Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل مجلس البحوث الأوروبي في إطار منحة برنامج أفق 2020 للبحوث والابتكار التابعة للاتحاد الأوروبي 723106، ومنحة المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (182019)، وEPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PURE+technology.">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).</li><li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li><li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli.">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).</li><li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة بسيطة وفعالة من حيث الوقت والتكلفة لإعداد نظام تعبير PURE متعدد الاستخدامات20 استنادا إلى التركيب القياسي15. باستخدام البروتوكول جنبا إلى جنب مع الجداول اليومية المقدمة (الجدول 1)، يمكن إعداد جميع المكونات في أسبوع واحد وكميات كافية لكمية تصل إلى خمسمائة 10 ميكرولتر من ردود الفعل PURE. منذ البروتينات المستخدمة في هذا البروتوكول هي overexpressed من plasmids نسخة عالية ولها سمية منخفضة لE. القولونية, ويلاحظ مستويات التعبير الجيد لجميع البروتينات المطلوبة (الشكل 1). وهذا يسمح للتكيف السهل للسلالات، وبالتالي أيضا تكوين البروتين في الثقافات المشتركة، وذلك ببساطة عن طريق تعديل نسب سلالات التطعيم20. وإلى جانب البروتينات الريبوسومية، أظهر تركيز EF-Tu أن تكون ذات أهمية أساسية للتعبير الغلة6. في المقابل، كان للتغيرات في تركيز مكونات البروتين الأخرى تأثير منخفض نسبيا على قوة نظام PURE7،24. ولذلك، من خلال تعديل نسبة التطعيم من EF-Tu فيما يتعلق بجميع المكونات الأخرى، يمكن تحقيق تكوين مماثل لتكوين PURE القياسي، ويمكن تحقيق نظام PURE مع عائد مماثل20. في إعداد محلول البروتين، من المهم جدا ضمان نمو جميع السلالات بشكل جيد وفرط التعبير عن البروتين المشفر بعد الحث(الشكل 1).
وظيفة ريبوسوم هو المفتاح للأداء العام للنظام PURE24. في هذا البروتوكول، يتم عرض طريقتين مختلفتين لإعداد محلول الريبوسوم، أي تنقية الريبوسوم الخالية من العلامات والموسومات. ويستند تنقية الريبوسوم خالية من الوسم على الكروماتوغرافيا التفاعل الكاره للماء تليها الطرد المركزي مع وسادة السكروز، الأمر الذي يتطلب الوصول إلى نظام تنقية FPLC ومطاردة مركزية فائقة15. في المقابل، فإن الطريقة التي تستخدم له الموسومة ريبوسومات18 وتدفق الجاذبية تقارب تنقية الكروماتوغرافيا لا يتطلب معدات متخصصة ويمكن القيام بها في معظم المختبرات. ولذلك، فإن الطريقة الأخيرة تجلب مزايا مثل البساطة وسهولة الوصول. ومع ذلك، لاحظنا انخفاض كبير في غلة التوليف عند استخدام الريبوسومات الموسومة به في OnePot PURE مقارنة بالمتغير الخالي من العلامات(الشكل 3). واستنادا إلى نوع التطبيق، قد يكون هذا العائد المنخفض مقبولا.
يوفر محلول الطاقة مكونات الوزن الجزيئي المنخفضة وRNAs المطلوبة لتغذية تفاعلات TX-TL المختبرية. يوفر هذا البروتوكول وصفة لحل الطاقة النموذجية، والتي يمكن تعديلها بسهولة على أساس احتياجات المستخدم. جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي، NTP، والفوسفات الكرياتين، وفرة وتركيز أيونات Mg2+ كانت حاسمة للأداء العام للنظام PURE8،كما أنها عوامل المساعدة الحرجة للنسخ والترجمة. في بعض الحالات، يمكن أن المعايرة الأيونات، وبالتالي، إلى حد كبير تعزيز الأداء العام PURE. سلامة الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لأداء PURE. وهكذا، تسلسل التحقق من المنطقة المروج، موقع الربط ريبوسوم، والجين الهدف وضمان أن تركيز الحمض النووي كافية (<2 nM) سوف تساعد على استكشاف المشكلات التي قد تنشأ أثناء إعداد رد فعل PURE.
