle. Histogrammene kan også brukes til å velge og vise underpopulasjoner av kjerner basert på de automatiserte funnene for gjennomgang. Statistiske analyser av resultatene utføres etter at fordelingen, gjennomsnittet og standardavviket for antall foci per celle er registrert manuelt. Grafen kan brukes som en kalibreringskurve for å lage en doseestimering av en biodosimimetriprøve. Dette kan gjøres ved hjelp av ligningen av trendlinjen for å gjøre en omtrentlig estimering av den mottatte dosen. Dessuten Figur 9 illustrerer at den automatiserte skanningen er følsom nok til å oppdage foci indusert ved lave doser. Videre viser resultatene en klar lineær økning av antall foci per celle med dose. Det skal bemerkes at resultatene bare er representative for den brukte klassifisereren, resultatene vil variere for forskjellige klassifisererparametere. Derfor, i tilfelle en biodosimimetrianalyse, er det viktig at samme klassifiserer og lysbildeforberedelse brukes til biodosimetriprøvene som de som er brukt til å etablere kalibreringskurven som brukes til å utføre doseestimering. Selv om det var utenfor omfanget av denne studien, er det viktig å merke seg at γ-H2AX foci-analysen også kan brukes til å bestemme delvis kroppsbestråling. De fleste utilsiktede strålingseksponeringer er inhomogene eller delvise kroppseksponeringer, hvor bare en lokalisert region i kroppen fikk en høy dose eksponering. Flere studier illustrerte at det er mulig å bruke γ-H2AX foci-analysen til å estimere brøkdelen av kroppen som har blitt bestrålet og dosen til den bestrålede fraksjonen42. Når en helkroppsbestråling finner sted, vil det være tilfeldig induksjon av DNA DSB i alle celler, og man kan forvente å finne en Poisson-distribusjon. I likhet med cytogentiske metoder der induksjon av kromosomale avvik har en tendens til å være overspredning i perifere blodlymfocytter der det er en høy overflod av celler med flere avvik og celler med normale metafaser, dispersjonsanalyse av γ-H2AX-foci ved hjelp av en forurenset Poisson-metode foreslått over spredte foci-distribusjoner58. Sistnevnte ble også bekreftet hos in vivo eksperimenter med minipigs og rhesus macaque59.

