Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Det Europæiske Forskningsråd under EU's Horizon 2020 Research and Innovation Program Grant 723106, en Swiss National Science Foundation Grant (182019) og EPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PURE+technology.">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).</li><li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li><li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli.">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).</li><li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Protokollen præsenteres her beskriver en enkel, tid- og omkostningseffektiv metode til at forberede en alsidig PURE udtryk system20 baseret på standard sammensætning15. Ved at anvende protokollen sammen med de medfølgende daglige tidsplaner (tabel 1) kan alle komponenter fremstilles på 1 uge og udbyttemængder, der er tilstrækkelige til op til fem hundrede 10 μL PURE-reaktioner. Da de proteiner, der anvendes i denne protokol, er overekspresseret fra plasmider med høj kopi og har lav toksicitet til E. coli, observeres der gode ekspressionsniveauer for alle de krævede proteiner (Figur 1). Dette giver mulighed for nem justering af stammer, og derfor også proteinsammensætning i cocultures, blot ved at ændre forholdet mellem podning stammer20. Ud over ribosomale proteiner viste koncentrationen af EF-Tu sig at være af grundlæggende betydning for udtryksudbyttet6. Derimod havde ændringer i koncentrationen af de andre proteinkomponenter en relativt lav indvirkning på robustheden af PURE-systemet7,24. Ved at justere podningsforholdet mellem EF-Tu og alle de andre komponenter kan der derfor opnås en sammenlignelig sammensætning som standard PURE-sammensætningen, og der kan opnås et PURE-system med et lignende udbytte20. Ved tilberedningen af proteinopløsningen er det afgørende at sikre, at alle stammer vokser godt og overekspresserer det kodede protein efter induktion (Figur 1).
Ribosom funktion er nøglen til den samlede ydeevne af PURE system24. I denne protokol demonstreres to forskellige metoder til fremstilling af ribosomopløsningen, dvs. tagfri og his-tagged ribosomrensning. Den tagfri ribosomrensning er baseret på hydrofob interaktionskromatografi efterfulgt af centrifugering med en saccharosepude, som kræver adgang til et FPLC-rensningssystem og et ultracentrifuge15. I modsætning hertil kræver metoden, der anvender Hans-tagged ribosomer18 og tyngdekraftsstrøm affinitetskromatografirensning, ikke specialiseret udstyr og kan udføres i de fleste laboratorier. Sidstnævnte metode giver derfor fordele som enkelhed og tilgængelighed. Vi observerede dog et betydeligt lavere synteseudbytte, når du brugte de hist mærkede ribosomer i OnePot PURE sammenlignet med den tagfrie variant (Figur 3). Baseret på applikationstypen kan dette lavere udbytte være acceptabelt.
Energiløsningen giver de lav molekylvægt komponenter og tRNAs kræves for at brændstof in vitro TX-TL reaktioner. Denne protokol giver en opskrift på en typisk energiløsning, som nemt kan justeres baseret på brugernes behov. Sammen med tRNA, NTP og kreatinphosphat har overfloden og koncentrationen af Mg2+ ioner været afgørende for PURE-systemets samlede ydeevne8, da de er kritiske cofaktorer til transskription og oversættelse. I nogle tilfælde kan titreringen af ioner derfor i høj grad forbedre den samlede PURE-ydeevne. DNA-integritet er afgørende for PURE-ydeevnen. Sekvens, der verificerer promotorregionen, ribosombindingsstedet og målgen og sikrer, at en passende DNA-koncentration (<2 nM), vil således hjælpe med at fejlfinde problemer, der kan opstå, mens du opretter en PURE-reaktion.
PURE-systemet er et minimalt TX-TL-system, og specifikke applikationer kan derfor kræve yderligere justeringer25. Disse kan omfatte inkorporering af forskellige RNA-polymeraser9,26, chaperoner13og proteinfaktorer som EF-P eller ArfA8. Selv om udtrykket stammer for disse proteiner kan indgå i cocultures, tilføje dem separat til det forberedte system kan give bedre kontrol over de krævede proteinniveauer. Desuden er inddragelse af vesikler afgørende for produktionen af membranproteiner10,11. Oxidering i stedet for at reducere miljøer og en disulfidbindingsoomerase letter korrekt disulfidbindingsdannelse, som for eksempel er påkrævet for sekretoriske proteiner12.