نظام PURE هو نظام TX-TL الحد الأدنى، وتطبيقات محددة قد تتطلب بالتالي تعديلات إضافية25. قد تشمل هذه دمج البوليمرات RNAمختلفة 9،26، مرافقين13، وعوامل البروتين مثل EF-P أو ArfA8. على الرغم من أن سلالات التعبير عن هذه البروتينات يمكن تضمينها في الثقافات المشتركة، إضافة كل على حدة إلى النظام المعد قد توفر تحكما أفضل في مستويات البروتين المطلوبة. وعلاوة على ذلك، إدراج الحويصلات أمر ضروري لإنتاج بروتينات الأغشية10،11. أكسدة بدلا من الحد من البيئات والايزوميراز السندات ثنائي الكبريتيد تسهيل تكوين السندات ثنائي الكبريتيد السليم، والتي هي، على سبيل المثال، مطلوبة للبروتينات إفرازي12.
من الضروري التأكد من أن أي مكونات إضافية لا تتداخل مع رد الفعل. يتم سرد أهم العوامل التي يجب الانتباه إليها عند إعداد رد فعل أو إضافة مكونات أخرى أدناه. تأكد من عدم استخدام المخازن المؤقتة غير المتوافقة أو إزعاج تركيزات الأيونات. تجنب المحاليل التي تحتوي على الجلسرين، تركيزات عالية من البوتاسيوم، المغنيسيوم، أيونات الكالسيوم، الأوسموليت، البيرفوسفات، المضادات الحيوية، أو EDTA، قدر الإمكان. على سبيل المثال، يمكن أن يكون استبدال العازلة elution بالماء أثناء تنقية الحمض النووي مفيدة كما EDTA هو المضافة الشائعة في هذا المخزن المؤقت. تزويد الحلول مع جزيئات إضافية مشحونة سلبا مثل NTP أو dNTP يتطلب ضبط تركيز المغنيسيوم8، كما تتصرف الجزيئات المشحونة سلبا كعوامل chelating وربط جزيئات مشحونة إيجابيا. درجة الحموضة المحايدة مثالية لرد الفعل. وبناء على ذلك، ينبغي أن تكون جميع المكونات مخزنة مؤقتا إلى الرقم PH المطابق؛ هذا مهم بشكل خاص للجزيئات الحمضية للغاية أو الأساسية مثل NTPs. وأخيرا ، درجة الحرارة والحجم هي المعلمات الرئيسية لرد الفعل. لتحقيق عائد جيد، ينبغي للمرء أن تنفيذ درجة حرارة حوالي 37 درجة مئوية، ودرجات الحرارة أقل من 34 درجة مئوية سوف يقلل بشكل كبير من العائد27.
من المهم ملاحظة أنه قبل إعداد OnePot PURE ، يجب على المرء أن ينظر في التطبيق المستهدف والمتطلبات المرتبطة به ، مثل الحجم والنقاء وسهولة التعديل وإدراج المكونات أو إغفالها. بالنسبة للعديد من التطبيقات ، سيكون النظام خيارا ممتازا ، ولكن قد يتطلب البعض الآخر غلة وقابلية تعديل وعوامل أخرى ، والتي لا يمكن لنظام OnePot توفيرها. وبغض النظر عن ذلك، فإن البروتوكول الذي تم إدخاله سيكون مفيدا لإعداد أي نظام منزلي الصنع، حيث يتم تلخيص جميع الخطوات الحاسمة لمثل هذا الإعداد هنا.
واحدة من المزايا الرئيسية لنظام OnePot هي توافقه مع نظام PURExpress المتاح تجاريا ، والذي يوفر إمكانية اختبار وظائف وسلامة جميع المكونات بشكل منفصل عن طريق استبدال كل مكون PURExpress بشكل متسلسل بمكافئ OnePot الخاص به. إن مزايا نظام OnePot PURE ، مثل التونة والإعداد السهل والسريع والفعال من حيث التكلفة ، ستجعل TX-TL الخالية من الخلايا في متناول المزيد من المختبرات في جميع أنحاء العالم وستساهم في توسيع تنفيذ هذه المنصة القوية في البيولوجيا الاصطناعية الخالية من الخلايا.

