Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
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इस काम को यूरोपियन यूनियन के क्षितिज 2020 रिसर्च एंड इनोवेशन प्रोग्राम ग्रांट 723106, स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट (182019) और ईपीएफएल के तहत यूरोपियन रिसर्च काउंसिल ने सपोर्ट किया था।

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	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. 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K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानक संरचना15के आधार पर एक बहुमुखी शुद्ध अभिव्यक्ति प्रणाली20 तैयार करने के लिए एक सरल, समय और लागत प्रभावी विधि का वर्णन करता है। आपूर्ति किए गए दैनिक कार्यक्रम(तालिका 1)के साथ प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सभी घटकों को 1 सप्ताह में तैयार किया जा सकता है और पांच सौ 10 माइक्रोन शुद्ध प्रतिक्रियाओं तक के लिए पर्याप्त उपज राशि। चूंकि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन उच्च प्रतिलिपि प्लाज्मिड से अधिक एक्सप्रेशन किए जाते हैं और ई कोलाईके लिए कम विषाक्तता होती है, इसलिए सभी आवश्यक प्रोटीन(चित्रा 1)के लिए अच्छी अभिव्यक्ति का स्तर देखा जाता है। यह उपभेदों के आसान समायोजन के लिए अनुमति देता है, और इसलिए20टीका उपभेदों के अनुपात को संशोधित करके, सहसंस्कृतियों में प्रोटीन संरचना भी। रिबोसोमल प्रोटीन के अलावा, ईएफ-टू की एकाग्रता अभिव्यक्ति पैदावार के लिए मौलिक महत्व के रूप में दिखाई दी6। इसके विपरीत, अन्य प्रोटीन घटकों की एकाग्रता में परिवर्तन का शुद्ध प्रणाली7,24की मजबूती पर अपेक्षाकृत कम प्रभाव पड़ा। इसलिए, अन्य सभी घटकों के संबंध में ईएफ-टू के टीका अनुपात को समायोजित करके, मानक शुद्ध संरचना के लिए एक तुलनीय संरचना प्राप्त की जा सकती है, और समान उपज20 के साथ एक शुद्ध प्रणाली प्राप्त की जा सकती है। प्रोटीन समाधान तैयार करने में, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सभी उपभेदों अच्छी तरह से बढ़ते हैं और प्रेरण(चित्र 1)के बाद एन्कोडेड प्रोटीन को अधिक बढ़ाते हैं।
राइबोसोम कार्य शुद्ध प्रणाली24के समग्र प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल में राइबोसोम सॉल्यूशन तैयार करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का प्रदर्शन किया जाता है, यानी टैग-फ्री और उनकी टैग्ड राइबोसोम शुद्धि। टैग-मुक्त राइबोसोम शुद्धिकरण हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी पर आधारित है जिसके बाद एक सुक्रोज कुशन के साथ अपकेंद्रित्र होता है, जिसके लिए एफपीएलसी शुद्धिकरण प्रणाली और अल्ट्रासेंट्रफ्यूज15तक पहुंच की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, उसके टैग राइबोसोम्स18 और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह आत्मीयता गुणसूत्री शुद्धिकरण का उपयोग करने की विधि विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और अधिकांश प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है । इसलिए, उत्तरार्द्ध विधि सादगी और पहुंच जैसे फायदे लाती है। हालांकि, हमने टैग-फ्री वैरिएंट(चित्रा 3)की तुलना में वनपॉट प्योर में उनके टैग वाले राइबोसोम्स का उपयोग करते समय काफी कम संश्लेषण उपज देखी। आवेदन के प्रकार के आधार पर, यह कम उपज स्वीकार्य हो सकती है।
