Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Horizon 2020 Research and Innovation Program Grant der Europäischen Union 723106, einem Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds (182019) und der EPFL unterstützt.

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	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PURE+technology.">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).</li><li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li><li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli.">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).</li><li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein einfaches, zeit- und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung eines vielseitigen PURE-Expressionssystems20 auf Basis der Standardzusammensetzung15. Durch die Verwendung des Protokolls zusammen mit den mitgelieferten Tagesplänen (Tabelle 1) können alle Komponenten in 1 Woche vorbereitet werden und mengenmäßige Mengen ergeben, die für bis zu fünfhundert 10 μL PURE-Reaktionen ausreichen. Da die in diesem Protokoll verwendeten Proteine aus Plasmiden mit hoher Kopie überexprimiert werden und eine geringe Toxizität für E. coliaufweisen, werden gute Expressionsniveaus für alle erforderlichen Proteine beobachtet (Abbildung 1). Dies ermöglicht die einfache Anpassung der Stämme und damit auch der Proteinzusammensetzung in Kokulturen, indem einfach die Verhältnisse der Impfstämme modifiziert werden20. Neben den ribosomalen Proteinen erwies sich die Konzentration von EF-Tu als von grundlegender Bedeutung für die Expressionergibt 6. Im Gegensatz dazu hatten Änderungen in der Konzentration der anderen Proteinbestandteile einen relativ geringen Einfluss auf die Robustheit des PURE-Systems7,24. Daher kann durch Anpassung des Impfverhältnisses von EF-Tu in Bezug auf alle anderen Komponenten eine vergleichbare Zusammensetzung zur Standard-PURE-Zusammensetzung erreicht und ein PURE-System mit einer ähnlichenAusbeute von 20 erreicht werden. Bei der Herstellung der Proteinlösung ist es entscheidend sicherzustellen, dass alle Stämme gut wachsen und das kodierte Protein nach der Induktion überexprimieren (Abbildung 1).
Die Ribosomenfunktion ist der Schlüssel für die Gesamtleistung des PURE-Systems24. In diesem Protokoll werden zwei verschiedene Methoden zur Herstellung der Ribosomenlösung demonstriert, nämlich die Tag-freie und die His-getaggte Ribosomenreinigung. Die tagfreie Ribosomenreinigung basiert auf einer hydrophoben Interaktionschromatographie, gefolgt von einer Zentrifugation mit einem Saccharosekissen, die den Zugang zu einem FPLC-Reinigungssystem und einer Ultrazentrifuge15erfordert. Im Gegensatz dazu erfordert die Methode, die His-getaggte Ribosomen18 und Schwerkraftflussaffinitätschromatographie-Reinigung verwendet, keine spezielle Ausrüstung und kann in den meisten Labors durchgeführt werden. Die letztere Methode bringt daher Vorteile wie Einfachheit und Zugänglichkeit mit sich. Allerdings beobachteten wir eine signifikant geringere Syntheseausbeute bei Verwendung der His-getaggten Ribosomen im OnePot PURE im Vergleich zur Tag-freien Variante (Abbildung 3). Je nach Art der Anwendung kann diese geringere Ausbeute akzeptabel sein.
Die Energielösung liefert die niedermolekularen Komponenten und tRNAs, die erforderlich sind, um in vitro TX-TL-Reaktionen anzutreiben. Dieses Protokoll bietet ein Rezept für eine typische Energielösung, die leicht an die Benutzerbedürfnisse angepasst werden kann. Zusammen mit tRNA, NTP und Kreatinphosphat waren die Häufigkeit und Konzentration vonMg2+-Ionen entscheidend für die Gesamtleistung des PURE-Systems8,da sie kritische Cofaktoren für Transkription und Translation sind. In einigen Fällen kann die Titration von Ionen daher die gesamte PURE-Leistung erheblich verbessern. DNA-Integrität ist entscheidend für die PURE-Leistung. Daher hilft die Sequenzverifizierung der Promotorregion, der Ribosomenbindungsstelle und des Zielgens und die Sicherstellung, dass eine ausreichende DNA-Konzentration (<2 nM) bei der Behebung von Problemen, die beim Einrichten einer PURE-Reaktion auftreten können.