تشكل أنظمة النسخ والترجمة الخالية من الخلايا (TX-TL) منصة واعدة للتحقيق في الأنظمة البيولوجية والهندسية. فهي توفر ظروف رد فعل مبسطة وغير قادرة، حيث أنها لم تعد تعتمد على العمليات التي تحافظ على الحياة، بما في ذلك النمو، أو التوازن، أو الآليات التنظيمية1. وبالتالي، فمن المتوقع أن النظم الخالية من الخلايا سوف تسهم في التحقيق في النظم الجزيئية الحيوية، وتقديم إطار لاختبار استراتيجيات التصميم الحيوي العقلاني2،وتوفير هيكل لخلية اصطناعية في المستقبل3،4. يوفر نظام PURE المؤتلف بالكامل هيكلا جذابا بشكل خاص نظرا لتكوينه المحدد والحد الأدنى ، بالإضافة إلى قابليته للتعديل وقابليته للضبط5.
منذ أول وظيفية، تم تأسيس نظام PURE المؤتلف بالكامل في عام 20015،وقد بذلت جهود لتوسيع حدود النظام وتحسين تكوين النظام لتحسين إنتاج النظام6،7،8، والسماح لتنظيم النسخ9، غشاء10،11 والتوليف البروتينإفرازي 12، وتسهيل طي البروتين13،14 . في الوقت الحاضر ، هناك ثلاثة أنظمة متاحة تجاريا: PUREfrex (GeneFrontier) ، PURExpress (NEB) ، وماجيك PURE (Biolabs الإبداعية). غير أن هذه النظم مكلفة، وتكوينها الدقيق ملكية خاصة، وبالتالي فهي غير معروفة، والقدرة على التكيف محدودة.
PURE نظم أعدت في المنزل ثبت أن الخيار الأكثر فعالية من حيث التكلفة و tunable15،16. ومع ذلك ، فإن خطوات تنقية 37 المطلوبة للبروتين والكسور الريبوسومية تستغرق وقتا طويلا ومملة. وقد بذلت عدة محاولات لتحسين كفاءة إعداد نظام PURE17،18،19. لقد أثبتنا مؤخرا أنه من الممكن زراعة جميع البروتينات غير الريبوسومية المطلوبة الموجودة في نظام PURE والمشاركة في تنقيتها. وقد أثبتت طريقة OnePot هذه أنها فعالة من حيث التكلفة وفعالة من حيث الوقت ، مما يقلل من وقت التحضير من عدة أسابيع إلى 3 أيام عمل. هذا النهج يولد نظام PURE مع قدرة إنتاج البروتين مماثلة لنظام PURExpress المتاحة تجاريا20. خلافا للنهج السابقة لتبسيط إعداد PURE17،18،19، في نهج OnePot لا تزال جميع البروتينات يتم التعبير عنها في سلالات منفصلة. وهذا يمكن المستخدم من ضبط تكوين نظام OnePot PURE بمجرد حذف أو إضافة سلالات محددة أو ضبط أحجام التطعيم ، وبالتالي توليد أنظمة PURE التسرب أو تغيير نسب البروتين النهائية ، على التوالي.
يوفر البروتوكول المعروض هنا طريقة مفصلة لإنشاء نظام OnePot PURE كما هو موضح سابقا20، على الرغم من استبدال β ميركابتوثانول بفوسفين tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP). وعلاوة على ذلك، توصف طريقتان لتنقية الريبوسوم: تنقية الريبوسوم التقليدية الخالية من العلامات باستخدام التفاعل الكاره للماء ووسادة السكروز، المقتبسة من شيميزو وآخرون15،وتنقية الريبوسوم Ni-NTA استنادا إلى وانغ وآخرون18 وإديرث وآخرون21 ولكن تم تعديلها بشكل كبير. كما أن هذه الطريقة الأخيرة تيسر إعداد نظام PURE وتجعله في متناول المزيد من المختبرات، حيث لا يلزم سوى معدات مختبرية قياسية.
يلخص البروتوكول التجريبي إعداد نظام PURE الخالي من الخلايا متعدد الاستخدامات TX-TL لتوفير منصة بسيطة وغير قادرة وفعالة من حيث التكلفة خالية من الخلايا ، والتي يمكن إعدادها باستخدام معدات المختبر القياسية في غضون أسبوع. بالإضافة إلى إدخال التكوين النقي القياسي ، فإننا نبين كيف وأين يمكن تعديله ، مع التركيز بشكل أساسي على الخطوات الحاسمة في البروتوكول لضمان وظائف النظام.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

