Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית במסגרת מענק תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי 723106, מענק קרן המדע הלאומית השוויצרית (182019) ו- EPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PURE+technology.">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).</li><li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li><li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli.">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).</li><li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה פשוטה, זמן וחסכונית להכנת מערכת ביטוי PURE רב-תכליתית20 המבוססת על הרכב סטנדרטי15. על ידי ניצול הפרוטוקול יחד עם לוחות הזמנים היומיים שסופקו (טבלה 1), כל הרכיבים יכולים להיות מוכנים בשבוע אחד ותשואה סכומים מספיקים עד חמש מאות תגובות μL PURE. מאחר שהחלבונים המשמשים בפרוטוקול זה מתבטאים יתר על המידה מפלסמידים בעלי העתקה גבוהה ויש להם רעילות נמוכה ל- E. coli, רמות ביטוי טובות נצפות עבור כל החלבונים הנדרשים (איור 1). זה מאפשר התאמה קלה של זנים, ולכן גם הרכב חלבון cocultures, פשוט על ידי שינוי היחסים של זני החיסון20. מלבד החלבונים ריבוזומליים, הריכוז של EF-Tu הראה להיות בעל חשיבות בסיסית לביטוי תשואות6. לעומת זאת, לשינויים בריכוז רכיבי החלבון האחרים הייתה השפעה נמוכה יחסית על החוסן של מערכת PURE7,24. לכן, על ידי התאמת יחס החיסון של EF-Tu ביחס לכל שאר הרכיבים, ניתן להשיג הרכב דומה להרכב PURE הסטנדרטי, וניתן להשיג מערכת PURE עם תשואה דומה20. בהכנת תמיסת החלבון, חשוב לוודא שכל הזנים יגדלו היטב וידחסו יתר על המידה את החלבון המקודד לאחר האינדוקציה (איור 1).
פונקציית ריבוזום היא המפתח לביצועים הכוללים של מערכת PURE24. בפרוטוקול זה מודגמות שתי שיטות שונות להכנת פתרון ריבוזום, כלומר, טיהור ריבוזום ללא תגים ותיוג שלו. טיהור ריבוזום ללא תגים מבוסס על כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית ואחריה צנטריפוגה עם כרית סוכרוז, הדורשת גישה למערכת טיהור FPLC ו- Ultracentrifuge15. לעומת זאת, השיטה המשתמשת ריבוזומים מתויגים18 ו טיהור כרומטוגרפיה זיקה זרימת הכבידה אינה דורשת ציוד מיוחד וניתן לבצע אותה ברוב המעבדות. השיטה השנייה, אם כן, מביאה יתרונות כגון פשטות ונגישות. עם זאת, ראינו תפוקת סינתזה נמוכה משמעותית בעת שימוש בריבוסומים המתויגים שלו ב- OnePot PURE בהשוואה לגרסה נטולת התגים (איור 3). בהתבסס על סוג היישום, תשואה נמוכה זו עשויה להיות מקובלת.
פתרון האנרגיה מספק את רכיבי המשקל המולקולרי הנמוך ואת tRNAs הנדרשים כדי לתדלק תגובות TX-TL במבחנה. פרוטוקול זה מספק מתכון לפתרון אנרגיה טיפוסי, אשר ניתן להתאים בקלות בהתבסס על צרכי המשתמש. יחד עם tRNA, NTP, ו קריאטין פוספט, השפע והריכוז של Mg2 + יונים היו חיוניים לביצועים הכוללים של מערכת PURE8, כפי שהם קופקטורים קריטיים עבור תמלול ותרגום. במקרים מסוימים, טיטציה של יונים יכול, אם כן, לשפר מאוד את הביצועים הטהרים הכוללים. שלמות ה- DNA חיונית לביצועים טהורים. לכן, רצף אימות אזור המקדם, אתר כריכת ריבוזום וגין היעד והבטחה שריכוז דנ"א הולם (<2 נ"מ) יסייע לפתור בעיות שעלולות להתעורר בעת הגדרת תגובת PURE.