Det er vigtigt at sikre, at yderligere komponenter ikke forstyrrer reaktionen. De vigtigste faktorer at være opmærksom på, når du opretter en reaktion eller tilføjer andre komponenter, er angivet nedenfor. Sørg for, at der hverken anvendes inkompatible buffere eller ionkoncentrationerne forstyrres. Undgå opløsninger, der indeholder glycerol, høje koncentrationer af kalium, magnesium, calciumioner, osmolytter, pyrophosphat, antibiotika eller EDTA, så meget som muligt. For eksempel kan udskiftning af en elution buffer med vand under DNA-rensning være gavnligt, da EDTA er et almindeligt tilsætningsstof i denne buffer. At forsyne løsningerne med yderligere negativt ladede molekyler som NTP eller dNTP kræver justering af magnesiumkoncentrationen8, da de negativt ladede molekyler opfører sig som chelaterende midler og binder positivt ladede molekyler. En neutral pH er ideel til reaktionen. Derfor bør alle komponenter bufferlagres til den tilsvarende pH-værdi. Dette er især vigtigt for meget sure eller grundlæggende molekyler som NTPs. Endelig er temperatur og volumen nøgleparametre for reaktionen. For at opnå et godt udbytte bør man gennemføre en temperatur omkring 37 °C, da temperaturer under 34 °C vil reducere udbyttet27betydeligt .
Det er relevant at bemærke, at før man forbereder OnePot PURE, bør man overveje målansøgningen og de tilhørende krav, såsom volumen, renhed, let modifikation og inddragelse eller udeladelse af komponenter. For mange applikationer vil systemet være et glimrende valg, men andre kan kræve udbytter, indstillingsmuligheder og andre faktorer, som OnePot-systemet ikke kan give. Uanset hvad vil den indførte protokol være gavnlig for udarbejdelsen af ethvert hjemmelavet system, da alle kritiske trin til en sådan forberedelse opsummeres her.
En af de største fordele ved OnePot-systemet er dets kompatibilitet med det kommercielt tilgængelige PURExpress-system, som giver mulighed for at teste funktionaliteten og integriteten af alle komponenter separat ved sekventielt at erstatte hver PURExpress-komponent med sin OnePot-ækvivalent. Fordelene ved OnePot PURE-systemet, såsom tunability og nem, hurtig og omkostningseffektiv forberedelse, vil gøre cellefri TX-TL tilgængelig for flere laboratorier over hele verden og bidrage til at udvide implementeringen af denne kraftfulde platform i cellefri syntetisk biologi.

Cellefri transskription-oversættelse (TX-TL) systemer udgør en lovende platform for undersøgelse og engineering biologiske systemer. De giver forenklede og tunable reaktionsforhold, da de ikke længere er afhængige af livsopretholdende processer, herunder vækst, homøostase eller reguleringsmekanismer1. Det forventes således, at cellefrie systemer vil bidrage til undersøgelsen af biomolekyllære systemer, tilbyde en ramme for at teste rationelle biodesignstrategier2og give et chassis til en fremtidig syntetisk celle3,4. Det fuldt rekombinante PURE-system tilbyder et særligt tiltalende chassis på grund af dets definerede og minimale sammensætning samt dets indstillingsmuligheder og tuneability5.
Siden det første funktionelle, fuldt rekombinante PURE-system blev etableret i 20015, er der gjort en indsats for at udvide systemgrænserne og optimere systemets sammensætning for at forbedre systemets udbytter6,7,8, give mulighed for transskriptionel regulering9,membran 10,11 og sekretorisk proteinsyntese12og for at lette proteinfoldning13,14 . I dag er der tre kommercielt tilgængelige systemer: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) og Magic PURE (Creative Biolabs). Disse systemer er imidlertid dyre, deres nøjagtige sammensætning er proprietær og dermed ukendt, og tilpasningsevnen er begrænset.