يوفر نظام PURE المحدد (تخليق البروتين باستخدام العناصر المؤتلفة) نظام النسخ والترجمة هيكلا جذابا لعلم الأحياء الاصطناعي الخالي من الخلايا. ولسوء الحظ، فإن النظم المتاحة تجاريا مكلفة، وسمك التونة فيها محدود. وبالمقارنة، يمكن تخصيص نهج منزلي الصنع بناء على احتياجات المستخدم. ومع ذلك ، فإن إعداد الأنظمة المحلية الصنع يستغرق وقتا طويلا وشاقا نظرا للحاجة إلى الريبوسومات بالإضافة إلى 36 تنقية بروتين متوسطة النطاق. تبسيط تنقية البروتين عن طريق coculturing والتنقية المشتركة يسمح لتقليل متطلبات الوقت والعمل. هنا، نقدم طريقة سهلة وقابلة للتعديل والوقت وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج جميع مكونات نظام PURE في غضون أسبوع واحد، وذلك باستخدام معدات المختبر القياسية. وعلاوة على ذلك، فإن أداء OnePot PURE مماثل للأنظمة المتاحة تجاريا. تعمل طريقة إعداد OnePot PURE على توسيع إمكانية الوصول إلى نظام PURE إلى المزيد من المختبرات نظرا لبساطته وفعاليته من حيث التكلفة.