Das PURE-System ist ein minimales TX-TL-System, und spezifische Anwendungen können daher zusätzliche Anpassungen erfordern25. Diese können den Einbau verschiedener RNA-Polymerasen9,26, Chaperone13und Proteinfaktoren wie EF-P oder ArfA8umfassen . Obwohl die Expressionsstämme für diese Proteine in die Kokulturen aufgenommen werden können, kann die separate Zugabe zu dem vorbereiteten System eine bessere Kontrolle der erforderlichen Proteinspiegel ermöglichen. Weiterhin ist der Einschluss von Vesikeln essentiell für die Produktion von Membranproteinen10,11. Oxidierende statt reduzierende Umgebungen und eine Disulfidbindungsisomerase erleichtern eine ordnungsgemäße Disulfidbindungsbildung, die beispielsweise für sekretorische Proteine erforderlich sind12.
Es muss unbedingt sichergestellt werden, dass zusätzliche Komponenten die Reaktion nicht stören. Die wichtigsten Faktoren, auf die Beim Einrichten einer Reaktion oder beim Hinzufügen anderer Komponenten zu achten ist, sind unten aufgeführt. Stellen Sie sicher, dass weder inkompatible Puffer verwendet werden noch die Ionenkonzentrationen gestört werden. Vermeiden Sie Lösungen, die Glycerin, hohe Konzentrationen von Kalium, Magnesium, Calciumionen, Osmolyten, Pyrophosphat, Antibiotika oder EDTA enthalten, so weit wie möglich. Zum Beispiel kann das Ersetzen eines Elutionspuffers durch Wasser während der DNA-Reinigung von Vorteil sein, da EDTA ein üblicher Zusatzstoff in diesem Puffer ist. Die Versorgung der Lösungen mit zusätzlichen negativ geladenen Molekülen wie NTP oder dNTP erfordert eine Anpassung der Magnesiumkonzentration8, da sich die negativ geladenen Moleküle als Chelatbildner verhalten und positiv geladene Moleküle binden. Ein neutraler pH-Wert ist ideal für die Reaktion. Dementsprechend sollten alle Komponenten auf den entsprechenden pH-Wert gepuffert werden; Dies ist besonders wichtig für stark saure oder basische Moleküle wie NTPs. Schließlich sind Temperatur und Volumen Schlüsselparameter für die Reaktion. Um eine gute Ausbeute zu erzielen, sollte man eine Temperatur um 37 °C implementieren, da Temperaturen unter 34 °C die Ausbeute deutlich reduzieren27.
Es ist wichtig zu beachten, dass vor der Vorbereitung des OnePot PURE die Zielanwendung und die damit verbundenen Anforderungen wie Volumen, Reinheit, Einfache Änderung und Aufnahme oder Wegfall von Komponenten berücksichtigt werden sollten. Für viele Anwendungen ist das System eine ausgezeichnete Wahl, aber andere erfordern möglicherweise Erträge, Anpassungsfähigkeit und andere Faktoren, die das OnePot-System nicht bieten kann. Unabhängig davon wird das eingeführte Protokoll für die Vorbereitung eines hausgemachten Systems von Vorteil sein, da alle kritischen Schritte für eine solche Vorbereitung hier zusammengefasst sind.
Einer der Hauptvorteile des OnePot-Systems ist seine Kompatibilität mit dem handelsüblichen PURExpress-System, das die Möglichkeit bietet, die Funktionalität und Integrität aller Komponenten separat zu testen, indem jede PURExpress-Komponente nacheinander durch ihr OnePot-Äquivalent ersetzt wird. Die Vorteile des OnePot PURE-Systems, wie Abstimmbarkeit und einfache, schnelle und kostengünstige Zubereitung, werden zellfreies TX-TL für mehr Labore weltweit zugänglich machen und dazu beitragen, die Implementierung dieser leistungsstarken Plattform in der zellfreien synthetischen Biologie zu erweitern.