PURE-systemer, der er fremstillet internt, viste sig at være den mest omkostningseffektive og tunableløsningsmodel 15,16. Men de krævede 37 rensningstrin til protein- og ribosomfraktioner er tidskrævende og kedelige. Der er gjort adskillige forsøg på at forbedre effektiviteten af PURE-systemforberedelsen17,18,19. Vi har for nylig vist, at det er muligt at coculture og co-rense alle nødvendige ikke-ribosomale proteiner til stede i PURE-systemet. Denne OnePot-metode har vist sig at være omkostningseffektiv og tidseffektiv og reducere forberedelsestiden fra flere uger til 3 arbejdsdage. Tilgangen genererer et PURE-system med en proteinproduktionskapacitet svarende til det kommercielt tilgængelige PURExpress system20. I modsætning til de tidligere metoder til at forenklePURE-præparatet 17,18,19i OnePot-tilgangen udtrykkes alle proteiner stadig i separate stammer. Dette gør det muligt for brugeren at justere sammensætningen af OnePot PURE-systemet ved blot at udelade eller tilføje specifikke stammer eller justere podningsmængderne og dermed generere dropout PURE-systemer eller ændre de endelige proteinforhold.
Protokollen præsenteres her giver en detaljeret metode til at skabe OnePot PURE-systemet som beskrevet tidligere20, selv om β-mercaptoethanol blev erstattet med tris (2-carboxyethyl)fosphin (TCEP). Desuden er to metoder til ribosomrensning beskrevet: traditionel tagfri ribosomrensning ved hjælp af hydrofobisk interaktion og saccharosepude, tilpasset fra Shimizu et al.15, og Ni-NTA ribosomrensning baseret på Wang et al.18 og Ederth et al.21, men væsentligt modificeret. Sidstnævnte metode letter yderligere udarbejdelsen af PURE-systemet og gør det tilgængeligt for flere laboratorier, da der kun kræves standardlaboratorieudstyr.
Forsøgsprotokollen opsummerer forberedelsen af et alsidigt PURE cellefrit TX-TL-system for at give en enkel, tunable, omkostningseffektiv cellefri platform, som kan fremstilles ved hjælp af standard laboratorieudstyr inden for en uge. Udover at introducere standard PURE-sammensætningen, angiver vi, hvordan og hvor den kan justeres, med primært fokus på kritiske trin i protokollen for at sikre systemets funktionalitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

Det definerede PURE (proteinsyntese ved hjælp af rekombinante elementer) transskription-oversættelsessystem giver et tiltalende chassis til cellefri syntetisk biologi. Desværre er kommercielt tilgængelige systemer dyre, og deres tunability er begrænset. Til sammenligning kan en hjemmelavet tilgang tilpasses baseret på brugernes behov. Forberedelsen af hjemmelavede systemer er imidlertid tidskrævende og besværlig på grund af behovet for ribosomer samt 36 mellemstore proteinrensninger. Strømlining af proteinrensning ved kokulturering og co-rensning giver mulighed for at minimere tid og arbejdskraft krav. Her præsenterer vi en nem, justerbar, tids- og omkostningseffektiv metode til at producere alle PURE-systemkomponenter inden for 1 uge ved hjælp af standard laboratorieudstyr. Desuden kan OnePot PURE's ydeevne sammenlignes med kommercielt tilgængelige systemer. OnePot PURE-forberedelsesmetoden udvider tilgængeligheden af PURE-systemet til flere laboratorier på grund af dets enkelhed og omkostningseffektivitet.

Ovenstående protokol er designet til at lette etableringen af PURE cellefri TX-TL-system i ethvert laboratorium. Protokollen indeholder en detaljeret beskrivelse af præparatet af de tre forskellige dele af PURE-systemet: OnePot-proteinet, ribosom- og energiopløsningen. En detaljeret daglig tidsplan, der optimerer arbejdsprocessen, vises i tabel 1. Arbejdsgangen er optimeret til rensning af hans mærkede ribosomer, og tidsrammerne kan variere lidt, hvis der udføres tagfri ribosomrensning. Et præparat giver en tilstrækkelig mængde PURE til mindst 500 μL-reaktioner. Desuden er de forberedte opløsninger stabile i mere end et år ved -80 °C og kan modstå flere fryse-optøningscyklusser.