تم تصميم البروتوكول أعلاه لتسهيل إنشاء نظام PURE TX-TL الخالي من الخلايا في أي مختبر. يتضمن البروتوكول وصفا مفصلا لإعداد الأجزاء الثلاثة المتميزة من نظام PURE: بروتين OnePot ، الريبوسوم ، وحل الطاقة. يظهر جدول يومي مفصل، يعمل على تحسين سير العمل، في الجدول 1. تم تحسين سير العمل لتنقية الريبوسومات الموسومة به ، وقد تختلف الأطر الزمنية قليلا إذا تم تنفيذ تنقية الريبوسوم الخالية من العلامات. إعداد واحد يوفر كمية كافية من PURE لتفاعلات 10 10 50 على الأقل. وعلاوة على ذلك، فإن الحلول المعدة مستقرة لأكثر من عام عند -80 درجة مئوية ويمكن أن تصمد أمام دورات التجمد والذوبان المتعددة.
مستويات التعبير المفرط الكافية لجميع السلالات حاسمة بالنسبة لوظائف محلول البروتين النهائي. يظهر الشكل 1 فرط التعبير الناجح في جميع السلالات الفردية ال 36 المستخدمة لاحقا لإعداد بروتين OnePot. حدث الاختلاف في كثافة نطاق البروتينات المفرطة في التعبير على الأرجح بسبب التحيز في أحجام التحميل على هلام SDS-PAGE. يتم تلخيص أحجام البروتين المتوقعة في الجدول 2. GlyRS و PheRS تتكون من اثنين من وحدات فرعية من مختلف الأوزان الجزيئية; البروتينات المتبقية 34 تتكون من وحدة فرعية واحدة. مفتاح بساطة هذا البروتوكول وفعاليته الزمنية هو خطوة coculturing والتنقية المشتركة(الشكل 2). تم إعداد محلول بروتين OnePot عن طريق زيادة نسبة سلالة EF-Tu فيما يتعلق بجميع سلالات التعبير الأخرى. تم تحليل التركيب العام للبروتينات النهائية من قبل SDS-PAGE (الشكل 3A). من المواد الهلامية (lanes 2، 3)، فمن الملاحظ أن EF-Tu (43.3 كيلودا) موجود في تركيز أعلى مقارنة بالبروتينات الأخرى، كما هو متوقع. في حين أن الجل يوفر مؤشرا أول جيدا لنسب التعبير عن البروتين، فإنه من الصعب تحديد ما إذا كان ومستوى كل بروتين فردي أعرب. لذلك ، يوصى بشدة بتأكيد التعبير المفرط في كل سلالة قبل coculturing ، كما هو موضح أعلاه.
وE. القولونية ريبوسوم هو آلة الجزيئية المعقدة تتألف من أكثر من 50 وحدة فرعية البروتين الفردية23. يظهر طيف امتصاص تمثيلي عند 260 نانومتر لتنقية الريبوسوم الخالي من العلامات في الشكل 4؛ الذروة الثالثة هي سمة من سمات elution ريبوسوم ناجحة. لكلا أساليب تنقية الريبوسوم، لوحظ نمط التشغيل المتوقع على هلام SDS-PAGE (الشكل 3A)18. لقد لاحظنا تلوثات لكلا التطهيرين ، وإن كان ذلك بكميات صغيرة (<10٪). وتجدر الإشارة إلى أن ملوثات مختلفة كانت موجودة في الريبوسومات الخالية من العلامات (الممرات 5 و6) والريبوسومات الموسومة به (الممرات 11 و12) بسبب الاختلاف في الطريقة. كمرجع للمستخدم، يتم تضمين المواد الهلامية SDS-PAGE للأنظمة المدمجة أيضا (الممرات 8 و9 و14 و15).
وأخيرا ، يتم مقارنة أداء النظم المعدة(الشكل 3)باستخدام المتغيرات الريبوسوم المختلفة. تظهر الدورات الزمنية للتعبير في المختبر eGFP أن كلا النظامين PURE يعملان وينتجان eGFP فلوريا. ومع ذلك ، فإن محلول بروتين OnePot جنبا إلى جنب مع الريبوسومات الموسومة به ، باستخدام تركيز الريبوسوم الأمثل عن طريق المعايرة ، لم يسفر إلا عن ثلث مستوى التعبير عن الإصدار الريبوسوم غير الموسوم(الشكل 3B). ولوحظت نتائج مماثلة عندما أعرب عن ثلاثة بروتينات من أحجام مختلفة ووصفت باستخدام الأخضر Lys tRNA في نظام وضع العلامات في المختبر (الشكل 3C). وكما رأينا في الجل الفلوري، تم التعبير عن المنتجات كاملة الطول بنجاح في كلا النظامين؛ ومع ذلك، فقط حوالي نصف مستوى التعبير تم تحقيقه مع نظام الريبوسوم له العلامة. بالإضافة إلى وضع العلامات الفلورية ، يمكن تمييز النطاقات المتوقعة لجميع البروتينات الثلاثة على هلام ملطخ بالكوماسي(الشكل 3D). وتبين النتائج أن نظام التعبير المقدم، الذي يمكن إعداده في غضون أسبوع في مختبر مزود بمعدات قياسية، يمكن استخدامه للتعبير المختبري عن البروتينات المشفرة في المصب لمروج T7 من القوالب الخطية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> الشكل 1:النتائج التمثيلية لاختبار التعبير المفرط لجميع سلالات التعبير في نظام PURE. يتم تلخيص أرقام وأحجام البروتين النقي في الجدول 2. يتم وضع علامة على أرقام البروتين 21 و 24 و 27 مع نجمة لتصور أفضل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> الشكل 2: تنقية