Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par le Conseil européen de la recherche dans le cadre de la subvention du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne 723106, d’une subvention du Fonds national suisse (182019) et de l’EPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PURE+technology.">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).</li><li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li><li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli.">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).</li><li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole présenté ici décrit une méthode simple, efficace en temps et en argent pour préparer un système d’expression PURE20 polyvalent basé sur la composition standard15. En utilisant le protocole avec les calendriers quotidiens fournis(tableau 1),tous les composants peuvent être préparés en 1 semaine et produire des quantités suffisantes pour des réactions PURE allant jusqu’à cinq cents 10 μL. Étant donné que les protéines utilisées dans ce protocole sont surexprimées à partir de plasmides à copie élevée et ont une faible toxicité pour E. coli, de bons niveaux d’expression sont observés pour toutes les protéines requises (Figure 1). Cela permet d’ajuster facilement les souches, et donc aussi la composition des protéines dans les cocultures, simplement en modifiant les rapports des souches d’inoculation20. Outre les protéines ribosomiques, la concentration d’EF-Tu s’est avérée d’une importance fondamentale pour les rendements d’expression6. En revanche, les changements dans la concentration des autres composants protéiques ont eu un impact relativement faible sur la robustesse du système PURE7,24. Par conséquent, en ajustant le rapport d’inoculation d’EF-Tu par rapport à tous les autres composants, une composition comparable à la composition PURE standard peut être obtenue et un système PURE avec un rendement similaireà 20 peut être atteint. Lors de la préparation de la solution protéique, il est essentiel de s’assurer que toutes les souches se développent bien et surexpriment la protéine codée après induction (Figure 1).
La fonction ribosome est essentielle pour la performance globale du système PURE24. Dans ce protocole, deux méthodes différentes de préparation de la solution de ribosome sont démontrées, à c’est-à-dire la purification du ribosome sans étiquette et la purification du ribosome marquée his. La purification des ribosomes sans étiquette est basée sur la chromatographie d’interaction hydrophobe suivie d’une centrifugation avec un coussin de saccharose, ce qui nécessite l’accès à un système de purification FPLC et à une ultracentrifugeuse15. En revanche, la méthode utilisant les ribosomes18 marqués his et la purification par chromatographie d’affinité par écoulement gravitaire ne nécessite pas d’équipement spécialisé et peut être effectuée dans la plupart des laboratoires. Cette dernière méthode apporte donc des avantages tels que la simplicité et l’accessibilité. Cependant, nous avons observé un rendement de synthèse significativement plus faible lors de l’utilisation des ribosomes marqués His dans le OnePot PURE par rapport à la variante sans étiquette(Figure 3). Selon le type d’application, ce rendement inférieur peut être acceptable.
La solution énergétique fournit les composants de faible poids moléculaire et les ARNt nécessaires pour alimenter les réactions TX-TL in vitro. Ce protocole fournit une recette pour une solution énergétique typique, qui peut être facilement ajustée en fonction des besoins de l’utilisateur. Avec l’ARNt, le NTP et le phosphate de créatine, l’abondance et la concentration des ions Mg2+ ont été cruciales pour la performance globale du système PURE8,car ils sont des cofacteurs critiques pour la transcription et la traduction. Dans certains cas, le titrage des ions peut donc grandement améliorer les performances globales de PURE. L’intégrité de l’ADN est cruciale pour la performance PURE. Ainsi, la séquence vérifie la région promotrice, le site de liaison des ribosomes et le gène cible et s’assure qu’une concentration adéquate d’ADN (<2 nM) aidera à résoudre les problèmes pouvant survenir lors de la mise en place d’une réaction PURE.