Zellfreie Transkriptionstranslationssysteme (TX-TL) stellen eine vielversprechende Plattform für die Untersuchung und Das Engineering biologischer Systeme dar. Sie bieten vereinfachte und abstimmbare Reaktionsbedingungen, da sie nicht mehr auf lebenserhaltende Prozesse angewiesen sind, einschließlich Wachstum, Homöostase oder Regulationsmechanismen1. Daher wird erwartet, dass zellfreie Systeme zur Untersuchung biomolekularer Systeme beitragen, einen Rahmen für die Erprobung rationaler Biodesignstrategien2bieten und ein Chassis für eine zukünftige synthetische Zellebereitstellen 3,4. Das voll rekombinante PURE-System bietet aufgrund seiner definierten und minimalen Zusammensetzung sowie seiner Einstellbarkeit und Abstimmbarkeit ein besonders ansprechendes Chassis5.
Seit der Etablierung des ersten funktionellen, vollständig rekombinanten PURE-Systems im Jahr 20015wurden Anstrengungen unternommen, die Systemgrenzen zu erweitern und die Zusammensetzung des Systems zu optimieren, um dieSystemausbeuten 6,7,8zuverbessern , die Transkriptionsregulation 9 ,Membran 10,11 und sekretorische Proteinsynthese12zu ermöglichen und die Proteinfaltung zu erleichtern13,14 . Heutzutage gibt es drei kommerziell erhältliche Systeme: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) und Magic PURE (Creative Biolabs). Diese Systeme sind jedoch teuer, ihre genaue Zusammensetzung ist proprietär und daher unbekannt, und die Anpassungsfähigkeit ist begrenzt.
Die im eigenen Haus hergestellten PURE-Systeme erwiesen sich als die kostengünstigste und abstimmbarste Option15,16. Die erforderlichen 37 Reinigungsschritte für Protein- und Ribosomfraktionen sind jedoch zeitaufwendig und mühsam. Es wurden mehrere Versuche unternommen, die Effizienz der PURE-Systemvorbereitung17,18,19zu verbessern. Wir haben kürzlich gezeigt, dass es möglich ist, alle erforderlichen nicht-ribosomalen Proteine, die im PURE-System vorhanden sind, zu kokulturieren und zu reinigen. Diese OnePot-Methode hat sich als kostengünstig und zeiteffizient erwiesen und die Vorbereitungszeit von mehreren Wochen auf 3 Arbeitstage verkürzt. Der Ansatz erzeugt ein PURE-System mit einer Proteinproduktionskapazität, die mit dem kommerziell erhältlichen PURExpress-System20vergleichbar ist. Im Gegensatz zu den bisherigen Ansätzen zur Vereinfachung derPURE-Zubereitung 17,18,19werden beim OnePot-Ansatz alle Proteine noch in getrennten Stämmen exprimiert. Dies ermöglicht es dem Benutzer, die Zusammensetzung des OnePot PURE-Systems zu optimieren, indem er lediglich bestimmte Stämme weglässt oder hinzufügt oder die Impfvolumina anpasst, wodurch Dropout-PURE-Systeme erzeugt werden oder die endgültigen Proteinverhältnisse verändert werden.
Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine detaillierte Methode zur Erstellung des OnePot PURE-Systems wie zuvor beschrieben20,obwohl β-Mercaptoethanol durch Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) ersetzt wurde. Darüber hinaus werden zwei Methoden zur Ribosomenreinigung beschrieben: die traditionelle tagfreie Ribosomenreinigung mittels hydrophober Wechselwirkung und Saccharosekissen, angepasst an Shimizu et al.15,und die Ni-NTA-Ribosomenreinigung basierend auf Wang et al.18 und Ederth et al.21, aber signifikant modifiziert. Die letztgenannte Methode erleichtert die Vorbereitung des PURE-Systems weiter und macht es mehr Laboren zugänglich, da nur Standard-Laborgeräte benötigt werden.