البروتين OnePot. تصوير التخطيطي والصور المقابلة لجميع الخطوات المشاركة في إنتاج محلول البروتين OnePot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> الشكل 3: أداء النظم المعدة باستخدام المتغيرات الريبوسوم المختلفة. (أ)Coomassie الأزرق الملون SDS-PAGE المواد الهلامية من محلول البروتين OnePot (الممرات 2، 3)، الريبوسومات خالية من العلامات دون محلول البروتين (الممرات 5، 6) ومع محلول البروتين (الممرات 8، 9)، له الموسومة ريبوسومات دون محلول البروتين (الممرات 11، 12) ومع محلول البروتين (الممرات 14، 15). تم تحميل تركيزين مختلفين لكل عينة. (ب)مقارنة التعبير eGFP له الموسومة ريبوسومات والريبوسومات خالية من العلامات. يتم رصد كثافة الفلورية في المختبر eGFP التعبير مع مرور الوقت لرد فعل PURE باستخدام الريبوسومات خالية من العلامات (1.8 ميكرومتر، الأزرق) والريبوسومات له الموسومة (0.62 ميكرومتر، أحمر). وكانت تركيزات القالب الخطي ومحلول بروتين OnePot 4 nM و 2 ملغم / مل ، على التوالي. لوحات (C) و (D) تظهر هلام SDS-PAGE من البروتينات توليفها في OnePot مع العلامة خالية (1.8 ميكرومتر, الأزرق، والممرات 3، 4، 5) والريبوسومات له العلامة (0.62 ميكرومتر، الأحمر، الممرات 6، 7، 8) وصفت مع GreenLys في طقم وضع العلامات في المختبر (C)وملطخة الأزرق Coomassie(D)،على التوالي. تشير الأسهم السوداء إلى النطاقات المتوقعة من البروتينات المركبة: eGFP (26.9 كيلودا) وArgRS (64.7 كيلودا) و T7 RNAP (98.9 كيلودا). كان القالب الخطي وتركيزات محلول بروتين OnePot 4 nM و 1.6 ملغم / مل ، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> الشكل 4: أطياف الامتصاص في 260 نانومتر. النتائج التمثيلية لأطياف الامتصاص عند 260 نانومتر أثناء تنقية التفاعل الكاره للماء للريبوسومات الخالية من العلامات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: جدول زمني يومي محسن زمنيا لإعداد جميع حلول OnePot PURE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 2: قائمة البروتين PURE <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 1: الكواشف. يسرد الجدول التركيزات والأحجام والتفاصيل المحددة الأخرى للكواشف والمكونات المستخدمة أثناء هذه الدراسة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 2: المخازن المؤقتة. يسرد جدول البيانات التراكيب العازلة الدقيقة للبروتين ، والريبوسوم الخالي من العلامات ، وتنقية الريبوسوم ، بالإضافة إلى تركيزات حلول المخزون المستخدمة لإعدادها. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يحسب كميات المطلوبة من المكونات استنادا إلى وحدة التخزين المؤقت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 3: حسابات الأحماض الأمينية. يسرد جدول البيانات الأحماض الأمينية وتركيزات محلول المخزون الموصى بها المطلوبة لحل الطاقة. يحسب كمية الماء التي يمكن إضافتها إلى كل حمض أميني استنادا إلى الكتلة الفعلية وزنها، ويحسب أيضا حجم محلول الأحماض الأمينية لإضافته إلى خليط الأحماض الأمينية النهائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 4: حلول المخزون لحل الطاقة. يسرد الجدول تركيزات وحجم حلول المخزون اللازمة لحل الطاقة ويشير إلى مزيد من التفاصيل، بما في ذلك ظروف التخزين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 5: حل الطاقة. يسرد الجدول مكونات محلول الطاقة وتركيزاتها الموصى بها. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يحسب أحجامها المطلوبة لإضافتها إلى الحل النهائي على أساس تركيزاتها حل المخزون وحجم محلول الطاقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 6: PCR. يسرد الجدول تسلسل وتركيزات المبرمجين المستخدمين في تمديد PCR ويشير إلى درجات حرارة ذوبان وخطوات دورة حرارية محسنة لبوليميراز الحمض النووي عالي الدقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 7: رد فعل نقي. يعرض جدول البيانات إعداد مثال لرد فعل PURE. يسرد التركيزات المستخدمة وأحجام المكونات لرد فعل PURE باستخدام الريبوسومات الخالية من العلامات أو الريبوسومات الوسمية الخاصة به. وعلاوة على ذلك، فإنه يحسب نسب حجم للبروتين والثقيل ريبوسوم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