Le système PURE est un système TX-TL minimal, et des applications spécifiques peuvent donc nécessiter des ajustements supplémentaires25. Ceux-ci peuvent inclure l’incorporation de différents ARN polymérases9,26,chaperons13et facteurs protéiques tels que EF-P ou ArfA8. Bien que les souches d’expression de ces protéines puissent être incluses dans les cocultures, leur ajout séparé au système préparé peut fournir un meilleur contrôle des niveaux de protéines requis. De plus, l’inclusion de vésicules est essentielle à la production de protéinesmembranaires 10,11. L’oxydation plutôt que la réduction des environnements et une isomérase de liaison disulfure facilitent la formation correcte de liaisons disulfures, qui sont, par exemple, nécessaires pour les protéines sécrétoires12.
Il est essentiel de s’assurer que tout composant supplémentaire n’interfère pas avec la réaction. Les facteurs les plus importants à prendre en compte lors de la mise en place d’une réaction ou de l’ajout d’autres composants sont énumérés ci-dessous. S’assurer que ni des tampons incompatibles ne sont utilisés ni que les concentrations d’ions ne sont perturbées. Évitez autant que possible les solutions contenant du glycérol, des concentrations élevées de potassium, de magnésium, d’ions calcium, d’osmolytes, de pyrophosphate, d’antibiotiques ou d’EDTA. Par exemple, le remplacement d’un tampon d’élution par de l’eau pendant la purification de l’ADN peut être bénéfique car l’EDTA est un additif courant dans ce tampon. Fournir aux solutions des molécules supplémentaires chargées négativement telles que le NTP ou le dNTP nécessite d’ajuster la concentration en magnésium8, car les molécules chargées négativement se comportent comme des agents chélatants et se lient aux molécules chargées positivement. Un pH neutre est idéal pour la réaction. En conséquence, tous les composants doivent être tamponnés au pH correspondant; Ceci est particulièrement important pour les molécules très acides ou basiques telles que les NTP. Enfin, la température et le volume sont des paramètres clés de la réaction. Pour obtenir un bon rendement, il faut mettre en œuvre une température autour de 37 ° C, car des températures inférieures à 34 ° C rédiront considérablement le rendement27.
Il est pertinent de noter qu’avant de préparer le OnePot PURE, il convient de prendre en compte l’application cible et les exigences associées, telles que le volume, la pureté, la facilité de modification et l’inclusion ou l’omission de composants. Pour de nombreuses applications, le système sera un excellent choix, mais d’autres peuvent nécessiter des rendements, une ajustabilité et d’autres facteurs, que le système OnePot ne peut pas fournir. Quoi qu’il en soit, le protocole introduit sera bénéfique pour la préparation de tout système fait maison, car toutes les étapes critiques pour une telle préparation sont résumées ici.
L’un des principaux avantages du système OnePot est sa compatibilité avec le système PURExpress disponible dans le commerce, qui offre la possibilité de tester la fonctionnalité et l’intégrité de tous les composants séparément en remplaçant séquentiellement chaque composant PURExpress par son équivalent OnePot. Les avantages du système OnePot PURE, tels que l’accordabilité et la préparation facile, rapide et rentable, rendront le TX-TL sans cellules accessible à un plus grand nombre de laboratoires dans le monde entier et contribueront à étendre la mise en œuvre de cette puissante plate-forme en biologie synthétique sans cellules.