Passende overekspressionsniveauer for alle stammer er afgørende for funktionaliteten af den endelige proteinopløsning. Figur 1 viser vellykket overekspression i alle 36 individuelle stammer, der efterfølgende anvendes til OnePot-proteinpræparatet. Variation i de over-udtrykte proteiners båndintensiteter forekom sandsynligvis på grund af en bias i indlæsningsmængderne på SDS-PAGE gelen. De forventede proteinstørrelser er sammenfattet i tabel 2. GlyRS og PheRS består af to underenheder af forskellig molekylvægt; de resterende 34 proteiner består af en enkelt underenhed. Nøglen til denne protokols enkelhed og tidseffektivitet er coculturing- og co-purification-trinnet (Figur 2). OnePot-proteinopløsningen blev fremstillet ved at øge forholdet mellem EF-Tu-stammen med hensyn til alle de andre udtryksstammer. Den samlede sammensætning af de endelige proteiner blev analyseret af SDS-PAGE (Figur 3A). Fra gelerne (vognbane 2, 3) er det mærkbart, at EF-Tu (43,3 kDa) er til stede i en højere koncentration sammenlignet med de andre proteiner som forventet. Mens gelen giver en god første indikation af proteinekspressionsforhold, er det svært at afgøre, om og på hvilket niveau hvert enkelt protein blev udtrykt. Derfor anbefales det stærkt at bekræfte overekspressionen i hver stamme før coculturing, som vist ovenfor.
E. coli ribosom er en kompleks molekylær maskine bestående af over 50 individuelle proteinunderenheder23. Et repræsentativt absorptionsspektrum ved 260 nm for tagfri ribosomrensning er vist i figur 4; den tredje top er karakteristisk for vellykket ribosom elution. For begge ribosomrensningsmetoder blev det forventede løbemønster på SDS-PAGE gelen (Figur 3A)18 observeret. Vi observerede forureninger for begge rensninger, omend i små mængder (<10%). Især var forskellige forurenende stoffer til stede i de tagfrie (vognbaner 5, 6) og hans mærkede (vognbaner 11, 12) ribosomer på grund af variationen i metoden. Til brugerreference er SDS-PAGE gelerne til de kombinerede systemer også inkluderet (vognbane 8, 9 og 14, 15).
Endelig sammenlignes de forberedte systemers ydeevne (figur 3) ved hjælp af de forskellige ribosomvarianter. Tidskurserne for in vitro eGFP-udtryk viser, at begge PURE-systemer er funktionelle og producerer fluorescerende eGFP. OnePot-proteinopløsningen kombineret med de hist mærkede ribosomer ved hjælp af ribosomkoncentrationen, der var optimeret ved titrering, gav imidlertid kun en tredjedel af udtryksniveauet i den ikke-mærkede ribosomversion (Figur 3B). Lignende resultater blev observeret, når tre proteiner af forskellig størrelse blev udtrykt og mærket ved hjælp af Green Lys tRNA in vitro-mærkningssystemet (Figur 3C). Som det ses på fluorescerende gel, blev produkter i fuld længde med succes udtrykt i begge systemer; Men kun omkring halvdelen af udtryksniveauet blev opnået med His-tag ribosom system. Ud over fluorescensmærkningen kan de forventede bånd for alle tre proteiner skelnes på en Coomassie-farvet gel (Figur 3D). Resultaterne viser, at det indførte ekspressionssystem, som kan fremstilles inden for en uge i et laboratorium med standardudstyr, kan bruges til in vitro-ekspression af proteiner, der er kodet nedstrøms af T7-promotoren fra lineære skabeloner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Figur 1: Repræsentative resultater for overekspressionstesten for alle ekspresstammer i PURE-systemet. PURE proteintal og -størrelser er sammenfattet i tabel 2. Proteinnumrene 21, 24 og 27 er markeret med en stjerne for bedre visualisering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Figur 2: OnePot proteinrensning. Den skematiske skildring og tilsvarende fotografier af alle trin, der er involveret i produktionen af OnePot-proteinopløsningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Figur 3: De forberedte systemers ydeevne ved hjælp af de forskellige ribosomvarianter. (A) Coomassie blå farvede SDS-PAGE geler af OnePot-proteinopløsningen (vognbaner 2, 3), tagfri ribosomer uden proteinopløsning (vognbane 5, 6) og med proteinopløsning (vognbane 8, 9), Hans mærkede ribosomer uden proteinopløsning (vognbane 11, 12) og med proteinopløsning (vognbane 14, 15). Der blev indlæst to forskellige koncentrationer pr. prøve. (B) Sammenligning af eGFP udtryk af hans-tagged ribosomer og tag-fri ribosomer. Fluorescensintensiteten af in vitro eGFP-udtryk overvåges over tid for en PURE-reaktion ved hjælp af tagfrie ribosomer (1,8 μM, blå) og hans mærkede ribosomer (0,62 μM, rød). Koncentrationerne af den lineære skabelon og OnePot-proteinopløsningen var henholdsvis 4 nM og 2 mg/mL. Paneler (C) og (D) viser SDS-PAGE gel af proteiner syntetiseret i OnePot med tag-fri (1,8 μM, blå, baner 3, 4, 5) og His-tag ribosomer (0,62 μM, rød, baner 6, 7, 8) mærket med en GreenLys in vitro mærkning kit (C) og plettet med Coomassie blå (D), henholdsvis. De sorte pile angiver de forventede bånd af syntetiserede proteiner: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Den lineære skabelon og OnePot proteinopløsning koncentrationer var henholdsvis 4 nM og 1,6 mg/mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Figur 4: Absorbansspektre ved 260 nm. Repræsentative resultater af absorbansspektre ved 260 nm under hydrofob interaktionsrensning af tagfrie ribosomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tabel 1: En daglig tidsoptimeret tidsplan for udarbejdelsen af alle OnePot PURE-løsninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank"></a>
Tabel 2: PURE protein liste <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 1: Reagenser. Tabellen viser koncentrationer, mængder og andre specifikke detaljer om de reagenser og komponenter, der blev anvendt i løbet af denne undersøgelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 2: Buffere. Regnearket viser de nøjagtige buffersammensætninger for protein, tagfri ribosom og ribosomrensninger med hans tag samt koncentrationerne af de lageropløsninger, der anvendes til deres forberedelse. Derudover beregnes de nødvendige mængder komponenter baseret på buffervolumen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 3: Aminosyreberegninger. Regnearket viser de aminosyrer og deres anbefalede lageropløsningskoncentrationer, der kræves til energiopløsningen. Den beregner mængden af vand, der skal tilsættes til hver aminosyre baseret på den faktiske vejede masse, og beregner også mængden af aminosyreopløsningen, der skal tilsættes til den endelige aminosyreblanding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 4: Lagerløsninger til energiløsningen. Tabellen viser de koncentrationer og mængder af lagerløsninger, der er nødvendige for energiopløsningen, og angiver yderligere detaljer, herunder opbevaringsforhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 5: Energiløsning. Tabellen viser energiopløsningskomponenterne og deres anbefalede koncentrationer. Desuden beregner den deres krævede mængder, der skal føjes til den endelige løsning, baseret på deres lageropløsningskoncentrationer og mængden af energiopløsningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 6: PCR. Tabellen viser sekvenser og koncentrationer af de primere, der anvendes til udvidelses-PCR, og angiver smeltetemperaturer og termocyklustrin, der er optimeret til en DNA-polymerase med høj troskab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 7: REN reaktion. Regnearket viser et eksempel opsætning af en PURE reaktion. Den opregner de anvendte koncentrationer og mængder af komponenterne til en PURE-reaktion ved hjælp af tagfri ribosomer eller His-tag ribosomer. Desuden beregner den volumenforholdet for protein- og ribosomtriter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

OnePot PURE Cell-Free System

Vi præsenterer en hurtig og omkostningseffektiv metode til at producere det rekombinante PURE cellefrie TX-TL-system ved hjælp af standard laboratorieudstyr.