Siden oppdagelsen har ioniserende stråling (IR) blitt et uunnværlig verktøy i dagens medisinske og industrielle praksis, så vel som i landbruks- og militære applikasjoner. Imidlertid øker den brede bruken av IR også risikoen for strålingsovereksponering for både profesjonelle strålingsarbeidere så vel som publikum. IR er et velkjent fysisk kreftfremkallende middel som kan forårsake DNA-skade på en direkte eller indirekte måte, noe som fører til betydelig helserisiko 1,2. Derfor er det viktig å utføre en dosevurdering, siden eksponeringsgraden danner et viktig første skritt i håndteringen av strålingsulykken 1.
Ved store kjernefysiske eller radiologiske nødsituasjoner kan antall dosevurderinger som må utføres variere fra noen få til tusenvis av mennesker avhengig av størrelsen på ulykken3. I disse scenariene kan fysisk dosimetri også være tvetydig (f.eks. hvis dosimeteret ikke brukes riktig) eller utilgjengelig, når publikum er involvert. Mens kliniske symptomer kan brukes til triage, er de ikke nødvendigvis strålingsspesifikke og kan resultere i en falsk diagnose. Derfor er det tilrådelig å bruke biologisk dosimetri sammen med fysisk dosimetri og kliniske vurderinger. Denne metoden tillater analyse av strålingsinduserte endringer på cellulært nivå og muliggjør utvetydig identifisering av eksponerte personer som trenger medisinsk behandling4. Legen kan deretter bruke denne biologiske dosevurderingen til å utfylle fysiske doserekonstruksjoner og andre kliniske diagnoser, for å foreskrive riktig medisinsk behandling5. Behovet for biologisk dosimetri vil være spesielt høyt for triage og medisinsk styring av tap når eksponeringsscenarioet ikke er kjent og når ofrene er medlemmer av offentligheten. Hovedformålet med triage er å effektivt skille mellom "bekymret godt" personer, som kunne ha prodromale symptomer, men som ikke fikk en høy dose, fra utsatte personer som trenger øyeblikkelig medisinsk hjelp og spesialisert omsorg. Terskelnivået for strålingsdose som kan forårsake strålingssykdom er ca. 0,75 - 1,00 Gy. Deretter har de individer som mottar > 2 Gy eksponering høyere risiko for akutt strålingssyndrom og bør få rask medisinsk behandling6,7. Tidlig og nøyaktige biologiske doseestimater for ofre fanget i kryssilden av slike katastrofer er kritiske. I tillegg kan det også trøste og berolige minimalt eksponerte ofre8.
Strålevernmyndigheter bruker ulike biodosimimetrimarkører, som hovedsakelig er basert på påvisning av cytogenetisk skade, som terningkaster eller mikronuklei, i dyrkede menneskelige lymfocytter9. Påvisning av cytogenetisk skade kan også utføres av fluorescerende in situ hybridisering (FISH) translokasjonsanalyse10. Den største ulempen ved de konvensjonelle cytogenetiske metodene er imidlertid den lange behandlingstiden for å oppnå resultatene i en nødsituasjon8.
Et av de tidligste trinnene i DNA DSB-godkjenningsprosessen er fosforylering av histonevarianten H2AX, noe som fører til dannelsen av γ-H2AX, og den påfølgende rekrutteringen av reparasjonsfaktorer. I løpet av det siste tiåret har påvisning av strålingsindusert γ-H2AX-foci i perifere blodlymfocytter ved hjelp av immunfluorescensmikroskopi fått økende oppmerksomhet som et pålitelig biologisk dosimetriverktøy11,12,13,14,15. Avhengig av strålingskvalitet og celletype, oppdages det maksimale utbyttet av γ-H2AX foci innen 0,5 - 1 time etter bestråling16,17. Det forventes at det er en nær sammenheng mellom antall DNA DSB og γ-H2AX foci, samt mellom forsvinningen av foci og DSB reparasjon. Laser saks eksperimenter med en pulserende laser mikrostråle har vist at γ-H2AX foci lokalisere til stedene av DNA DSB18. Mens det fortsatt er et tema for aktiv debatt, foreslo en av de tidligste studiene med 125jeg en en-til-en-sammenheng mellom det beregnede antallet oppløsninger per celle (representabelt for antall strålingsinduserte DNA DSB) og antall γ-H2AX foci som ble scoret19,20.
I løpet av det siste tiåret finansierte EU MULTIBIODOSE-prosjektene (multidisiplinære biodosimetriske verktøy for å håndtere høyskala radiologiske tap) og RENEB-prosjekter (Realizing the European Network of Biodosimetry) for å skape et bærekraftig nettverk innen biologisk og retrospektiv dosimetri.21,22. Dette prosjektet inkluderte ulike laboratorier over hele Europa for å evaluere beredskapsevnen i tilfelle en radiologisk nødsituasjon.14,21,22. Den γ-H2AX foci-analysen har en rekke betydelige fordeler, for eksempel en rask behandlingstid, potensialet for batchbehandling som gir høy gjennomstrømning, samt høy følsomhet hvis den brukes innen få timer etter eksponering.13,23,24. Den høye følsomheten til analysen i lavdoseområdet resulterte i en rekke studier der γ-H2AX foci-analysen ble brukt som en indikator på effekten av medisinsk strålingseksponering, både i strålebehandling og i diagnostiske bildebehandlingsapplikasjoner.25,26,27,28,29,30. Disse egenskapene gjør γ-H2AX foci-analysen til et svært konkurransedyktig alternativ til andre metoder for tidlig triage i store atomulykker for å skille de kritisk eksponerte fra lavrisikopersoner. Flere optimeringseksperimenter har illustrert at det er mulig å utføre γ-H2AX foci-analysen med små mengder blod, for eksempel studiet av Moquet et al. som rapporterte at det er mulig å utføre γ-H2AX foci-analysen med bare en dråpe blod (fingerstikk)31. En lignende tilnærming ble brukt i utviklingen av det helautomatiske rabit-systemet med høy gjennomstrømning (Rapid Automated Biodosimetry Tool) som ble optimalisert for å måle γ-H2AX-utbytter fra fingerstikkavledede prøver av blod32,33. Samlet sett tyder resultatene fra multibiodose- og RENEB-intersammenligningsstudiene på at den γ-H2AX foci-analysen kan være et svært nyttig triageverktøy etter en nylig (opptil 24 timer) akutt strålingseksponering12,13,14. I en intersammenligningsstudie med lav doseområde kan