Das experimentelle Protokoll fasst die Vorbereitung eines vielseitigen PURE-zellfreien TX-TL-Systems zusammen, um eine einfache, abstimmbare, kostengünstige zellfreie Plattform bereitzustellen, die mit Standard-Laborgeräten innerhalb einer Woche hergestellt werden kann. Neben der Einführung der STANDARDMÄßIGEN PURE-Zusammensetzung geben wir an, wie und wo sie angepasst werden kann, wobei der Schwerpunkt auf kritischen Schritten im Protokoll liegt, um die Funktionalität des Systems sicherzustellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

Das definierte Transkriptions-Translationssystem PURE (Protein synthesis using recombinant elements) bietet ein attraktives Chassis für zellfreie synthetische Biologie. Leider sind kommerziell erhältliche Systeme teuer und ihre Abstimmbarkeit ist begrenzt. Im Vergleich dazu kann ein hausgemachter Ansatz basierend auf den Bedürfnissen der Benutzer angepasst werden. Die Herstellung von hausgemachten Systemen ist jedoch zeitaufwendig und mühsam, da Ribosomen sowie 36 Proteinreinigungen im mittleren Maßstab benötigt werden. Die Rationalisierung der Proteinreinigung durch Kokulturation und Co-Reinigung ermöglicht die Minimierung von Zeit- und Arbeitsaufwand. Hier stellen wir Ihnen eine einfache, einstellbare, zeit- und kostengünstige Methode vor, um alle PURE Systemkomponenten innerhalb von 1 Woche mit Standard-Laborgeräten herzustellen. Darüber hinaus ist die Leistung des OnePot PURE vergleichbar mit handelsüblichen Systemen. Die OnePot PURE-Präparationsmethode erweitert die Zugänglichkeit des PURE-Systems aufgrund seiner Einfachheit und Kosteneffizienz auf mehr Labore.

Das obige Protokoll wurde entwickelt, um die Etablierung des zellfreien TX-TL-Systems PURE in jedem Labor zu erleichtern. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der drei verschiedenen Teile des PURE-Systems: das OnePot-Protein, das Ribosom und die Energielösung. Ein detaillierter Tagesablauf, der den Workflow optimiert, ist in Tabelle 1 dargestellt. Der Workflow ist für die Reinigung von His-getaggten Ribosomen optimiert, und die Zeitrahmen können sich geringfügig unterscheiden, wenn eine tagfreie Ribosomenreinigung durchgeführt wird. Ein Präparat liefert eine ausreichende Menge an PURE für mindestens fünfhundert 10 μL-Reaktionen. Darüber hinaus sind die vorbereiteten Lösungen mehr als ein Jahr lang bei -80 °C stabil und können mehreren Frost-Tau-Zyklen standhalten.
Ausreichende Überexpressionswerte für alle Stämme sind entscheidend für die Funktionalität der endgültigen Proteinlösung. Abbildung 1 zeigt die erfolgreiche Überexpression in allen 36 Einzelstämmen, die anschließend für die OnePot-Proteinzubereitung verwendet wurden. Variationen in den Bandenintensitäten der überexprimierten Proteine traten höchstwahrscheinlich aufgrund einer Verzerrung der Ladevolumina auf das SDS-PAGE-Gel auf. Die erwarteten Proteingrößen sind in Tabelle 2zusammengefasst. GlyRS und PheRS bestehen aus zwei Untereinheiten unterschiedlicher Molekulargewichte; die restlichen 34 Proteine bestehen aus einer einzigen Untereinheit. Der Schlüssel zur Einfachheit und Zeitwirksamkeit dieses Protokolls ist der Kokulturations- und Co-Reinigungsschritt (Abbildung 2). Die OnePot-Proteinlösung wurde hergestellt, indem das Verhältnis des EF-Tu-Stammes zu allen anderen Expressionsstämmen erhöht wurde. Die Gesamtzusammensetzung der endgültigen Proteine wurde mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung 3A). Von den Gelen (Bahnen 2, 3) fällt auf, dass EF-Tu (43,3 kDa) erwartungsgemäß in einer höheren Konzentration im Vergleich zu den anderen Proteinen vorliegt. Während das Gel einen guten ersten Hinweis auf Proteinexpressionsverhältnisse liefert, ist es schwierig zu bestimmen, ob und auf welcher Ebene jedes einzelne Protein exprimiert wurde. Daher wird dringend empfohlen, die Überexpression in jedem Stamm vor der Kokulturation zu bestätigen, wie oben gezeigt.