מערכת PURE היא מערכת TX-TL מינימלית, ויישומים ספציפיים עשויים לדרוש התאמות נוספות25. אלה עשויים לכלול שילוב RNA פולימראז שונים9,26,מלווים 13, וגורמי חלבון כגון EF-P או ArfA8. למרות שזני הביטוי של חלבונים אלה יכולים להיכלל בקוקולטורות, הוספתם בנפרד למערכת המוכנה עשויה לספק שליטה טובה יותר ברמות החלבון הנדרשות. יתר על כן, הכללת שלשלות חיונית לייצור חלבונים ממברנה10,11. חמצון במקום הפחתת סביבות ואיזומראז קשר דיסולפיד מקלים על היווצרות קשר דיסולפיד תקין, אשר, למשל, נדרשים לחלבונים הפרשתיים12.
זה חיוני כדי להבטיח כי כל רכיבים נוספים לא להפריע לתגובה. הגורמים החשובים ביותר שיש לשים לב אליו בעת הגדרת תגובה או הוספת רכיבים אחרים מפורטים להלן. ודא כי לא מאגרים לא תואמים משמשים או ריכוזי היונים מופרעים. הימנע מפתרונות המכילים גליצלול, ריכוזים גבוהים של אשלגן, מגנזיום, יוני סידן, אוסמוליטים, pyrophosphate, אנטיביוטיקה, או EDTA, ככל האפשר. לדוגמה, החלפת מאגר חמקמק במים במהלך טיהור DNA יכול להיות מועיל כמו EDTA הוא תוסף נפוץ במאגר זה. אספקת הפתרונות עם מולקולות נוספות טעונות שליליות כגון NTP או dNTP דורש התאמת ריכוז המגנזיום8, כמו המולקולות טעונות שליליות להתנהג כמו סוכני כלה ולאגד מולקולות טעונות חיובית. pH נייטרלי הוא אידיאלי עבור התגובה. בהתאם לכך, יש לאגור את כל הרכיבים ל- pH המתאים; זה חשוב במיוחד עבור מולקולות חומציות מאוד או בסיסיות כגון NTPs. לבסוף, טמפרטורה ונפח הם פרמטרים מרכזיים לתגובה. כדי להשיג תשואה טובה, יש ליישם טמפרטורה סביב 37 °C (50 °F), כמו טמפרטורות מתחת 34 °C (50 °F) יפחיתו באופן משמעותי את התשואה 27 °C(50°F).
ראוי לציין כי לפני הכנת OnePot PURE, יש לשקול את יישום היעד ואת הדרישות הנלוות, כגון נפח, טוהר, קלות שינוי, והכללה או השמטה של רכיבים. עבור יישומים רבים, המערכת תהיה בחירה מצוינת, אך אחרים עשויים לדרוש תשואות, כוונון וגורמים אחרים, אשר מערכת OnePot אינה יכולה לספק. ללא קשר, הפרוטוקול שהוצג יועיל להכנת כל מערכת תוצרת בית, שכן כל הצעדים הקריטיים להכנה כזו מסוכמים כאן.
אחד היתרונות העיקריים של מערכת OnePot הוא תאימותה למערכת PURExpress הזמינה מסחרית, המספקת את האפשרות לבדוק את הפונקציונליות והשלמות של כל הרכיבים בנפרד על ידי החלפת כל רכיב PURExpress ב- OnePot המקבילה שלו. היתרונות של מערכת OnePot PURE, כגון טונה והכנה קלה, מהירה וחסכונית, יהפכו את TX-TL ללא תאים לנגיש למעבדות נוספות ברחבי העולם ויתרמו להרחבת היישום של פלטפורמה רבת עוצמה זו בביולוגיה סינתטית ללא תאים.