Les systèmes de transcription-traduction sans cellules (TX-TL) constituent une plate-forme prometteuse pour l’étude et l’ingénierie des systèmes biologiques. Ils fournissent des conditions de réaction simplifiées et accordables, car ils ne reposent plus sur des processus de maintien de la vie, y compris la croissance, l’homéostasie ou les mécanismes de régulation1. Ainsi, il est prévu que les systèmes sans cellules contribueront à l’étude des systèmes biomoléculaires, offriront un cadre pour tester des stratégies de bioconceptionrationnelles 2, et fourniront un châssis pour une future cellule synthétique3,4. Le système PURE entièrement recombinant offre un châssis particulièrement attrayant en raison de sa composition définie et minimale, ainsi que de son ajustabilité et de sa réglabilité5.
Depuis que le premier système PURE fonctionnel et entièrement recombinant a été mis en place en 20015, des efforts ont été faits pour élargir les limites du système et optimiser la composition du système afin d’améliorer les rendements du système6,7,8, permettre la régulation transcriptionnelle9, membrane 10,11et la synthèse des protéines sécrétoires12, et faciliter le repliement des protéines13,14 . De nos jours, il existe trois systèmes disponibles dans le commerce : PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) et Magic PURE (Creative Biolabs). Cependant, ces systèmes sont coûteux, leur composition exacte est propriétaire et donc inconnue, et l’adaptabilité est limitée.
Les systèmes PURE préparés en interne se sont avérés être l’option la plus rentable et la plus réglable15,16. Cependant, les 37 étapes de purification requises pour les fractions de protéines et de ribosomes prennent beaucoup de temps et sont fastidieuses. Plusieurs tentatives ont été faites pour améliorer l’efficacité de la préparation du système PURE17,18,19. Nous avons récemment démontré qu’il est possible de coculturer et de co-purifier toutes les protéines non ribosomiques requises présentes dans le système PURE. Cette méthode OnePot s’est avérée rentable et rapide, réduisant le temps de préparation de plusieurs semaines à 3 jours ouvrables. L’approche génère un système PURE avec une capacité de production de protéines comparable au système PURExpress disponible dans le commerce20. Contrairement aux approches précédentes pour simplifier la préparation PURE17,18,19, dans l’approche OnePot, toutes les protéines sont encore exprimées en souches séparées. Cela permet à l’utilisateur d’ajuster la composition du système OnePot PURE en omettant ou en ajoutant simplement des souches spécifiques ou en ajustant les volumes d’inoculation, générant ainsi des systèmes PURE de décrochage ou modifiant les rapports protéiques finaux, respectivement.
Le protocole présenté ici fournit une méthode détaillée pour créer le système OnePot PURE tel que décrit précédemment20, bien que β-mercaptoéthanol ait été remplacé par de la tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP). De plus, deux méthodes de purification des ribosomes sont décrites : la purification traditionnelle des ribosomes sans étiquette par interaction hydrophobe et coussin de saccharose, adaptée de Shimizu et al.15,et la purification des ribosomes Ni-NTA basée sur Wang et al.18 et Ederth et al.21 mais significativement modifiée. Cette dernière méthode facilite davantage la préparation du système PURE et le rend accessible à un plus grand nombre de laboratoires, car seul un équipement de laboratoire standard est requis.
Le protocole expérimental résume la préparation d’un système TX-TL polyvalent pure sans cellule pour fournir une plate-forme simple, accordable et rentable sans cellule, qui peut être préparée à l’aide d’un équipement de laboratoire standard en une semaine. En plus d’introduire la composition PURE standard, nous indiquons comment et où elle peut être ajustée, en mettant l’accent sur les étapes critiques du protocole pour assurer la fonctionnalité du système.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