OnePot PURE Cell-Free System

نقدم طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج نظام PURE الخالي من الخلايا النقي باستخدام معدات المختبر القياسية.

نظام خلية ونبوت PURE الخالي من الخلايا

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

يستخدم هذا البروتوكول لنظام التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا المؤتلف ، المعروف باسم نظام PURE ، زراعة الخلايا وتنقية الخلايا لتبسيط تنقية البروتين المطلوبة. وهذا يقلل بشكل كبير من متطلبات الوقت والعمل. وقد أثبتت طريقة OnePot أنها ليست فعالة من حيث التكلفة فحسب ، بل فعالة أيضا من حيث الوقت.فإنه يقلل من أوقات التحضير من عدة أسابيع إلى ثلاثة أيام عمل. وهذا يجعل منصة PURE الخالية من الخلايا في متناول المزيد من المختبرات في جميع أنحاء العالم ويساعد على تنفيذ هذه المنصة القوية حقا لعلم الأحياء الخالي من الخلايا الاصطناعية. قبل البدء، تأكد من أن جميع السلالات عبر عن البروتين كل منها بشكل جيد.للبدء، قم بإعداد العمود لتنقية بروتين OnePot كما هو موضح في المخطوطة النصية باستخدام ملليلترين من راتنج سيفاروز، ثم قم بشحن العمود بكبريتات النيكل. إعداد الثقافات بداية من خلال الجمع بين 20 ملليلتر من وسائل الإعلام LB مع 20 ميكرولتر من أمبيسلين. إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام في 35 بئرا من العقيمة 96 لوحة بئر عميقة.تلقيح كل واحد منهم مع سلالة كل منها، باستثناء عامل الاستطالة الحرارية غير مستقرة، أو EFTU، وختم لوحة مع غشاء تنفس. لثقافة EFTU، تلقيح ثلاثة ملليلترات من أمبيسلين تحتوي على وسائط LB في أنبوب ثقافة 14 ملليلتر مع غطاء المفاجئة. حوالي ثلاثة ملليلترات من ثقافة EFTU كافية لثقافة تعبير OnePot واحدة.احتضانه في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 260 التناوب في الدقيقة الواحدة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، نقل 500 ملليلتر من وسائل الإعلام LB و 500 ميكرولتر من الأمبيسلين في قارورة حائرة معقمة. تلقيح ثقافة OnePot PURE مع 1675 ميكرولتر من ثقافة EFTU و 55 ميكرولتر لكل ثقافة من الثقافات من لوحة البئر العميقة.احتضان الثقافة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز 260 دوران في الدقيقة ، أو حتى تصل الكثافة البصرية للثقافة إلى 0.2 إلى 0.3. حث الثقافة مع 500 ميكرولتر من 0.1 ملليمولار IPTG وتنمو لمدة ثلاث ساعات إضافية. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أربع درجات مئوية و 3، 220 مرة G لمدة 10 دقائق، وتخزين بيليه الخلية في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.في اليوم الثالث، قم بقياس كميات المخازن المؤقتة اللازمة لتنقية هذه المخازن وإضافة TCEP إليها جميعا كما هو مبين في النص. تخزين المخازن المؤقتة المتبقية دون TCEP في أربع درجات مئوية لتنقية المستقبل. Equilibrate العمود المشحون مع 30 ملليلتر من المخزن المؤقت A.After 25 ملليلتر من المخزن المؤقت A قد مرت من خلال، إغلاق العمود من أسفل.إذابة الخلايا واستخدام ماصة المصلية لإعادة إنفاق بيليه الخلية في 7.5 ملليلتر من العازلة A.Lyse الخلايا باستخدام مسبار 130 واط. إذا كانت سونيكيشن ناجحة، فإن الحل يتحول إلى أغمق. تأكد من إبقاء الخلايا على الجليد ووضع المسبار عميقا بما فيه الكفاية دون لمس الأنبوب.إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 21، 130 مرة G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية والحفاظ على lysate على الجليد. أضف الناسخ الفائق إلى العمود المتساوي. أغلق العمود من الأعلى وتأكد من عدم وجود تسرب.احتضان العمود لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية تحت دوران باستخدام أنبوب الدوار. Elute مكونات غير منضمة من العمود وغسل مع 25 ملليلتر من العازلة A.Wash العمود مع 25 ملليلتر من 25 ملليمولار imidazole العازلة. Elute البروتينات مع خمسة ملليلتر من 450 ملليمولار imidazole العازلة والحفاظ على البروتينات eluted على الجليد في جميع الأوقات.