מערכות תרגום-תמלול ללא תאים (TX-TL) מהוות פלטפורמה מבטיחה לחקירה והנדסת מערכות ביולוגיות. הם מספקים תנאי תגובה פשוטים וטונה, כפי שהם כבר לא מסתמכים על תהליכים לקיים חיים, כולל צמיחה, הומאוסטזיס, או מנגנונירגולציה 1. לכן, צפוי כי מערכות ללא תאים יתרמו לחקירה של מערכות ביומולקולריות, יציעו מסגרת לבדיקת אסטרטגיות ביו-עיצוב רציונליות2, ויספקו שלדה לתא סינטטי עתידי3,4. מערכת PURE recombinant לחלוטין מציעה שלדה מושכת במיוחד בשל הרכבה המוגדר והמינימלי, כמו גם יכולת הכוונון והכוונוןשלה 5.
מאז הוקמה מערכת PURE הפונקציונלית הראשונה, recombinant מלא בשנת 20015, נעשו מאמצים להרחיב את מגבלות המערכת ולייעל את הרכב המערכת כדי לשפר את התפוקות של המערכת6,7,8, לאפשר רגולציה שעתוק9, ממברנה10,11 וסינתזת חלבון הפרשה12, כדי להקל על קיפול חלבון13,14 . כיום, ישנן שלוש מערכות זמינות מסחרית: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) ומג'יק PURE (Biolabs יצירתי). עם זאת, מערכות אלה יקרות, הרכבן המדויק הוא קנייני ולכן לא ידוע, והסתגלות מוגבלת.
מערכות PURE שהוכנו בתוך הבית הוכיחו את עצמם כאופציה המשתלמה והחסכוני ביותר15,16. עם זאת, 37 שלבי הטיהור הנדרשים לחלבון ולשברים ריבוזומים גוזלים זמן ומייגע. נעשו מספר ניסיונות לשפר את היעילות של הכנת מערכת PURE17,18,19. לאחרונה הוכחנו כי ניתן coculture ולטהר במשותף את כל החלבונים שאינם ריבוזומליים הנדרשים הקיימים במערכת PURE. שיטת OnePot זו הוכיחה את עצמה כחסכונית וחסכונית בזמן, ומקצרת את זמן ההכנה ממספר שבועות ל-3 ימי עבודה. הגישה מייצרת מערכת PURE עם יכולת ייצור חלבונים הדומה למערכת PURExpress הזמינה מסחרית20. בניגוד לגישות הקודמות כדי לפשט את הכנת PURE17,18,19, בגישה OnePot כל החלבונים עדיין באים לידי ביטוי זנים נפרדים. זה מאפשר למשתמש לכוונן את הרכב מערכת OnePot PURE על ידי השמטה או הוספה של זנים ספציפיים או התאמת נפחי החיסון, ובכך ליצור מערכות PURE נושרות או לשנות את יחסי החלבון הסופיים, בהתאמה.
הפרוטוקול המוצג כאן מספק שיטה מפורטת ליצירת מערכת OnePot PURE כפי שתואר קודם לכן20, אם כי β-mercaptoethanol הוחלף טריס (2-carboxyethyl)פוספין (TCEP). יתר על כן, שתי שיטות לטיהור ריבוזום מתוארות: טיהור ריבוזום מסורתי ללא תגים באמצעות אינטראקציה הידרופובית וכרית סוכרוז, המותאמת מ Shimizu ואח'15, וטיהור ריבוזום Ni-NTA המבוסס על וואנג ואח '18 ו Ederth ואח'21 אך שונה באופן משמעותי. השיטה השנייה מקלה עוד יותר על הכנת מערכת PURE והופכת אותה לנגישה למעבדות נוספות, שכן נדרש ציוד מעבדה סטנדרטי בלבד.
הפרוטוקול הניסיוני מסכם את הכנתה של מערכת TX-TL רב-תכליתית נטולת תאים PURE כדי לספק פלטפורמה פשוטה, טונה וחסכונית ללא תאים, שניתן להכין באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי תוך שבוע. מלבד הצגת הרכב PURE הסטנדרטי, אנו מציינים כיצד והיכן ניתן להתאים אותו, תוך התמקדות ראשונית בשלבים קריטיים בפרוטוקול כדי להבטיח את פונקציונליות המערכת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