ऊर्जा समाधान कम आणविक वजन घटकों और ट्रान्स को विट्रो TX-TL प्रतिक्रियाओं में ईंधन के लिए आवश्यक प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल एक विशिष्ट ऊर्जा समाधान के लिए एक नुस्खा प्रदान करता है, जिसे उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर आसानी से समायोजित किया जा सकता है। ट्रान, एनटीपी और क्रिएटिन फॉस्फेट के साथ, शुद्ध प्रणाली8के समग्र प्रदर्शन के लिए एमजी2 + आयनों की बहुतायत और एकाग्रता महत्वपूर्ण रही है, क्योंकि वे प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए महत्वपूर्ण कोफैक्टर हैं। कुछ मामलों में, आयनों का टिटरेशन, इसलिए, समग्र शुद्ध प्रदर्शन को बहुत बढ़ा सकता है। शुद्ध प्रदर्शन के लिए डीएनए अखंडता महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, प्रमोटर क्षेत्र, राइबोसोम बाध्यकारी साइट की पुष्टि करने और जीन को लक्षित करने और यह सुनिश्चित करने के लिए अनुक्रम कि पर्याप्त डीएनए एकाग्रता (<2 एनएम) एक शुद्ध प्रतिक्रिया स्थापित करते समय उत्पन्न होने वाले मुद्दों को उत्पन्न करने में मदद करेगा।
शुद्ध प्रणाली एक न्यूनतम TX-TL प्रणाली है, और विशिष्ट अनुप्रयोगों इस प्रकार अतिरिक्त समायोजन25की आवश्यकता हो सकती है । इनमें विभिन्न आरएनए पॉलीमरेसेस9,26,चैपरोन्स13और ईएफ-पी या अरफा8जैसे प्रोटीन कारकों को शामिल करना शामिल हो सकता है। हालांकि इन प्रोटीनों के लिए अभिव्यक्ति को कोकल्चर में शामिल किया जा सकता है, लेकिन उन्हें तैयार प्रणाली में अलग से जोड़ने से आवश्यक प्रोटीन के स्तर का बेहतर नियंत्रण मिल सकता है। इसके अलावा, वेसिकल्स का समावेश झिल्ली प्रोटीन10,11के उत्पादन के लिए आवश्यक है। वातावरण को कम करने के बजाय ऑक्सीकरण और एक डिसल्फाइड बॉन्ड आइसोमेराज़ उचित डिसल्फाइड बॉन्ड गठन की सुविधा प्रदान करता है, जो उदाहरण के लिए, स्रावित प्रोटीन12के लिए आवश्यक हैं।
यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि कोई भी अतिरिक्त घटक प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप न करे। प्रतिक्रिया स्थापित करते समय या अन्य घटकों को जोड़ने पर ध्यान देने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक नीचे सूचीबद्ध हैं। सुनिश्चित करें कि न तो असंगत बफ़र्स का उपयोग किया जाता है और न ही आयन सांद्रता परेशान कर रहे हैं। ग्लिसरोल, पोटेशियम, मैग्नीशियम, कैल्शियम आयनों, ओस्मोलाइट्स, पायरोफॉस्फेट, एंटीबायोटिक्स या ईडीटीए की उच्च सांद्रता वाले समाधानों से बचें। उदाहरण के लिए, डीएनए शुद्धिकरण के दौरान पानी के साथ एक एल्यूशन बफर की जगह फायदेमंद हो सकता है क्योंकि EDTA इस बफर में एक आम योजक है । एनटीपी या डीएनटीपी जैसे अतिरिक्त नकारात्मक आवेशित अणुओं के साथ समाधानों की आपूर्ति करने के लिए मैग्नीशियम एकाग्रता8को समायोजित करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि नकारात्मक आवेशित अणु चेलिंग एजेंटों के रूप में व्यवहार करते हैं और सकारात्मक रूप से आवेशित अणुओं को बांधते हैं। एक तटस्थ पीएच प्रतिक्रिया के लिए आदर्श है। तदनुसार, सभी घटकों को संबंधित पीएच पर बफर किया जाना चाहिए; यह एनटीपीएस जैसे अत्यधिक अम्लीय या बुनियादी अणुओं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । अंत में, तापमान और मात्रा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं । अच्छी उपज प्राप्त करने के लिए, किसी को 37 डिग्री सेल्सियस के आसपास तापमान लागू करना चाहिए, क्योंकि 34 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान से उपज27को काफी कम कर दिया जाएगा।