en dose på så lavt som 10 mGy skilles fra de sham-bestrålede kontrollprøvene, noe som fremhever analysens følsomhet i lavdoseområdet34. Det er viktig å merke seg at analysens høye følsomhet er spesielt sant for lymfocytter, noe som gjør dem til en av de mest egnede celletypene for evaluering av lavdoseeksponeringer. Lymfocytter er hovedsakelig ikke-sykling celler og representerer en synkron befolkning. Sistnevnte unngår uttrykk for γ-H2AX er forbundet med DNA-replikasjon, noe som reduserer analysens følsomhet betydelig for å oppdage strålingsindusert DSB under G2 og S-fase av cellesyklusen.35. I tillegg til følsomheten for lave doser for lymfocytter, er behandlingstiden til γ-H2AX foci-analysen betydelig raskere enn cytogenetiske teknikker som terningkast og mikronukleusanalyse, siden det ikke krever stimulering av lymfocytter. Derfor kan resultatene oppnås i løpet av få timer sammenlignet med et par dager for cytogenetiske teknikker. En stor ulempe med analysen er den raske forsvinningen av γ-H2AX-foci-signalet, som normalt vil bli redusert til baseline nivåer innen dager etter strålingseksponeringen avhengig av DNA-reparasjonskinetikken.36. Derfor er den mest egnede anvendelsen av analysen i en biodosimimetrikontekst for innledende triageformål og for å prioritere mer tidkrevende cytogenetisk biologisk dosimetrioppfølging for visse ofre. Men for presis retrospektiv biodosimetri og langsiktige effekter, må man stole på cytogenetiske teknikker som trefargers FISKE-analyser for påvisning av stabile kromosomale avvik i tilfelle eksponeringen fant sted for flere år siden.10.
Som en del av flere biodosimetære initiativer har flere analyser blitt evaluert for triage formål ved siden av γ-H2AX foci analyse til triage mennesker i store radiologiske nødsituasjoner; som terningnøttanalysen, cytokinesis-blokkmikronukleusanalysen, elektron paramagnetisk resonans (EPR), serumproteinanalyse (SPA), hudflekkanalyse (SSA), optisk stimulert luminescens (OSL), samt genuttrykksanalyse 37,38. Den γ-H2AX foci-analysen kan brukes kvantitativt til evaluering av DNA DSB-dannelse og reparasjon39. Analysen er imidlertid tidsavhengig ettersom nivået av γ-H2AX foci varierer med tiden etter bestråling på grunn av DNA DSB reparasjon kinetikk40. En komparativ studie illustrerte at mikroskopisk skåring med z-trinns kapasitet gir de mest nøyaktige resultatene etter 1 Gy bestråling, mens strømningscytometri bare gir pålitelige resultater ved høyere doser av IR41. Det finnes mange rapporter om utviklingen av bildeanalyseløsninger for bruk i automatisertpoengregning 42,43,44,45,46. I denne protokollen brukes en automatisert fluorescerende mikroskopiplattform med høy gjennomstrømning til å analysere γ-H2AX-fokus i perifere blodlymfocytter. Bruken av et automatisk poengsystem unngår både interlaboratorium og inter-observatør scoring bias, mens det fortsatt tillater nok følsomhet til å oppdage doser under 1 Gy47. Den viktigste fordelen med dette systemet sammenlignet med gratis åpen kildekode-programvare for foci-scoring er det faktum at hele prosessen fra skanning av lysbilder til opptak og scoring er automatisert. Konseptet med brukerdefinerbare og lagringsbare klassifiserere garanterer reproduserbarhet som gir en objektiv grad av kvalitet til resultatene. Derfor illustrerer dette arbeidet hvordan γ-H2AX foci resultater kan oppnås ved hjelp av en automatisert mikroskopisk skannings- og poengmetode som kan brukes når blodprøver fra potensielt overeksponerte individer mottas av radiobiologiske laboratorier for biologiske dosimetriformål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin - BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips (Size 24 x 50 mm)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td>Glass2C29M2450Rec</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials (1.2 mL)</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>607101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC370-12-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin Clips</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin filter cards</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin Funnels</td>
			<td>Healthcare Technologies</td>
			<td>JC372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM-TRITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A16022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-Fluroshield</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Kimix</td>
			<td>ETD901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>&#160;200ul (312012) and 1000ul (313012)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid- HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium&#8211;heparin collection tubes</td>
			<td>The Scientific Group</td>
			<td>367526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaSystems - Metafer</td>
			<td>Metasystems</td>
			<td>Azio Imager Z2: 195-041848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoPen</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-PEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline Tablets</td>
			<td>Separations</td>
			<td>SH30028,02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>P11037 and P1033</td>
			<td>X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45&#176; angles to help reduce glass breakage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613402 / 100 &#956;g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>BE12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (15ml)</td>
			<td>WhiteSci</td>
			<td>601002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Tra adhesive slides &#8211; corner clipped</td>
			<td>SMM Technologies</td>
			<td>3800200E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated microscopic scoring method for the &#947;-h2ax foci assay in human peripheral blood lymphocytes