מערכת תרגום התמלול של PURE (סינתזת חלבונים באמצעות אלמנטים רקומביננטיים) מספקת שלדה מושכת לביולוגיה סינתטית נטולת תאים. למרבה הצער, מערכות זמינות מסחרית הן יקרות, ואת טונה שלהם מוגבלת. לשם השוואה, ניתן להתאים אישית גישה תוצרת בית בהתאם לצרכי המשתמש. עם זאת, הכנת מערכות תוצרת בית היא זמן רב ומפרך בשל הצורך ריבוזומים, כמו גם 36 טיהורים חלבון בקנה מידה בינוני. ייעול טיהור החלבון על ידי שיתוף פעולה וטיהור משותף מאפשר למזער את זמן ודרישות העבודה. כאן, אנו מציגים שיטה קלה, מתכווננת, זמן וחסכוני לייצר את כל רכיבי מערכת PURE בתוך שבוע אחד, באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. יתר על כן, הביצועים של OnePot PURE דומים למערכות זמינות מסחרית. שיטת ההכנה של OnePot PURE מרחיבה את הנגישות של מערכת PURE למעבדות נוספות בשל פשטותה וחסכונותה.

הפרוטוקול לעיל נועד להקל על הקמת מערכת TX-TL ללא תאים טהורה בכל מעבדה. הפרוטוקול כולל תיאור מפורט של הכנת שלושת החלקים המובהקים של מערכת PURE: חלבון OnePot, ריבוזום ופתרון אנרגיה. לוח זמנים יומי מפורט, הממטב את זרימת העבודה, מוצג בטבלה 1. זרימת העבודה ממוטבת לטיהור ריבוזומים מתויגים שלו, ומסגרות זמן עשויות להשתנות מעט אם מתבצע טיהור ריבוזום ללא תגים. הכנה אחת מספקת כמות מספקת של PURE למינימום של חמש מאות תגובות μL. יתר על כן, הפתרונות המוכנים יציבים במשך יותר משנה ב -80 °C (80 °F) ויכולים לעמוד במחזורי הפשרת הקפאה מרובים.
רמות ביטוי יתר נאותות עבור כל הזנים חיוניות לפונקציונליות של פתרון החלבון הסופי. איור 1 מראה ביטוי יתר מוצלח בכל 36 הזנים הבודדים המשמשים לאחר מכן להכנת חלבון OnePot. השונות בעוצמות הרצועה של החלבונים המבוטאים יתר על המידה התרחשה ככל הנראה בשל הטיה בטעינת נפחים על ג'ל SDS-PAGE. גדלי החלבון הצפויים מסוכמים בטבלה 2. GlyRS ו- PheRS מורכבים משני תת-קבוצות של משקולות מולקולריות שונות; 34 החלבונים הנותרים מורכבים מתת-יחידה. המפתח לפשטות וליעילות הזמן של פרוטוקול זה הוא שלב השיתוף והטיהור המשותף(איור 2). תמיסת החלבון OnePot הוכנה על ידי הגדלת היחס בין זן EF-Tu ביחס לכל זני הביטוי האחרים. ההרכב הכולל של החלבונים הסופיים נותח על ידי SDS-PAGE (איור 3A). מן הג'לים (נתיבים 2, 3), ניתן להבחין כי EF-Tu (43.3 kDa) קיים בריכוז גבוה יותר בהשוואה לחלבונים האחרים, כצפוי. בעוד הג'ל מספק אינדיקציה ראשונה טובה של יחסי ביטוי חלבון, קשה לקבוע אם ובאותה רמה כל חלבון בודד בא לידי ביטוי. לכן, מומלץ מאוד לאשר את ביטוי יתר בכל זן לפני coculturing, כפי שמוצג לעיל.