यह ध्यान रखना प्रासंगिक है कि OnePot शुद्ध तैयार करने से पहले, किसी को लक्ष्य आवेदन और संबंधित आवश्यकताओं, जैसे मात्रा, शुद्धता, संशोधन में आसानी, और घटकों को शामिल करने या चूक पर विचार करना चाहिए। कई अनुप्रयोगों के लिए, सिस्टम एक उत्कृष्ट विकल्प होगा, लेकिन दूसरों को पैदावार, समायोज्यता और अन्य कारकों की आवश्यकता हो सकती है, जो वनपॉट सिस्टम प्रदान नहीं कर सकता है। चाहे, शुरू किया गया प्रोटोकॉल किसी भी घर में बने सिस्टम को तैयार करने के लिए फायदेमंद होगा, क्योंकि इस तरह की तैयारी के लिए सभी महत्वपूर्ण कदम यहां संक्षेप में दिए जाते हैं।
OnePot प्रणाली के मुख्य फायदों में से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PURExpress प्रणाली के साथ इसकी अनुकूलता है, जो प्रत्येक PURExpress घटक को अपने OnePot समकक्ष के साथ क्रमिक रूप से बदलकर अलग से सभी घटकों की कार्यक्षमता और अखंडता का परीक्षण करने की संभावना प्रदान करता है। वनपॉट शुद्ध प्रणाली के फायदे, जैसे ट्यूनेबिलिटी और आसान, तेज और लागत प्रभावी तैयारी, सेल-फ्री टीएक्स-टीएल को दुनिया भर में अधिक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बना देगा और सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान में इस शक्तिशाली मंच के कार्यान्वयन के विस्तार में योगदान देगा।

सेल-फ्री ट्रांसक्रिप्शन-ट्रांसलेशन (टीएक्स-टीएल) सिस्टम जांच और इंजीनियरिंग जैविक प्रणालियों के लिए एक आशाजनक मंच का गठन करते हैं। वे सरलीकृत और ट्यूनेबल प्रतिक्रिया की स्थिति प्रदान करते हैं, क्योंकि वे अब विकास, हो्योस्टेसिस या नियामक तंत्र1सहित जीवन को बनाए रखने वाली प्रक्रियाओं पर भरोसा नहीं करते हैं। इस प्रकार, यह अनुमान लगाया गया है कि सेल-मुक्त प्रणालियां बायोमॉलिक्यूलर सिस्टम की जांच में योगदान देंगी, तर्कसंगत बायोडिजाइन रणनीतियों2का परीक्षण करने के लिए एक ढांचा प्रदान करेंगी, और भविष्य के सिंथेटिक सेल3,4के लिए चेसिस प्रदानकरेंगी। पूरी तरह से पुनः संयोजन शुद्ध प्रणाली अपनी परिभाषित और न्यूनतम संरचना के कारण एक विशेष रूप से आकर्षक चेसिस प्रदान करती है, साथ ही इसकी समायोज्यता और ट्यूनेबिलिटी5भी प्रदान करती है।
चूंकि पहली कार्यात्मक, पूरी तरह से पुनः संयोजन शुद्ध प्रणाली 20015में स्थापित की गई थी, इसलिए सिस्टम की सीमाओं का विस्तार करने और सिस्टम की संरचना को अनुकूलित करने के प्रयास किए गए हैं ताकि सिस्टम की पैदावार6,7, 8हो सके, ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन9,झिल्ली10,11 और गुप्त प्रोटीन संश्लेषण12के लिए अनुमति दी जा सके, और प्रोटीन तह13,14 की सुविधा प्रदान की जा सके . आजकल, तीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम हैं: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB), और मैजिक प्योर (क्रिएटिव बायोलैब)। हालांकि, वे प्रणालियां महंगी हैं, उनकी सटीक संरचना मालिकाना है और इस प्रकार अज्ञात है, और अनुकूलनशीलता सीमित है।
घर में तैयार शुद्ध प्रणालियां सबसे अधिक लागत प्रभावी और ट्यूनेबल विकल्प15,16साबित हुईं । हालांकि, प्रोटीन और राइबोसोम अंशों के लिए आवश्यक 37 शुद्धि कदम समय लेने वाले और थकाऊ हैं। शुद्ध प्रणालीतैयारकरने की कार्यकुशलता में सुधार लाने के लिए कई प्रयास किए गएहैं. हमने हाल ही में प्रदर्शन किया है कि शुद्ध प्रणाली में मौजूद सभी आवश्यक गैर-राइबोसोमल प्रोटीन को सह-शुद्ध करना और सह-शुद्ध करना संभव है। यह OnePot विधि लागत प्रभावी और समय कुशल साबित हुई है, जो कई हफ्तों से 3 कार्य दिवसों तक तैयारी के समय को काट रही है। यह दृष्टिकोण एक शुद्ध प्रणाली उत्पन्न करता है जिसमें प्रोटीन उत्पादन क्षमता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्यूरएक्सप्रेस