Ioniserende stråling er en potent induser av DNA-skade og et veldokumentert kreftfremkallende middel. Biologisk dosimetri omfatter påvisning av biologiske effekter forårsaket av eksponering for ioniserende stråling for å gjøre en individuell dosevurdering. Dette er relevant innenfor rammen av strålingskriser, der helsevurderinger og planlegging av klinisk behandling for utsatte ofre er kritisk. Siden DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSB) anses å være den mest dødelige formen for strålingsindusert DNA-skade, presenterer denne protokollen en metode for å oppdage DNA DSB i blodprøver. Metodikken er basert på påvisning av et fluorescerende merket fosforylatert DNA-reparasjonsprotein, nemlig γ-H2AX. Bruken av en automatisert mikroskopiplattform for å score antall γ-H2AX foci per celle tillater en standardisert analyse med en betydelig reduksjon i snutiden. Derfor har γ-H2AX-analysen potensial til å være en av de raskeste og sensitive analysene for biologisk dosimetri. I denne protokollen vil hele blodprøver fra friske voksne frivillige bli behandlet og bestrålet in vitro for å illustrere bruken av den automatiserte og sensitive γ-H2AX foci-analyse for biodosimetriapplikasjoner. Et automatisert lysbildeskanningssystem og analyseplattform med et integrert fluorescensmikroskop brukes, noe som gjør det mulig med rask, automatisk skåring av DNA DSB med redusert grad av skjevhet.