Le système de transcription-traduction PURE (synthèse de protéines à l’aide d’éléments recombinants) défini fournit un châssis attrayant pour la biologie synthétique sans cellules. Malheureusement, les systèmes disponibles dans le commerce sont coûteux et leur accordabilité est limitée. En comparaison, une approche maison peut être personnalisée en fonction des besoins des utilisateurs. Cependant, la préparation de systèmes faits maison prend du temps et est ardue en raison du besoin de ribosomes ainsi que de 36 purifications de protéines à moyenne échelle. La rationalisation de la purification des protéines par coculturation et co-purification permet de minimiser les besoins en temps et en main-d’œuvre. Ici, nous présentons une méthode simple, réglable, rapide et rentable pour produire tous les composants du système PURE en 1 semaine, en utilisant un équipement de laboratoire standard. De plus, les performances du OnePot PURE sont comparables à celles des systèmes disponibles dans le commerce. La méthode de préparation OnePot PURE étend l’accessibilité du système PURE à un plus grand nombre de laboratoires en raison de sa simplicité et de sa rentabilité.

Le protocole ci-dessus est conçu pour faciliter l’établissement du système TX-TL sans cellule PURE dans n’importe quel laboratoire. Le protocole comprend une description détaillée de la préparation des trois parties distinctes du système PURE: la protéine OnePot, le ribosome et la solution énergétique. Un calendrier quotidien détaillé, qui optimise le flux de travail, est présenté dans le tableau 1. Le flux de travail est optimisé pour la purification des ribosomes marqués his, et les délais peuvent différer légèrement si la purification des ribosomes sans étiquette est effectuée. Une préparation fournit une quantité suffisante de PURE pour un minimum de cinq cent réactions de 10 μL. De plus, les solutions préparées sont stables pendant plus d’un an à -80 °C et peuvent résister à plusieurs cycles de gel-dégel.
Des niveaux de surexpression adéquats pour toutes les souches sont cruciaux pour la fonctionnalité de la solution protéique finale. La figure 1 montre la surexpression réussie dans les 36 souches individuelles utilisées par la suite pour la préparation de protéines OnePot. La variation de l’intensité de la bande des protéines sur-exprimées s’est probablement produite en raison d’un biais dans les volumes de chargement sur le gel SDS-PAGE. Les tailles de protéines attendues sont résumées dans le tableau 2. GlyRS et PheRS sont constitués de deux sous-unités de poids moléculaires différents; les 34 protéines restantes sont constituées d’une seule sous-unité. La clé de la simplicité et de l’efficacité temporelle de ce protocole est l’étape de coculturation et de co-purification(Figure 2). La solution protéique OnePot a été préparée en augmentant le rapport de la souche EF-Tu par rapport à toutes les autres souches d’expression. La composition globale des protéines finales a été analysée par SDS-PAGE (Figure 3A). À partir des gels (voies 2, 3), on remarque que l’EF-Tu (43,3 kDa) est présent à une concentration plus élevée que les autres protéines, comme prévu. Bien que le gel fournisse une bonne première indication des rapports d’expression des protéines, il est difficile de déterminer si et à quel niveau chaque protéine individuelle a été exprimée. Par conséquent, il est fortement recommandé de confirmer la surexpression dans chaque souche avant la coculture, comme indiqué ci-dessus.
Le ribosome e. coli est une machine moléculaire complexe composée de plus de 50 sous-unités protéiques individuelles23. Un spectre d’absorption représentatif à 260 nm pour la purification des ribosomes sans étiquette est représenté à la figure 4; le troisième pic est caractéristique d’une élution réussie des ribosomes. Pour les deux méthodes de purification des ribosomes, le schéma de fonctionnement attendu sur le gel SDS-PAGE (Figure 3A)18 a été observé. Nous avons observé des contaminations pour les deux purifications, bien qu’en petites quantités (<10%). Notamment, différents contaminants étaient présents dans les ribosomes sans étiquette (voies 5, 6) et étiquetés His (voies 11, 12) en raison de la variation de la méthode. Pour référence utilisateur, les gels SDS-PAGE pour les systèmes combinés sont également inclus (voies 8, 9 et 14, 15).
Enfin, les performances des systèmes préparés(Figure 3)utilisant les différentes variantes de ribosomes sont comparées. Les cycles temporels de l’expression in vitro de l’eGFP montrent que les deux systèmes PURE sont fonctionnels et produisent de l’eGFP fluorescente. Cependant, la solution protéique OnePot combinée aux ribosomes marqués His, en utilisant la concentration de ribosomes optimisée par titrage, n’a donné qu’un tiers du niveau d’expression de la version de ribosome non marquée(Figure 3B). Des résultats similaires ont été observés lorsque trois protéines de tailles différentes ont été exprimées et étiquetées à l’aide du système de tRNA in vitro Green Lys (Figure 3C). Comme on l’a vu sur le gel fluorescent, les produits pleine longueur ont été exprimés avec succès dans les deux systèmes; cependant, seulement environ la moitié du niveau d’expression a été atteint avec le système de ribosomes His-tag. En plus du marquage par fluorescence, les