تمييع اليواتي مع 25 ملليلتر من العازلة HT والحفاظ على الخليط على الجليد. أضف 15 ملليلتر إلى فلتر طرد مركزي 15 ملليلتر وركز على حجم 1.5 ملليلتر. أضف المتبقية 15 ملليلتر إلى عامل التصفية مع الحل المركزة والتركيز إلى 1.5 ملليلتر مرة أخرى.إضافة 10 ملليلتر من المخزن المؤقت HT إلى عينة مركزة والتركيز على ملليلتر واحد. استرداد العينة المركزة وإضافة كمية متساوية من المخزن المؤقت للمخزون B وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. أثناء تبادل المخزن المؤقت استعادة العمود كما هو محدد في النص.في اليوم الرابع، قم بقياس تركيز البروتين باستخدام م المقايسة برادفورد. ركز العينة مع 0.5 ملليلتر من ثلاثة كيلودالتون تصفية الطرد المركزي إلى 20 ملليغرام لكل ملليلتر. تحقق من تكوين بروتين OnePot PURE باستخدام صفحة SDS.تمييع 2.5 ميكرولتر من العينة مع 7.5 ميكرولتر من الماء مختلطة مع 10 ميكرولتر من اثنين من العازلة X Laemmli، ومن ثم تحميل خمسة ميكرولتر و 2.5 ميكرولتر من العينات على الجل. تشغيل الصفحة SDS كما هو محدد في النص. ملء تركيز وطول الحمض النووي في الخلايا الصفراء المقابلة في جدول البيانات باستخدام اثنين إلى 10 نانومولار من الحمض النووي لرد الفعل.ملء حجم رد الفعل الإجمالي المطلوب في microliters. إزالة الكواشف المطلوبة من الثلاجة وتذوب لهم على الجليد. ثم، ماصة كميات محسوبة من الماء والحمض النووي والطاقة حل إلى جانب واحد من أنبوب PCR أو زاوية واحدة من بئر على لوحة بئر 384.ماصة كميات محسوبة من البروتين والحل ريبوسوم إلى الجانب الآخر من أنبوب PCR أو الزاوية المقابلة من لوحة بئر 384. تدور لمدة 30 ثانية لدمج مكونات التفاعل. لمنع التبخر أثناء تجارب قارئ اللوحة، أضف 35 ميكرولتر من الشمع السائل، واختم اللوحة بتسرب شفاف.حضانة لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية. للقراءة على قارئ لوحة، وقياس كثافة فلوريسنس في الطول الموجي المطلوب كل دقيقتين. يظهر النجاح على التعبير في جميع السلالات الفردية المستخدمة في وقت لاحق لإعداد البروتين OnePot هنا.تم تحليل التركيب العام للحل النهائي بروتين OnePot PURE من قبل صفحة SDS. ومن الملاحظ أن وحدة مكافحة الإرهاب موجودة بتركيز أعلى مقارنة بالبروتينات الأخرى، كما هو متوقع. تم تحليل غلة توليف محلول بروتين OnePot جنبا إلى جنب مع الريبوسومات الموسومة أو غير الموسومة من خلال مراقبة مضان eGFP بمرور الوقت.تم تحليل مستويات التعبير من ثلاثة بروتينات مختلفة وصفت باستخدام tRNA القائمة الخضراء في نظام وضع العلامات في المختبر، أو تلطيخ كوماسي، على هلام صفحة SDS. لنظام PURE وظيفية، فمن الأهمية بمكان أن جميع السلالات التعبير عن البروتينات الخاصة بهم بشكل جيد. تسهل هذه التقنية تطبيق نظام PURE على هندسة النظام البيولوجي ، مما يتيح تطوير شبكات جينية جديدة وتشخيص جزيئي وعلاجات ومجموعات تعليمية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

صالحة قابل للغلق غرفة فيمتولتر مجانا خلية علم الأحياء

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

المداري تهز ثقافة خلايا الثدييات في السفن على شكل س لإنتاج المجاميع الموحدة

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

الخلية الحرة "استخدام تعبير البروتين" "سرعة نمو بكتيريا" الضمة ناتريجينس

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

منصة ميكروفلويدريك متعددة الطبقات لتوصيل التعبير الجيني الخالي من الخلايا لفترات طويلة

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

قياس 3D في الجسم الحي الكتف الحركية باستخدام ثنائية الكواكب فيديو راديوجرافي

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

طرق سريعة انزيمية لتضخيم الحد الأدنى من القوالب الخطية لنماذج البروتين باستخدام أنظمة خالية من الخلايا

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...