ה- E. coli ribosome היא מכונה מולקולרית מורכבת המורכבת מ-50 תת-שותפים בודדים של חלבונים23. ספקטרום ספיגה מייצג של 260 ננומטר לטיהור ריבוזום ללא תגים מוצג באיור 4; הפסגה השלישית אופיינית לאלוטיון ריבוזום מוצלח. בשתי שיטות הטיהור של ריבוזום, נצפתה תבנית הריצה הצפויה בג'ל SDS-PAGE (איור 3A)18. ראינו זיהומים בשני הטיהורים, אם כי בכמויות קטנות (<10%). ראוי לציין כי מזהמים שונים היו נוכחים בריבוסומים נטולי תגים (נתיבים 5, 6) ותיוג שלו (נתיבים 11, 12) בשל השונות בשיטה. לעיון המשתמש, ג'לים SDS-PAGE עבור המערכות המשולבות כלולים גם (נתיבים 8, 9 ו- 14, 15).
לבסוף, הביצועים של המערכות המוכנות (איור 3) באמצעות גרסאות ריבוזום שונות משווים. קורסי הזמן של ביטוי eGFP במבחנה מראים כי שתי מערכות PURE מתפקדות ומייצרות eGFP פלואורסצנטי. עם זאת, תמיסת החלבון OnePot בשילוב עם הריבוזומים המתויגים שלו, תוך שימוש בריכוז ריבוזום הממוטב על ידי טיטרציה, הניבה רק שליש מרמת הביטוי של גרסת הריבוזום הלא מתויגת (איור 3B). תוצאות דומות נצפו כאשר שלושה חלבונים בגדלים שונים באו לידי ביטוי וסומנו באמצעות ה- Green Lys tRNA במערכת תיוג במבחנה (איור 3C). כפי שניתן לראות על ג'ל פלורסנט, מוצרים באורך מלא באו לידי ביטוי בהצלחה בשתי המערכות; עם זאת, רק כמחצית מרמת הביטוי הושגה עם מערכת ריבוזום התג שלו. בנוסף לתיוג הפלואורסצנטיות, הרצועות הצפויות לכל שלושת החלבונים ניתנות להבחנה על ג'ל מוכתם קומאסי(איור 3D). התוצאות מראות כי מערכת הביטוי שהוצגה, אשר ניתן להכין בתוך שבוע במעבדה עם ציוד סטנדרטי, יכול לשמש לביטוי במבחנה של חלבונים המקודדים במורד הזרם של מקדם T7 מתבניות ליניאריות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> איור 1: תוצאות מייצגות לבדיקת הבעת יתר עבור כל זני הביטוי של מערכת PURE. מספרי חלבון טהור וגדלים מסוכמים בטבלה 2. מספרי חלבון 21, 24 ו- 27 מסומנים בכוכב להדמיה טובה יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> איור 2: טיהורחלבונים OnePot. התיאור הסכמטי והתצלומים המתאימים של כל השלבים המעורבים בייצור פתרון החלבון OnePot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> איור 3: ביצועי המערכות המוכנות באמצעות גרסאות ריבוזום שונות. (A)ג'לים מוכתמים בכחול SDS-PAGE של תמיסת החלבון OnePot (נתיבים 2, 3), ריבוזומים ללא תגים ללא תמיסת חלבון (נתיבים 5, 6) ועם תמיסת חלבון (נתיבים 8, 9), ריבוזומים מתויגים שלו ללא פתרון חלבון (נתיבים 11, 12) ועם תמיסת חלבון (נתיבים 14, 15). שני ריכוזים שונים נטענו לכל דגימה. (B)השוואה של ביטוי eGFP של ריבוזומים מתויגים שלו ריבוזומים ללא תגים. עוצמת הפלואורסצנטיות של ביטוי ה-eGFP במבחנה מנוטרת לאורך זמן לתגובה טהורה באמצעות ריבוזומים ללא תגים (1.8 מיקרומטר, כחול) וריבוזומים מתויגים שלו (0.62 מיקרומטר, אדום). הריכוזים של התבנית הליניארית ופתרון החלבון OnePot היו 4 ננומטרי ו 2 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. לוחות (C) ו - (D) מציגים את ג'ל SDS-PAGE של חלבונים מסונתז ב- OnePot עם ללא תגים (1.8 מיקרומטר, כחול, נתיבים 3, 4, 