bandes attendues pour les trois protéines sont distinguables sur un gel coloré par Coomassie(Figure 3D). Les résultats montrent que le système d’expression introduit, qui peut être préparé en une semaine dans un laboratoire équipé d’un équipement standard, peut être utilisé pour l’expression in vitro de protéines codées en aval du promoteur T7 à partir de modèles linéaires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Figure 1: Résultats représentatifs du test de surexpression pour toutes les souches d’expression du système PURE. Le nombre et la taille des protéines PURE sont résumés dans le tableau 2. Les nombres de protéines 21, 24 et 27 sont marqués d’une étoile pour une meilleure visualisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Figure 2: Purification des protéines OnePot. La représentation schématique et les photographies correspondantes de toutes les étapes impliquées dans la production de la solution protéique OnePot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Figure 3: Performances des systèmes préparés utilisant les différentes variantes de ribosomes. (A) Gels SDS-PAGE colorés en bleu de Coomassie de la solution protéique OnePot (voies 2, 3), ribosomes sans étiquette sans solution protéique (voies 5, 6) et avec solution protéique (voies 8, 9), ribosomes marqués His sans solution protéique (voies 11, 12) et avec solution protéique (voies 14, 15). Deux concentrations différentes ont été chargées par échantillon. (B) Comparaison de l’expression eGFP des ribosomes marqués his et des ribosomes sans étiquette. L’intensité de fluorescence de l’expression in vitro de l’eGFP est surveillée au fil du temps pour une réaction PURE à l’aide de ribosomes sans étiquette (1,8 μM, bleu) et de ribosomes marqués His (0,62 μM, rouge). Les concentrations du gabarit linéaire et de la solution protéique OnePot étaient respectivement de 4 nM et 2 mg/mL. Les panneaux (C) et (D) montrent le gel SDS-PAGE de protéines synthétisées dans OnePot avec des ribosomes sans étiquette (1,8 μM, bleu, voies 3, 4, 5) et His-tag (0,62 μM, rouge, voies 6, 7, 8) étiquetés avec un kit de marquage in vitro GreenLys (C) et colorés avec du bleu Coomassie (D), respectivement. Les flèches noires indiquent les bandes attendues de protéines synthétisées : eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Les concentrations du gabarit linéaire et de la solution protéique OnePot étaient de 4 nM et 1,6 mg/mL, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Figure 4: Spectres d’absorbance à 260 nm. Résultats représentatifs des spectres d’absorbance à 260 nm lors de la purification de l’interaction hydrophobe des ribosomes sans étiquette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Un calendrier quotidien optimisé dans le temps pour la préparation de toutes les solutions OnePot PURE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Liste des protéines PURES <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Réactifs. Le tableau énumère les concentrations, les volumes et d’autres détails spécifiques des réactifs et des composants utilisés au cours de cette étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 2 : Tampons. La feuille de calcul répertorie les compositions tampons exactes pour les purifications de protéines, de ribosomes sans étiquette et de ribosomes His-tag, ainsi que les concentrations des solutions mères utilisées pour leur préparation. En outre, il calcule les quantités requises de composants en fonction du volume de tampon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 3 : Calculs des acides aminés. La feuille de calcul répertorie les acides aminés et leurs concentrations recommandées en solution stock requises pour la solution énergétique. Il calcule la quantité d’eau à ajouter à chaque acide aminé en fonction de la masse pesée réelle, et calcule également le volume de la solution d’acides aminés à ajouter au mélange final d’acides aminés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 4 : Solutions de stock pour la solution énergétique. Le tableau répertorie les concentrations et les volumes de solutions de stock nécessaires pour la solution énergétique et indique plus de détails, y compris les conditions de stockage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 5: Solution énergétique. Le tableau énumère les composants de la solution énergétique et leurs concentrations recommandées. En outre, il calcule les volumes requis à ajouter à la solution finale en fonction de leurs concentrations en solution stock et du volume de la solution énergétique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 6 : PCR. Le tableau répertorie les séquences et les concentrations des amorces utilisées pour l’extension PCR et indique les températures de fusion et les étapes du thermocycleur optimisées pour une ADN polymérase haute fidélité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 7: Réaction PURE. La feuille de calcul montre un exemple de configuration d’une réaction PURE. Il énumère les concentrations et les volumes utilisés des composants pour une réaction PURE utilisant des ribosomes sans étiquette ou des ribosomes sans étiquette. De plus, il calcule les rapports de volume pour les titrages de protéines et de ribosomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