Das E. coli-Ribosom ist eine komplexe molekulare Maschine, die aus über 50 einzelnen Proteinuntereinheiten besteht23. Ein repräsentatives Absorptionsspektrum bei 260 nm für die tagfreie Ribosomenreinigung ist in Abbildung 4dargestellt; der dritte Peak ist charakteristisch für eine erfolgreiche Ribosomenelution. Für beide Ribosomenreinigungsmethoden wurde das erwartete Ablaufmuster auf dem SDS-PAGE-Gel (Abbildung 3A)18 beobachtet. Wir beobachteten Kontaminationen für beide Reinigungen, wenn auch in kleinen Mengen (<10%). Insbesondere waren in den Tag-freien (Bahnen 5, 6) und His-markierten (Bahnen 11, 12) Ribosomen aufgrund der Variation der Methode unterschiedliche Verunreinigungen vorhanden. Zur Benutzerreferenz sind auch die SDS-PAGE-Gele für die kombinierten Systeme enthalten (Bahnen 8, 9 und 14, 15).
Abschließend wird die Leistungsfähigkeit der präparierten Systeme (Abbildung 3) unter Verwendung der verschiedenen Ribosomenvarianten verglichen. Die Zeitverläufe der in vitro eGFP-Expression zeigen, dass beide PURE-Systeme funktionsfähig sind und fluoreszierendes eGFP produzieren. Die OnePot-Proteinlösung in Kombination mit den His-getaggten Ribosomen ergab jedoch unter Verwendung der durch Titration optimierten Ribosomenkonzentration nur ein Drittel des Expressionsniveaus der nicht markierten Ribosomenversion (Abbildung 3B). Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, als drei Proteine unterschiedlicher Größe mit dem Green Lys tRNA in vitro Markierungssystem exprimiert und markiert wurden (Abbildung 3C). Wie auf dem fluoreszierenden Gel zu sehen ist, wurden Produkte in voller Länge in beiden Systemen erfolgreich exprimiert; allerdings wurde nur etwa die Hälfte des Expressionsniveaus mit dem His-Tag-Ribosomensystem erreicht. Neben der Fluoreszenzmarkierung sind die erwarteten Banden für alle drei Proteine auf einem Coomassie-gefärbten Gel unterscheidbar (Abbildung 3D). Die Ergebnisse zeigen, dass das eingeführte Expressionssystem, das innerhalb einer Woche in einem Labor mit Standardausrüstung hergestellt werden kann, für die In-vitro-Expression von Proteinen verwendet werden kann, die nach dem T7-Promotor aus linearen Schablonen kodiert sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse für den Überexpressionstest für alle Expressionsstämme des PURE-Systems. Pure Proteinzahlen und -größen sind in Tabelle 2zusammengefasst. Die Proteinnummern 21, 24 und 27 sind zur besseren Visualisierung mit einem Stern markiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Abbildung 2: OnePot Proteinreinigung. Die schematische Darstellung und die entsprechenden Fotos aller Schritte, die an der Herstellung der OnePot-Proteinlösung beteiligt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Abbildung 3: Leistungsfähigkeit der hergestellten Systeme unter Verwendung der verschiedenen Ribosomenvarianten. (A) Coomassie blau gefärbte SDS-PAGE Gele der OnePot Proteinlösung (Bahnen 2, 3), tagfreie Ribosomen ohne Proteinlösung (Bahnen 5, 6) und mit Proteinlösung (Bahnen 8, 9), His-markierte Ribosomen ohne Proteinlösung (Bahnen 11, 12) und mit Proteinlösung (Bahnen 14, 15). Pro Probe wurden zwei verschiedene Konzentrationen geladen. (B) Vergleich der eGFP-Expression von His-markierten Ribosomen und tagfreien Ribosomen. Die Fluoreszenzintensität der in vitro eGFP-Expression wird im Laufe der Zeit für eine PURE-Reaktion mit tagfreien Ribosomen (1,8 μM, blau) und His-getaggten Ribosomen (0,62 μM, rot) überwacht. Die Konzentrationen der linearen Schablone und der OnePot-Proteinlösung betrugen 4 nM bzw. 2 mg/ml. Die