5) וריבוזומים של התג שלו (0.62 מיקרומטר, אדום, נתיבים 6, 7, 8) המסומנים בערכת תיוג של GreenLys במבחנה (C) ומוכתמים בכחול קומאסי(D),בהתאמה. החצים השחורים מצביעים על הרצועות הצפויות של חלבונים מסונתזים: eGFP (26.9 kDa), ArgRS (64.7 kDa), T7 RNAP (98.9 kDa). התבנית הליניארית וריכוזים תמיסת חלבון OnePot היו 4 ננומטרי ו 1.6 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> איור 4: ספקטרום ספיגה ב-260 ננומטר. תוצאות מייצגות של ספקטרום ספיגה ב 260 ננומטר במהלך טיהור אינטראקציה הידרופובית של ריבוזומים ללא תגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: לוח זמנים יומי מותאם לזמן להכנת כל פתרונות OnePot PURE. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">זו.</a>
טבלה 2: רשימת חלבונים טהורה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 1: ריאגנטים. הטבלה מפרטת ריכוזים, כרכים ופרטים ספציפיים אחרים של ריאגנטים ורכיבים המשמשים במהלך מחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 2: חוצצים. הגיליון האלקטרוני מפרט את הרכבי החיץ המדויקים לחלבון, ריבוזום ללא תגים וטיהורי ריבוזום שלו, כמו גם את הריכוזים של פתרונות המלאי המשמשים להכנתם. בנוסף, הוא מחשב את כמויות הרכיבים הנדרשות בהתבסס על אמצעי האחסון של המאגר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 3: חישובי חומצות אמינו. הגיליון האלקטרוני מפרט את חומצות האמינו ואת ריכוזי תמיסת המלאי המומלצים הנדרשים לפתרון האנרגיה. הוא מחשב את כמות המים שיש להוסיף לכל חומצת אמינו בהתבסס על המסה השוקלת בפועל, וגם מחשב את נפח תמיסת חומצת האמינו שיש להוסיף לתערובת חומצות האמינו הסופית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 4: פתרונות מלאי לפתרון האנרגיה. הטבלה מפרטת את הריכוזים והנפחים של פתרונות מלאי הדרושים לפתרון האנרגיה ומציינת פרטים נוספים, כולל תנאי אחסון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 5: פתרון אנרגיה. הטבלה מפרטת את רכיבי פתרון האנרגיה ואת הריכוזים המומלצים שלהם. בנוסף, הוא מחשב את הנפחים הנדרשים שלהם כדי להוסיף לפתרון הסופי בהתבסס על ריכוזי פתרון המלאי שלהם ואת נפח פתרון האנרגיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 6: PCR. הטבלה מפרטת רצפים וריכוזים של הפריימרים המשמשים להרחבת PCR ומציינת טמפרטורות נמסות וצעדי תרמוציקלר הממוטבים לפולימראז DNA בעל אמינות גבוהה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 7: תגובה טהורה. הגיליון האלקטרוני מציג הגדרה לדוגמה של תגובת PURE. הוא מפרט את הריכוזים והנפחים המשמשים של הרכיבים לתגובה טהורה באמצעות ריבוזומים ללא תגים או ריבוזומים של התג שלו. יתר על כן, הוא מחשב את יחסי הנפח עבור חלבון ו titrations ריבוזום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