OnePot PURE Cell-Free System

Nous présentons une méthode rapide et rentable pour produire le système TX-TL recombinant PURE sans cellule à l’aide d’équipements de laboratoire standard.

Système onePot PURE sans cellule

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Ce protocole pour un système d’expression protéique sans cellules recombinantes, communément appelé système PURE, utilise la culture cellulaire et la purification cellulaire pour rationaliser les purifications protéiques requises. Cela minimise considérablement les besoins en temps et en main-d’œuvre. La méthode OnePot s’est avérée non seulement rentable, mais aussi rapide.Il réduit les temps de préparation de plusieurs semaines à trois jours ouvrables. Cela rend la plate-forme pure sans cellules accessible à un plus grand nombre de laboratoires dans le monde entier et aide à mettre en œuvre cette plate-forme vraiment puissante pour la biologie synthétique sans cellules. Avant de commencer, assurez-vous que toutes les souches sur expriment bien leur protéine respective.Pour commencer, préparez la colonne pour la purification de la protéine OnePot comme décrit dans le manuscrit du texte en utilisant deux millilitres de résine Sepharose, puis chargez la colonne avec du sulfate de nickel. Préparez les cultures de démarrage en combinant 20 millilitres de milieu LB avec 20 microlitres d’ampicilline. Ajouter 300 microlitres du milieu dans 35 puits d’une plaque de puits stérile de 96 profondeurs.Inoculez chacun d’eux avec sa souche respective, à l’exception du facteur d’allongement thermo instable, ou EFTU, et scellez la plaque avec une membrane respirante. Pour la culture EFTU, inoculer trois millilitres d’ampicilline contenant du milieu LB dans un tube de culture de 14 millilitres avec un capuchon encliquetable. Environ trois millilitres de culture EFTU sont suffisants pour une culture d’expression OnePot.Incubez-le à 37 degrés Celsius tout en secouant à 260 rotations par minute pendant la nuit. Le lendemain, transférez 500 millilitres de milieu LB et 500 microlitres d’ampicilline dans la fiole stérile déconcertée. Inoculer la culture OnePot PURE avec 1 675 microlitres de la culture EFTU et 55 microlitres de chacune des cultures de la plaque de puits profond.Incuber la culture pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec une secousse de 260 rotations par minute, ou jusqu’à ce que la densité optique de la culture atteigne 0,2 à 0,3. Induire la culture avec 500 microlitres de 0,1 millimolaire IPTG et croître pendant trois heures supplémentaires. Récoltez les cellules par centrifugation à quatre degrés Celsius et 3 220 fois G pendant 10 minutes, et conservez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure.Le troisième jour, mesurez les quantités de tampons nécessaires à leur purification et ajoutez du TCEP à chacun d’eux comme indiqué dans le texte. Stockez les tampons restants sans TCEP à quatre degrés Celsius pour les purifications futures. Équilibrez la colonne chargée avec 30 millilitres de tampon A.Après le passage de 25 millilitres de tampon A, fermez la colonne par le bas.Décongelez les cellules et utilisez une pipette sérologique pour ressuspender la pastille de cellule dans 7,5 millilitres de tampon A.Lyse les cellules à l’aide d’une sonde de 130 watts. Si la sonication réussit, la solution deviendra plus sombre. Assurez-vous de garder les cellules sur la glace et placez la sonde assez profondément sans toucher le tube.Enlevez les débris cellulaires par centrifugation à 21, 130 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et gardez le lysate sur la glace. Ajoutez le surnageant à la colonne équilibrée. Fermez la colonne par le haut et assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite.Incuber la colonne pendant trois heures à quatre degrés Celsius en rotation à l’aide d’un rotateur à tube. Éluez les composants non liés de la colonne et lavez avec 25 millilitres de tampon A.Lavez la colonne avec 25 millilitres de tampon imidazole de 25 millimolaires. Éluez les protéines avec cinq millilitres de tampon imidazole de 450 millimolaires et gardez les protéines éluées sur la glace en tout temps.Diluer l’éluat avec 25 millilitres de tampon HT et garder le mélange sur glace. Ajouter 15 millilitres à un filtre centrifuge de 15 millilitres et concentrer à un volume de 1,5 millilitre. Ajouter les 15 