Panels (C) und (D) zeigen das SDS-PAGE-Gel von Proteinen, die in OnePot mit Tag-freien (1,8 μM, Blau, Bahnen 3, 4, 5) und His-Tag-Ribosomen (0,62 μM, Rot, Bahnen 6, 7, 8) synthetisiert und mit einem GreenLys-In-vitro-Markierungskit (C) markiert und mit Coomassie-Blau (D) gefärbt sind. Die schwarzen Pfeile zeigen die erwarteten Banden der synthetisierten Proteine an: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Die Konzentrationen der linearen Template- und OnePot-Proteinlösung betrugen 4 nM bzw. 1,6 mg/ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Abbildung 4: Absorptionsspektren bei 260 nm. Repräsentative Ergebnisse von Absorptionsspektren bei 260 nm während der hydrophoben Wechselwirkungsreinigung von tagfreien Ribosomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Ein täglicher zeitoptimierter Zeitplan für die Vorbereitung aller OnePot PURE Lösungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: PURE Proteinliste <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Reagenzien. Die Tabelle listet Konzentrationen, Volumina und andere spezifische Details der Reagenzien und Komponenten auf, die während dieser Studie verwendet wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Puffer. Die Tabelle listet die genauen Pufferzusammensetzungen für Protein-, Tag-freie Ribosomen- und His-Tag-Ribosomenreinigungen sowie die Konzentrationen der für ihre Herstellung verwendeten Stammlösungen auf. Darüber hinaus berechnet es die erforderlichen Mengen an Komponenten basierend auf dem Puffervolumen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 3: Aminosäureberechnungen. Die Tabelle listet die Aminosäuren und ihre empfohlenen Stammlösungskonzentrationen auf, die für die Energielösung erforderlich sind. Es berechnet die Menge an Wasser, die jeder Aminosäure zugesetzt werden soll, basierend auf der tatsächlich gewogenen Masse, und berechnet auch das Volumen der Aminosäurelösung, die der endgültigen Aminosäuremischung zugesetzt werden soll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 4: Bestandslösungen für die Energielösung. Die Tabelle listet die Konzentrationen und Volumina der für die Energielösung benötigten Stammlösungen auf und gibt weitere Details, einschließlich der Lagerbedingungen, an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 5: Energielösung. Die Tabelle listet die Komponenten der Energielösung und ihre empfohlenen Konzentrationen auf. Darüber hinaus berechnet es ihre erforderlichen Volumina, die der endgültigen Lösung hinzugefügt werden sollen, basierend auf ihren Stammlösungskonzentrationen und dem Volumen der Energielösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 6: PCR. Die Tabelle listet Sequenzen und Konzentrationen der für die Erweiterungs-PCR verwendeten Primer auf und zeigt Schmelztemperaturen und Thermocyclerschritte an, die für eine High-Fidelity-DNA-Polymerase optimiert sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 7: REINE Reaktion. Die Tabelle zeigt ein Beispiel für die Einrichtung einer PURE-Reaktion. Es listet die verwendeten Konzentrationen und Volumina der Komponenten für eine PURE-Reaktion unter Verwendung von Tag-freien Ribosomen oder His-Tag-Ribosomen auf. Darüber hinaus berechnet es die Volumenverhältnisse für Protein- und Ribosomtitrationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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OnePot PURE Cell-Free System

Wir präsentieren eine schnelle und kostengünstige Methode zur Herstellung des rekombinanten PURE zellfreien TX-TL-Systems mit Standard-Laborgeräten.