OnePot PURE Cell-Free System

אנו מציגים שיטה מהירה וחסכונית לייצור מערכת TX-TL נטולת תאים PURE רקומביננטית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

מערכת ללא תאים טהורים של OnePot

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

פרוטוקול זה עבור מערכת ביטוי חלבון ללא תאים רקומביננטית, הידועה בכינויה מערכת PURE משתמשת בפולחן תאים ובטיהור תאים כדי לייעל את טיהורי החלבון הנדרשים. זה מצמצם באופן משמעותי את הזמן ואת דרישות העבודה. שיטת OnePot הוכיחה את עצמה לא רק חסכונית, אלא גם יעילה בזמן.זה מקצר את זמני ההכנה מכמה שבועות לשלושה ימי עבודה. זה הופך את הפלטפורמה נטולת התאים PURE נגישה למעבדות נוספות ברחבי העולם ועוזרת ליישם פלטפורמה חזקה באמת זו לביולוגיה סינתטית ללא תאים. לפני שתתחילו, ודאו שכל הזנים מעל מבטאים היטב את החלבון שלהם.כדי להתחיל, להכין את העמודה לטיהור חלבון OnePot כמתואר בכתב היד הטקסט באמצעות שני מיליליטר של שרף Sepharose, ולאחר מכן לטעון את העמודה עם ניקל גופרתי. הכן את תרביות המתנע על ידי שילוב של 20 מיליליטר של מדיה LB עם 20 microliters של אמפיצ'ין. הוסף 300 מיקרוליטרים של התקשורת לתוך 35 בארות של צלחת באר סטרילית 96 עמוק.לחסן כל אחד מהם עם המתח המתאים שלה, למעט גורם התארכות תרמו לא יציב, או EFTU, ולאטום את הצלחת עם קרום נושם. עבור תרבות EFTU, לחסן שלושה מיליליטר של אמפצילין המכיל מדיה LB בצינור תרבות 14 מיליליטר עם כובע הצמדה. כשלושה מיליליטרים של תרבות EFTU מספיקים לתרבות ביטוי אחת של OnePot.לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 260 סיבובים לדקה לילה. למחרת, להעביר 500 מיליליטר של מדיה LB ו 500 microliters של אמפצילין לתוך הבקבוק הסטרילי מבולבל. לחסן את תרבות OnePot PURE עם 1, 675 מיקרוליטרים של תרבות EFTU ו -55 מיקרוליטרים של כל אחת מהתרבויות מצלחת הבאר העמוקה.לדגור על התרבות במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם טלטול של 260 סיבובים לדקה, או עד הצפיפות האופטית של התרבות מגיעה 0.2 עד 0.3. לגרום לתרבות עם 500 מיקרוליטרים של IPTG 0.1 מילימולר ולגדול במשך שלוש שעות נוספות. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ו 3, 220 פעמים G במשך 10 דקות, ולאחסן את גלולה התא במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.ביום השלישי, למדוד את כמויות המאגרים הדרושים לטיהור שלהם ולהוסיף TCEP לכולם כפי שצוין בטקסט. אחסן את המאגרים הנותרים ללא TCEP בארבע מעלות צלזיוס לטיהורים עתידיים. יש לכלול את העמודה הטעונה עם 30 מיליליטר של חוצץ A.After 25 מיליליטר של חוצץ A עבר, לסגור את העמודה מלמטה.להפשיר את התאים ולהשתמש pipette סרולוגי כדי resuspend גלולה התא ב 7.5 מיליליטר של חוצץ A.Lyse התאים באמצעות בדיקה 130 וואט. אם sonication הוא מוצלח, הפתרון יהפוך כהה יותר. הקפד לשמור על התאים על קרח ולהניח את הגשוש עמוק מספיק מבלי לגעת בצינור.הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 21, 130 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשמור את lysate על קרח. הוסף את הסופר-טבעי לעמודה המשוויבת. סגור את העמודה מלמעלה וודא שאין דליפה.לדגור על העמודה במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס תחת סיבוב באמצעות סיבוב צינור. יש לאלוט רכיבים לא מאוגדים מהעמוד ולשטוף עם 25 מיליליטר של חוצץ A.Wash את העמודה עם 25 מיליליטר של 25 מילימולר חיץ imidazole. יש לאלוט את החלבונים עם חמישה מיליליטרים של 450 מילימולר חיץ imidazole ולשמור את החלבונים הנבה על הקרח בכל עת.