millilitres restants au filtre avec la solution concentrée et concentrer à nouveau à 1,5 millilitre.Ajouter 10 millilitres de tampon HT à l’échantillon concentré et concentrer à un millilitre. Récupérez l’échantillon concentré et ajoutez une quantité égale de tampon B et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Pendant l’échange de mémoire tampon, restaurez la colonne comme spécifié dans le texte.Le quatrième jour, mesurez la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford. Concentrer l’échantillon avec 0,5 millilitre de filtre centrifuge de coupure de trois kilodaltons à 20 milligrammes par millilitre. Vérifiez la composition de la protéine OnePot PURE à l’aide de la page SDS.Diluer 2,5 microlitres de l’échantillon avec 7,5 microlitres d’eau mélangés à 10 microlitres de deux tampons X Laemmli, puis charger cinq microlitres et 2,5 microlitres des échantillons sur le gel. Exécutez la page SDS comme spécifié dans le texte. Remplissez la concentration et la longueur de l’ADN dans les cellules jaunes correspondantes dans la feuille de calcul en utilisant deux à 10 nanomolaires d’ADN pour la réaction.Remplissez le volume total de réaction souhaité en microlitres. Retirez les réactifs requis du congélateur et décongelez-les sur de la glace. Ensuite, pipettez les quantités calculées d’eau, d’ADN et de solution d’énergie d’un côté du tube PCR ou d’un coin d’un puits sur la plaque de puits 384.Pipeter les quantités calculées de protéines et de solution de ribosomes de l’autre côté d’un tube pcR ou dans le coin opposé de la plaque de puits 384. Tournez pendant environ 30 secondes pour fusionner les composants de la réaction. Pour éviter l’évaporation pendant les expériences de lecture de plaques, ajoutez 35 microlitres de cire liquide et scellez la plaque avec un scellant transparent.Incuber pendant au moins trois heures à 37 degrés Celsius. Pour la lecture sur un lecteur de plaques, mesurez l’intensité de la floraison à la longueur d’onde requise toutes les deux minutes. La sur-expression réussie dans toutes les souches individuelles utilisées par la suite pour la préparation de protéines OnePot est montrée ici.La composition globale de la solution finale de protéine OnePot PURE a été analysée par page SDS. Il est à noter que l’EFTU est présent à une concentration plus élevée par rapport aux autres protéines, comme prévu. Les rendements de synthèse de la solution protéique OnePot combinée aux ribosomes marqués ou non marqués his ont été analysés en surveillant la fluorescence eGFP au fil du temps.Les niveaux d’expression de trois protéines différentes étiquetées à l’aide du système de étiquetage in vitro de l’ARNt de la liste verte, ou coloration de Kumasi, ont été analysés sur un gel de page SDS. Pour un système PURE fonctionnel, il est absolument essentiel que toutes les souches expriment bien leurs protéines respectives. Cette technique facilite la mise en œuvre du système PURE dans l’ingénierie des systèmes biologiques, permettant le développement de nouveaux réseaux génétiques, de diagnostics moléculaires, de thérapies et de kits éducatifs.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection &amp; identification au moyen de capteurs électrochimiques

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Recherche

Bio-ingénierie

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

L&#39;encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Tableaux Scellable femtolitre Chambre pour la biologie acellulaire

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Une orbitale secouant la Culture des cellules de mammifères dans les vaisseaux en forme de O pour produire des agrégats uniformes

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Acellulaire Protein Expression utilisant la rapide croissance bactérie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Une plate-forme microfluidique multicouche pour la conduite d'une expression génique prolongée sans cellules

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Mesure de la cinématique 3D in vivo de l’épaule à l’aide de la vidéoradiographie biplanaire

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Méthodes enzymatiques rapides pour l’amplification de modèles linéaires minimaux pour le prototypage de protéines à l’aide de systèmes sans cellules

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...