For denne protokollen ble humane perifere blodmonykleære celler (PMBCer) isolert fra hele blodet av fire friske voksne frivillige og ble utsatt for strålingsdoser på 0,125, 0,250, 0,500, 1.000 og 2.000 Gy. Deretter ble prøvene inkubert i 1 time ved 37 °C i en fuktet 5 % CO 2-inkubator. Etter fiksering og immunfluorescensfarging skannes og scores lysbildene automatisk. Figur 6, 7 og 8 gir en representasjon av hva programvaren sender ut til brukeren. Et analysevindu vises når skanningen er fullført, noe som gir en oversikt over foci-poengene. Galleriet gir alle foci scoret med en interaktiv meny som kan slette outliers og til slutt et histogram med et detaljert datasammendrag er gitt.
Foci-utbyttet γ-H2AX etter eksponering for γ-stråler er presentert i figur 9. Det var en gradvis økning i antall γ-H2AX foci med økende dose. Denne grafen illustrerer ikke bare doseavhengigheten og følsomheten til analysen, men passformen kan også brukes til å utføre en doseestimering når en prøve mottas fra en person som har blitt utsatt for en ukjent dose. Det er viktig å merke seg at man ikke vil ha sham-bestrålet kontroll eller bakgrunnsfokus for denne personen. Derfor inkluderer figur 9 0 Gy-verdien av de sham-bestrålede kontrollprøvene, som var 0,57 ± 0,23 Gy for de fire voksne giverne i denne studien.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig01.jpg"> Figur 1: Tilberedning av skred forcytosentrifugering. Plasser lysbildet i klipsholderen, legg til filterkortet oppå det, og til slutt trakten. Fest glideklipsene og plasser dem i cytocentrifugen. Etter cytocentrifugation fjerner du lysbildet fra klipsholderen og tegner en sirkel rundt stedet med cellene ved hjelp av en hydrofob penn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig02.jpg"> Figur 2: Den automatiserte skanneplattformen som ble brukt i denne protokollen, som inneholder en automatisert skanner festet til et fluorescerende mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig03.jpg"> Figur 3: Meny for lysbildeoppsett. Åpne dialogen ved å klikke oppsettknappen i sidepanelet. Velg eller angi målkatalogen for resultatfilene <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig04.jpg"> Figur 4: Meny for klassifisereroppsett. Kontroller at de valgte klassifisererinnstillingene samsvarer med gjeldende celletype, forberedelsesbetingelser og fargemønstre i eksemplet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig05.jpg"> Figur 5: Oppsettmeny for manuelt søkevindu. Vinduet ble valgt i lysbildeoppsettet. det åpnes en dialog som åpner for fastsettelse av skanneområdet. Ved å bruke 10x-målet velges det rektangulære søkeområdet på lysbildet interaktivt ved å feste to hjørner av søkefeltet ved å venstreklikke på musen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig06.jpg"> Figur 6: Analysevindu, når skanningen er fullført, viser analysevinduet resultatene av skanningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig06large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig07.jpg"> Figur 7: Gallerivisning for det valgte lysbildet. Du finner kategorien Galleri i sidefeltet. Bildegalleriet består av små bilder av cellene som oppdages, og vises som et kombinert DAPI-TRITC-bilde. Nederst til venstre og høyre i hvert bilde vises antall direktefokus og de korrigerte foci-tellingene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig08.jpg"> Figur 8: Histogrambilder for det merkede lysbildet. Dette vinduet åpnes ved å høyreklikke histogrammet. Ved å klikke på histogrammet inneholder histogramfanearket et datasammendrag som viser gjennomsnittet, standardavviket, variasjonskoeffisienten, minimums-, maksimums- og medianverdiene til de analyserte cellene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62623/62623fig09.jpg"> Figur 9: Antall γ-H2AX foci som dosefunksjon for lymfocytter eksponert for 60Co γ-stråler. Feilfeltene er standardavvikene som representerer den interindividuelle variasjonen blant giverne. Data representerer gjennomsnittlig antall γ-H2AX foci ± standardavvik for fire friske frivillige. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62623/62623fig09large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃŽÂ³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes at JoVE.com