לדלל את eluate עם 25 מיליליטר של חוצץ HT ולשמור את התערובת על קרח. מוסיפים 15 מיליליטר למסנן צנטריפוגלי של 15 מיליליטר ומתרכזים בנפח של 1.5 מיליליטר. מוסיפים את 15 המיליליטר הנותרים למסנן עם הפתרון המרוכז ומתרכזים שוב ב-1.5 מיליליטר.מוסיפים 10 מיליליטר של חוצץ HT לדגימה המרוכזת ומתרכזים למיליליטר אחד. לשחזר את המדגם המרוכז ולהוסיף כמות שווה של מאגר מלאי B ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. במהלך חילופי המאגרים, שחזר את העמודה כפי שצוין בטקסט.ביום הרביעי, למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ברדפורד assay. מרכז את המדגם עם 0.5 מיליליטר של שלושה קילודלטון ניתוק מסנן צנטריפוגלי ל 20 מיליגרם למיליליטר. אמת את הרכב החלבון OnePot PURE באמצעות עמוד SDS.לדלל 2.5 microliters של המדגם עם 7.5 microliters של מים מעורבב עם 10 microliters של שני חוצץ X Laemmli, ולאחר מכן לטעון חמישה microliters ו 2.5 microliters של הדגימות על הג'ל. הפעל את דף ה- SDS כפי שצוין בטקסט. מלא את הריכוז והאורך של ה- DNA בתאים הצהובים המתאימים בגיליון האלקטרוני באמצעות שניים עד 10 ננומולר של DNA לתגובה.מלאו את נפח התגובה הכולל הרצוי במיקרו-לייטרים. מוציאים את ריאגנטים הנדרשים מהמקפיא ומפשירים אותם על קרח. לאחר מכן, pipette את כמויות מחושבות של מים, DNA ופתרון אנרגיה לצד אחד של צינור PCR או פינה אחת של באר על צלחת 384 היטב.Pipette את הכמויות המחושב של חלבון ופתרון ריבוזום לצד השני של צינור PCR או הפינה הנגדית של צלחת 384 היטב. ספין במשך כ-30 שניות כדי למזג את רכיבי התגובה. כדי למנוע אידוי במהלך ניסויים קורא צלחת, להוסיף 35 microliters של שעווה נוזלית, ולאטום את הצלחת עם איטום שקוף.דגירה במשך שלוש שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס. לקריאה על קורא לוחות, למדוד את עוצמת פלורסצנטית אורך הגל הנדרש כל שתי דקות. ביטוי יתר מוצלח בכל הזנים הבודדים המשמשים לאחר מכן להכנת חלבון OnePot מוצג כאן.ההרכב הכולל של פתרון חלבון OnePot PURE הסופי נותח על ידי דף SDS. זה מורגש כי EFTU קיים בריכוז גבוה יותר בהשוואה חלבונים אחרים, כצפוי. התשואות הסינתזה של פתרון חלבון OnePot בשילוב עם ריבוזומים מתויגים או לא מתויגים נותחו על ידי ניטור פלואורסצנטיות eGFP לאורך זמן.רמות הביטוי של שלושה חלבונים שונים המסומנים באמצעות הרשימה הירוקה tRNA במערכת תיוג במבחנה, או כתמי קומאסי, נותחו על ג'ל עמוד SDS. עבור מערכת PURE פונקציונלית, זה קריטי לחלוטין כי כל הזנים לבטא את החלבונים המתאימים שלהם היטב. טכניקה זו מאפשרת את יישום מערכת PURE להנדסת מערכות ביולוגיות, ומאפשרת פיתוח רשתות גנטיות חדשניות, אבחון מולקולרי, טיפולי וערכות חינוכיות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

מערכים רבים סגר Femtoliter הלשכה לביולוגיה ללא סלולארי

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

אורביטל טלטול התרבות של תאים בתרבית של צורת O כלי לייצר אגרגטים אחיד

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

תא ללא חלבון ביטוי באמצעות החיידק גדל במהירות ויבריו natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

מדידת 3D In-vivo כתף Kinematics באמצעות Videoradiography Biplanar

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...