OnePot PURE Zellfreies System

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Dieses Protokoll für ein rekombinantes zellfreies Proteinexpressionssystem, allgemein bekannt als pure-System, nutzt Zellkultivierung und Zellreinigung, um die erforderlichen Proteinreinigungen zu rationalisieren. Dies minimiert den Zeit- und Arbeitsaufwand erheblich. Die OnePot-Methode hat sich nicht nur als kostengünstig, sondern auch als zeiteffizient erwiesen.Es verkürzt die Vorbereitungszeiten von mehreren Wochen auf drei Arbeitstage. Dies macht die ZELLFREIE PURE-Plattform für mehr Labore weltweit zugänglich und hilft, diese wirklich leistungsstarke Plattform für synthetische zellfreie Biologie zu implementieren. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass alle Stämme ihr jeweiliges Protein gut überexprimieren.Bereiten Sie zunächst die Säule für die OnePot-Proteinreinigung vor, wie im Textmanuskript beschrieben, mit zwei Millilitern Sepharoseharz und laden Sie die Säule dann mit Nickelsulfat auf. Bereiten Sie die Starterkulturen vor, indem Sie 20 Milliliter LB-Medien mit 20 Mikrolitern Ampicillin kombinieren. Fügen Sie 300 Mikroliter des Mediums in 35 Vertiefungen einer sterilen 96 Tiefbrunnenplatte hinzu.Impfen Sie jeden von ihnen mit seiner jeweiligen Dehnung, mit Ausnahme des Dehnungsfaktors thermo instabil oder EFTU, und versiegeln Sie die Platte mit einer atmungsaktiven Membran. Für die EFTU-Kultur sind drei Milliliter Ampicillin-haltige LB-Medien in einem 14-Milliliter-Kulturröhrchen mit Schnappverschluss zu impfen. Etwa drei Milliliter EFTU-Kultur reichen für eine OnePot-Ausdruckskultur aus.Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius, während Sie es über Nacht mit 260 Umdrehungen pro Minute schütteln. Am nächsten Tag werden 500 Milliliter LB-Medien und 500 Mikroliter Ampicillin in den sterilen Schalldämpferkolben gegeben. Impfen Sie die OnePot PURE-Kultur mit 1.675 Mikrolitern der EFTU-Kultur und 55 Mikrolitern jeder der Kulturen aus der Tiefbrunnenplatte.Inkubieren Sie die Kultur für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius mit einem Schütteln von 260 Umdrehungen pro Minute oder bis die optische Dichte der Kultur 0,2 bis 0,3 erreicht. Induzieren Sie die Kultur mit 500 Mikrolitern 0,1 Millimolar IPTG und wachsen Sie für weitere drei Stunden. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius und 3,220 mal G für 10 Minuten und lagern Sie das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung.Messen Sie am dritten Tag die Mengen an Puffern, die für ihre Reinigung benötigt werden, und fügen Sie TCEP zu allen hinzu, wie im Text angegeben. Lagern Sie die restlichen Puffer ohne TCEP bei vier Grad Celsius für zukünftige Reinigungen. Die geladene Spalte mit 30 Millilitern Puffer A ausgleichen.Nachdem 25 Milliliter Puffer A passiert sind, schließen Sie die Säule von unten.Tauen Sie die Zellen auf und verwenden Sie eine serologische Pipette, um das Zellpellet in 7,5 Milliliter Puffer A zu resuspendieren.Lyse sie die Zellen mit einer 130-Watt-Sonde. Wenn die Beschallung erfolgreich ist, wird die Lösung dunkler. Achten Sie darauf, die Zellen auf Eis zu halten und die Sonde tief genug zu platzieren, ohne das Röhrchen zu berühren.Entfernen Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 21,130 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius und halten Sie das Lysat auf Eis. Fügen Sie den Überstand der äquilibrierten Spalte hinzu. Schließen Sie die Säule von oben und stellen Sie sicher, dass keine Leckage vorhanden ist.Inkubieren Sie die Säule drei Stunden bei vier Grad Celsius unter Rotation mit einem Rohrrotator. Eluieren Sie ungebundene Komponenten aus der Säule und waschen Sie sie mit 25 Millilitern Puffer A.Waschen Sie die Säule mit 25 Millilitern 25 Millimol-Imidazolpuffer. Eluieren Sie die Proteine mit fünf Millilitern 450 Millimolar Imidazol-Puffer und halten Sie die eluierten Proteine jederzeit auf Eis.Verdünnen Sie das Eluat mit 25 Millilitern HT-Puffer und bewahren Sie die Mischung auf Eis auf. 15 Milliliter in einen 15 Milliliter Zentrifugalfilter geben und auf ein Volumen