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

Denne protokollen presenterer lysbildeforberedelsen og automatisert scoring av γ-H2AX foci-analyse på perifere blodlymfocytter. For å illustrere analysens metode og følsomhet ble isolerte lymfocytter bestrålet in vitro. Denne automatiserte metoden for DNA DSB-deteksjon er nyttig for raske og høygjennomstrømningsbiologiske dosimetriapplikasjoner.

En automatisert mikroskopisk scoringsmetode for γ-H2AX Foci-analysen i humane perifere blodlymfocytter

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Jeg heter Dr.Shankari Nair, og jeg er postdoktor ved strålebiofysikkavdelingen i nukleærmedisinsk avdeling ved NRF, iThemba LABS. I denne videoen vil vi demonstrere bruken av en automatisert Gamma H2AX foci-analyse på humane perifere blodlymfocytter for bruk i batchsymmetriapplikasjoner. Strålingsrisikoen for personell er strengt kontrollert.Ioniserende stråling påvirker DNA-strukturen direkte ved å fremkalle DNA-brudd. Spesielt dobbeltstrengspauser. Et av de tidligste trinnene i DNA-prosessen for godkjenning av dobbeltstrengsbrudd er fosforiiseringen av histonevarianten H2AX og rekruttering av reparasjonsproteiner.Denne videoen vil skissere bruken av mikroskopi for å score antall Gamma-H2AX foci ren-nucleus ved hjelp av et automatisert lysbildeskanningssystem og analyseplattform, integrere det fluorescerende mikroskopet. Lymfocytter er isolert fra fullblod. Fortynn hele blodet med PBS i et en-til-en-forhold, legg deretter forsiktig det fortynnede blodet på ett volum tetthetsgradientmedium.Lag blodet gradvis ved å holde røret skrått ved 45 grader. Overfør suspensjonen til en sentrifuge og spinn ved romtemperatur i 20 minutter ved 900 G.Etter sentrifisering vil fire lag dannes. Overfør forsiktig det overskyete laget som inneholder lymfocyttene til et nytt sterilt konisk rør.Vask lymfocyttene med PBS og tell ved hjelp av et hemocytometer. Når det totale antallet lymfocytter er bestemt, fortynn lymfocytten og suspensjonen til en konsentrasjon på ca. 800 000 lymfocytter i en milliliter fullstendig RPMI. Prøvene og er klare for vår stråling.Lymfocyttene bestråles med gammastråler fra en kobolt 60-kilde, og deretter inkuberes i en time ved 37 grader Celsius i en fuktet 5% karbondioksidinkubator. For hver bestrålingstilstand eller rør fremstilles tre lysbilder. Plasser skyv inn i klipsholderen, etterfulgt av filterkortet, og til slutt trakten.Fest glideklipsene og plasser dem i cyto-sentrifugen. Tilsett 250 mikroliter av cellefjæringen på hver trakt og spinn i 30 G i fem minutter. Bruken av cyto-sentrifugen er viktig for å få standardiserte forhold på lysbildeautomatiseringen.Når du er spunnet, fjern lysbildene fra klipsen og bruk deretter den hydrofobe pennen, tegn en sirkel rundt stedet der cellene er. Nå som lysbildene er laget, må cellene festes til lysbildet slik at immunfluorescerende farging kan oppstå. Cellene er festet ved hjelp av en 3% paraformaldehyd, eller PFA, og en PBS-løsning i 20 minutter.Etter fiksering vaskes lysbilder i en Coplin krukke med PBS i fem minutter. Dekk deretter cellene med Triton X for å tillate permeabilisering. Permeabiliseringstrinnet fjerner flere cellulære membranlipider for å tillate antistoffer å komme inn i cellekjernen.Herfra og fremover bruker vi en blokkeringsløsning laget av 1% BSA i PBS, for å vaske lysbilder for å redusere potensiell ikke-spesifikk binding. Etter tre vasketrinn på 10 minutter med 1% BSA og PBS, inkuberes lysbildene ved romtemperatur med ett til 500 primært anti-gamma H2AX-antistoff i en time i det fuktige kammeret, lett oppnådd ved å legge til vått vevspapir ved foten av den rektangulære skyvelagringsboksen. Etter inkubasjon med