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Denne protokol for en rekombinant celle-fri protein udtryk system, almindeligvis kendt som PURE-systemet udnytter celle dyrkning og cellerensning til at strømline de nødvendige proteinrensninger. Dette minimerer betydeligt tids- og arbejdskravene. OnePot-metoden har vist sig ikke kun at være omkostningseffektiv, men også tidseffektiv.Det skærer forberedelsestiderne ned fra flere uger til tre arbejdsdage. Dette gør PURE-mobilfri platformen tilgængelig for flere laboratorier over hele verden og hjælper med at implementere denne virkelig kraftfulde platform til syntetisk cellefri biologi. Før du starter, skal du sikre dig, at alle stammer over udtrykker deres respektive protein godt.Til at begynde med skal du forberede kolonnen til OnePot-proteinrensningen som beskrevet i tekstmanuskriptet ved hjælp af to milliliter Sepharose-harpiks og derefter oplade kolonnen med nikkelsulfat. Forbered starterkulturerne ved at kombinere 20 milliliter LB-medier med 20 mikroliter ampicillin. Tilsæt 300 mikroliter af medierne i 35 brønde af en steril 96 dyb brøndplade.Pod hver af dem med sin respektive stamme, undtagen forlængelse faktor termo ustabil, eller EFTU, og forsegle pladen med en åndbar membran. For EFTU kultur, pode tre milliliter ampicillin, der indeholder LB medier i en 14 milliliter kultur rør med en snap cap. Omkring tre milliliter EFTU kultur er tilstrækkelig til en OnePot udtryk kultur.Inkuber det ved 37 grader Celsius, mens du ryster ved 260 rotationer i minuttet natten over. Den næste dag overføres 500 milliliter LB-medier og 500 mikroliter ampicillin til den sterile forvirrede kolbe. Udoguler OnePot PURE-kulturen med 1.675 mikroliter af EFTU-kulturen og 55 mikroliter af hver af kulturerne fra den dybe brøndplade.Inkuber kulturen i to timer ved 37 grader Celsius med en rystelse på 260 rotationer i minuttet, eller indtil kulturens optiske tæthed når 0,2 til 0,3. Inducere kulturen med 500 mikroliter af 0,1 millimolar IPTG og vokse i yderligere tre timer. Høst cellerne ved centrifugering ved fire grader Celsius og 3, 220 gange G i 10 minutter, og opbevar cellepillen ved minus 80 grader Celsius indtil videre brug.På dag tre skal du måle de mængder buffere, der er nødvendige for deres rensning, og tilføje TCEP til dem alle som angivet i teksten. Opbevar de resterende buffere uden TCEP ved fire grader Celsius til fremtidige rensninger. Ekvilibrere den ladede kolonne med 30 milliliter buffer A.Efter 25 milliliter buffer A er gået igennem, skal du lukke kolonnen fra bunden.Optø cellerne og bruge en serologisk pipette til at genbruge celle pellet i 7,5 milliliter buffer A.Lyse cellerne ved hjælp af en 130 watt sonde. Hvis sonikering er vellykket, vil opløsningen blive mørkere. Sørg for at holde cellerne på is og placere sonden dybt nok uden at røre røret.Fjern celleaffaldet ved centrifugering ved 21, 130 gange G i 20 minutter ved fire grader Celsius og hold lysatet på is. Føj supernatanten til den ekvilibrerede kolonne. Luk kolonnen fra toppen, og sørg for, at der ikke er nogen lækage.Inkuber kolonnen i tre timer ved fire grader Celsius under rotation ved hjælp af en rørrotator. Elute ubundne komponenter fra kolonnen og vask med 25 milliliter buffer A.Vask kolonnen med 25 milliliter af 25 millimolar imidazole buffer. Elute proteinerne med fem milliliter af 450 millimolar imidazole buffer og holde eluted proteiner på is på alle tidspunkter.Fortynd eluatet med 25 milliliter HT-buffer og hold blandingen på is. Tilsæt 15 milliliter til et 15 milliliter centrifugalfilter og koncentrer koncentrat til et volumen på 1,5 milliliter. Tilsæt de resterende 15 milliliter til filteret med den koncentrerede opløsning og koncentrer til 1,5 milliliter igen.Der tilsættes 10 milliliter