von 1,5 Milliliter konzentrieren. Die restlichen 15 Milliliter mit der konzentrierten Lösung in den Filter geben und erneut auf 1,5 Milliliter konzentrieren.10 Milliliter HT-Puffer in die konzentrierte Probe geben und auf einen Milliliter konzentrieren. Gewinnen Sie die konzentrierte Probe zurück und fügen Sie eine gleiche Menge Anratspuffer B hinzu und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Stellen Sie während des Pufferaustauschs die Spalte wie im Text angegeben wieder her.Messen Sie am vierten Tag die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay. Konzentrieren Sie die Probe mit 0,5 Millilitern drei Kilodalton Cutoff-Zentrifugalfilter auf 20 Milligramm pro Milliliter. Überprüfen Sie die OnePot PURE-Proteinzusammensetzung mithilfe der SDB-Seite.Verdünnen Sie 2,5 Mikroliter der Probe mit 7,5 Mikrolitern Wasser gemischt mit 10 Mikrolitern von zwei X Laemmli-Puffern und laden Sie dann fünf Mikroliter und 2,5 Mikroliter der Proben auf das Gel. Führen Sie die SDB-Seite wie im Text angegeben aus. Geben Sie die Konzentration und Länge der DNA in den entsprechenden gelben Zellen in der Tabelle mit zwei bis 10 Nanomol DNA für die Reaktion ein.Füllen Sie das gewünschte Gesamtreaktionsvolumen in Mikrolitern ein. Nehmen Sie die benötigten Reagenzien aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie auf Eis auf. Dann pipettieren Sie die berechneten Mengen an Wasser, DNA und Energielösung auf eine Seite des PCR-Röhrchens oder eine Ecke eines Brunnens auf der 384-Well-Platte.Die berechneten Mengen an Protein- und Ribosomenlösung werden auf die andere Seite eines PCR-Röhrchens oder die gegenüberliegende Ecke der 384-Well-Platte pipettiert. Drehen Sie sich etwa 30 Sekunden lang, um die Reaktionskomponenten zusammenzuführen. Um die Verdunstung während der Experimente mit dem Plattenleser zu verhindern, fügen Sie 35 Mikroliter flüssiges Wachs hinzu und versiegeln Sie die Platte mit einem transparenten Dichtmittel.Mindestens drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Für die Anzeige auf einem Plattenleser messen Sie alle zwei Minuten die Blütenstandsintensität bei der erforderlichen Wellenlänge. Die erfolgreiche Überexpression in allen einzelnen Stämmen, die anschließend für die OnePot-Proteinpräparation verwendet wurden, wird hier gezeigt.Die Gesamtzusammensetzung der endgültigen OnePot PURE Proteinlösung wurde von der SDS-Seite analysiert. Auffällig ist, dass EFTU im Vergleich zu den anderen Proteinen erwartungsgemäß in einer höheren Konzentration vorliegt. Die Syntheseausbeuten der OnePot-Proteinlösung in Kombination mit den His-markierten oder nicht markierten Ribosomen wurden analysiert, indem die eGFP-Fluoreszenz im Laufe der Zeit überwacht wurde.Die Expressionsniveaus von drei verschiedenen Proteinen, die mit dem Grünen Liste tRNA in vitro Markierungssystem oder Kumasi Färbung markiert wurden, wurden auf einem SDS-Seitengel analysiert. Für ein funktionierendes PURE-System ist es absolut entscheidend, dass alle Stämme ihre jeweiligen Proteine gut exprimieren. Diese Technik erleichtert die Implementierung des PURE-Systems in die biologische Systemtechnik und ermöglicht die Entwicklung neuartiger genetischer Netzwerke, molekularer Diagnostik, Therapeutika und Bildungskits.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Forschung

Biotechnik

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Plombierbare Femtoliter Kammer Arrays für Zellfreie Biologie

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Orbital schütteln Kultur von Säugerzellen in O-förmigen Schiffe, einheitliche Aggregate zu produzieren

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Zellfreien Protein Ausdruck mithilfe der rasch wachsenden Bakterium Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Messung der 3D-In-vivo-Schulterkinematik mittels biplanarer Videoradiographie

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Schnelle, enzymatische Methoden zur Amplifikation minimaler, linearer Templates für das Protein-Prototyping mit zellfreien Systemen

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...