et primært antistoff, tipp av væsken og vask lysbilder igjen i en 1% BSA-løsning.Inkuber lysbilder med en en-til-tusen fortynnet sekundær esel anti-mus TRITC antistoff i en time i det fuktige kammeret. Fjern antistoffet før du utfører tre, 10-minutters vask i PBS. Dekk Coplin-krukken i aluminiumsfolie for å forhindre eksponering for lys i løpet av vasketrinnene.Fjern lysbildene og tørk av overflødig PBS utenfor den hydrofobe sirkelen med støvfritt vevspapir. Til slutt, legg til en til to dråper DAPI resulterte i å anskaffe monteringsmediet og forsiktig dekke lysbildene med dekselslippet. Forsikre deg om at det ikke er fanget luftbobler og lagre prøver på et mørkt sted ved fire grader celsius over natten.Tørk lysbildene forsiktig med en 70 % etanol og plasser lysbilder på den automatiserte skanneplattformen, eller lysbildetrinnet, festet til zite-aksiale bilder ZED-2-mikroskopet. Velg klassifiseringsoppsettet under MetaCyte-fanen for å redigere klassifisereren. Den valgte klassifisereren vil bli brukt av systemet til å skanne og score lysbildene, og er basert på et sett med forhåndsdefinerte parametere, som bestemmer hvordan systemet velger celler og scorer foci.Klassifisereren kan optimaliseres og trenes basert på en rekke forhåndsklassifiserte bildefelt. Avhengig av mikroskopforstørrelse, typen og antistoffer som brukes til farging, kan en annen klassifiserer optimaliseres. Derfor varierer klassifisererne generelt fra laboratorium til laboratorium, men vi vil gi en oversikt over de mest grunnleggende trinnene som tas for å vurdere når et klassifisereroppsett må justeres.Under Capture'tab kan man finne filteret som skal brukes, her DAPI og TRITC, med en maksimal integrasjonstid på 1,04 sekunder. Sistnevnte er basert på den opprinnelige klassifisereren som ble levert av selskapet og senere justert for antistoffintensiteten og bakgrunnsgamma H2AX, eller TRITC-signalet, i denne spesifikke celletypen, nemlig lymfocytter. Under Eksponering-fanen er minimum integrasjonstid definert.Klassifisereren forblir alltid innenfor minimum og maksimal integrasjonstid, noe som forhindrer over- eller undereksponering av lysbildet. Under kategorien Cellemerking ble minimums- og maksimumsobjektområdene definert basert på størrelsen og formen på cellene som analyseres. For eksempel er den forhåndsbestemte konkavitetsverdien og størrelsesforholdet spesifikke for lymfocytter, som generelt har runde former.Under Kategorien Funksjoner kan du endre galleriet og histogramvisningen, i tillegg til å bestemme hva mikroskopet må score. Systemet kan score mange elementer, avhengig av funksjonene brukeren har valgt. Et eksempel er terskelen for hvordan programvaren scorer individuelle objekter.Når en passende klassifiserer er identifisert, velger du oppsettet i sidefeltet og gir hvert lysbilde et unikt navn, etterfulgt av valg av riktig klassifiserer. Velg Maksimalt celleantall, og legg til maksimalt antall celler som må skannes. Søket avsluttes selv om det valgte søkevinduet ennå ikke er skannet fullstendig, så snart maksimalt celleantall er nådd.For bio-dissymmetry applikasjoner, automatisert scoring av 1000 celler per lysbilde er tilstrekkelig, vurderer at tre lysbilder per blodprøve er utarbeidet. Klikk OK for å bekrefte innstillingene. Hvis du vil skanne lysbilder, velger du Søk i sidepanelet.Hvis innstillingen Manuelt søkevindu er valgt i lysbildeoppsettet, åpnes en dialogboks for fastsettelse av skanneområdet. Ved å bruke 10-ganger-målet merkes det rektangulære søkeområdet på lysbildet interaktivt ved å rette to hjørner av søkefeltet ved å venstreklikke på musen. Dette kan bekreftes med OK-knappen.Juster en startposisjon for fokus. Programvaren vil be om fokus