HT-buffer til den koncentrerede prøve, og koncentrat koncentrat til en milliliter. Genvind den koncentrerede prøve, og tilsæt en tilsvarende mængde lagerbuffer B, og opbevar den ved minus 80 grader Celsius indtil videre brug. Under bufferudvekslingen skal du gendanne kolonnen som angivet i teksten.På dag fire måles proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-analysen. Koncentrer prøven med 0,5 milliliter af tre kilodalton cutoff centrifugalfilter til 20 milligram pr. milliliter. Kontroller OnePot PURE proteinsammensætningen ved hjælp af SDS-siden.Prøven fortyndes med 7,5 mikroliter vand blandet med 10 mikroliter af to X Laemmli-buffere, og der indlæses derefter fem mikroliter og 2,5 mikroliter af prøverne på gelen. Kør SDS-siden som angivet i teksten. Udfyld dna'ets koncentration og længde i de tilsvarende gule celler i regnearket ved hjælp af to til 10 nanomolar DNA til reaktionen.Udfyld det ønskede samlede reaktionsvolumen i mikroliter. Fjern de nødvendige reagenser fra fryseren og optø dem på is. Derefter pipette de beregnede mængder vand, DNA og energi løsning til den ene side af PCR-røret eller et hjørne af en brønd på 384 brønd plade.Pipette de beregnede mængder af protein og ribosomopløsning til den anden side af et PCR-rør eller det modsatte hjørne af 384 brøndpladen. Spin i ca. 30 sekunder for at flette reaktionskomponenterne. For at forhindre fordampning under pladelæserforsøg tilsættes 35 mikroliter flydende voks og forsegler pladen med et gennemsigtigt fugemasse.Inkuber i mindst tre timer ved 37 grader Celsius. For udlæsning på en pladelæser, måle florescence intensitet på den krævede bølgelængde hvert andet minut. Vellykket over udtryk i alle individuelle stammer, der efterfølgende anvendes til OnePot proteinpræparatet, vises her.Den samlede sammensætning af den endelige OnePot PURE proteinopløsning blev analyseret af SDS-siden. Det er bemærkelsesværdigt, at EFTU er til stede i en højere koncentration i forhold til de andre proteiner, som forventet. Synteseudbyttet af OnePot-proteinopløsningen kombineret med de hist mærkede eller ikke-mærkede ribosomer blev analyseret ved at overvåge eGFP-fluorescensen over tid.Udtryksniveauerne for tre forskellige proteiner mærket ved hjælp af den grønne liste tRNA in vitro mærkning system, eller Kumasi farvning, blev analyseret på en SDS side gel. For et funktionelt PURE-system er det helt afgørende, at alle stammer udtrykker deres respektive proteiner godt. Denne teknik letter implementeringen af PURE-systemet til biologisk systemteknik, hvilket muliggør udvikling af nye genetiske netværk, molekylær diagnostik, terapi og uddannelsessæt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriel Detection og identifikation Brug elektrokemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Forsegles Femtoliter Chamber Arrays for celle-fri Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese af smitsomme Bakteriofager i en E. coli -baseret celle-gratis Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital ryster kultur i pattedyrsceller i O-formede fartøjer til at producere Uniform aggregeringer

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Celle-fri Protein udtryk ved hjælp af hurtigt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forberedelse proteinproducerende syntetiske celler ved hjælp af cellefri bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsionoverførsel

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Måling af 3D In-vivo Skulder kinematics ved hjælp af Biplanar Videoradiography

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Hurtige, enzymatiske metoder til forstærkning af minimale, lineære skabeloner til proteinprototyping ved hjælp af cellefrie systemer

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...