og midtstille en referansekjerne ved hjelp av 40 ganger objektivet for hvert lysbilde og bekrefte innstillinger med OK. Systemet flyttes automatisk til alle sider sekvensielt. Juster om nødvendig Live Image Setup'og Integration Time'for dette trinnet.Kontroller alle mikroskopinnstillinger. Kontroller at spaken på mikroskoprøret er i en posisjon som avleder alt lys til kameraet og bekreft systemmeldingen med OK. Systemet starter rutenettets autofokus på rutenettposisjonen nærmest referansefeltet. Det fortsetter å fokusere felt på det vanlige rutenettet, beveger seg i en meander mot forsiden og baksiden av søkevinduet.Skanningen begynner når rutenettets autofokus er fullført. Fasen flyttes i et meandermønsterfelt etter felt for å registrere data. Når en celle oppdages, plasseres den, og galleribildet lagres og vises på skjermen, og celleantallet oppdateres.Søket avsluttes hvis hele søket er skannet, hvis maksimalt celleantall er nådd, eller hvis søket er avbrutt. Når skanningen er fullført, høyreklikker du på linjen nederst og åpner en prøve. Se gjennom galleriet, som består av små bilder av oppdagede celler.I dette vinduet kan du spesifisere cellene som er lagret i galleriet via kriterium som skal velges fra rullegardinmenyen. Celler vises vanligvis i den rekkefølgen de er oppdaget. Klikk på Kvalitets histogram'eller Funksjonsverdidiagram'for å gi fordelingen av de oppdagede cellene, samt midler, og standardavviket for foci scoret.Her sammenligner vi de nullgrå versus 1,5 grå prøvene. Dette er vanligvis et kontrolllysbilde, med en gjennomsnittsverdi på 0,124 foci per celle, der cellen ikke har blitt bestrålet. I en bio-dissymmetry kontekst vil dette indikere at en person ikke har blitt utsatt for en høydosestråling.I grafen kan vi se at flertallet av cellene har nesten null foci per celle, og det er ingen side av normalfordeling. Når vi sammenligner dette med en dose på 1,5 grå, kan det tydelig ses at dette er en bestrålet prøve. I en bio-dissymmetry kontekst er denne normale fordelingen et tydelig tegn på at prøven har vært utsatt for stråling.Den automatiserte skanningen er følsom nok til å oppdage foci-indusert ved lave doser. Resultatene viser en klar lineær økning av antall foci per celle med dose. Den automatiserte metoden for DNA dobbel strand pause deteksjon er nyttig for rask og høy gjennomstrømning biologiske dyssymmetri applikasjoner.Takk for at du så på.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliaca Injection for effektiv og selektiv Modellering av Mikroskopisk Bone Metastase

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musemodell av Fatigue indusert av Peripheral Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Metoder for å vurdere rollen c-Fos og Dusp1 i Oncogene avhengighet

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

Et humant perifert blod mononukleære Cell (PBMC) Engrafted Humanisert Xenograft modell for translational Immuno-onkologi (I-O) forskning

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analysen for å studere tumor-macrophage interaksjon

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

En automatisert differensial kjernefysisk farging analyse for nøyaktig bestemmelse av mititokancytoktoksisitet

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Avbildning av DNA-skade og reparasjon av foci i humane tykktarmskreftceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Påvisning av cellefritt DNA i blodplasmaprøver av kreftpasienter

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolere mononukleære celler i humant perifert blod og CD4+ T-celler fra Sézary Syndrome-pasienter for transkripsjonsomic profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...