सिस्टम20के बराबर होती है । शुद्ध तैयारी को सरल बनाने के लिए पिछले दृष्टिकोणों के विपरीत17,18,19,वनपॉट दृष्टिकोण में सभी प्रोटीन अभी भी अलग-अलग उपभेदों में व्यक्त किए जाते हैं। यह उपयोगकर्ता को केवल विशिष्ट उपभेदों को छोड़कर या जोड़ने या टीका मात्रा को समायोजित करके वनपॉट शुद्ध प्रणाली की संरचना को ट्यून करने में सक्षम बनाता है, इस प्रकार ड्रॉपआउट शुद्ध सिस्टम उत्पन्न करता है या क्रमशः अंतिम प्रोटीन अनुपात में फेरबदल करता है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले20वर्णित वनपॉट शुद्ध प्रणाली बनाने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है, हालांकि β-मर्केप्टोथेनॉल को ट्राइ (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फिन (टीएमईपी) के साथ प्रतिस्थापित किया गया था। इसके अलावा, राइबोसोम शुद्धिकरण के लिए दो तरीकों का वर्णन किया गया है: हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन और सुक्रोज कुशन का उपयोग करके पारंपरिक टैग-मुक्त राइबोसोम शुद्धिकरण, शिमिज़ू एट अल15से अनुकूलित, और नी-एनटीए राइबोसोम शुद्धि वांग एट अल के आधार पर18 और ईडरथ एट अल21 लेकिन काफी संशोधित। उत्तरार्द्ध विधि आगे शुद्ध प्रणाली की तैयारी की सुविधा प्रदान करती है और इसे अधिक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाती है, क्योंकि केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता होती है।
प्रायोगिक प्रोटोकॉल एक सरल, ट्यून करने योग्य, लागत प्रभावी सेल-मुक्त मंच प्रदान करने के लिए एक बहुमुखी शुद्ध सेल-मुक्त TX-TL प्रणाली की तैयारी का सारांश देता है, जिसे एक सप्ताह के भीतर मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है। मानक शुद्ध संरचना शुरू करने के अलावा, हम यह इंगित करते हैं कि सिस्टम की कार्यक्षमता सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर प्राथमिक ध्यान देने के साथ इसे कैसे और कहां समायोजित किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

परिभाषित शुद्ध (प्रोटीन संश्लेषण पुनर्संयोजन तत्वों का उपयोग कर) ट्रांसक्रिप्शन-अनुवाद प्रणाली सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक आकर्षक चेसिस प्रदान करती है। दुर्भाग्य से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियां महंगी हैं, और उनकी ट्यूनेबिलिटी सीमित है। इसकी तुलना में, उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर घर में बने दृष्टिकोण को अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, घर में बने सिस्टम को तैयार करने में रिबोसोम्स के साथ-साथ 36 मध्यम पैमाने पर प्रोटीन शुद्धिकरण की आवश्यकता के कारण समय लेने वाला और दुरूह होता है। कोक्यूल्चरिंग और सह-शुद्धिकरण द्वारा प्रोटीन शुद्धिकरण को सुव्यवस्थित करना समय और श्रम आवश्यकताओं को कम करने की अनुमति देता है। यहां, हम मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके 1 सप्ताह के भीतर सभी शुद्ध प्रणाली घटकों का उत्पादन करने के लिए एक आसान, समायोज्य, समय और लागत प्रभावी विधि प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, वनपॉट प्योर का प्रदर्शन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों के बराबर है। वनपॉट शुद्ध तैयारी विधि अपनी सादगी और लागत प्रभावशीलता के कारण शुद्ध प्रणाली की पहुंच को अधिक प्रयोगशालाओं में विस्तारित करती है।

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OnePot PURE Cell-Free System

हम मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके पुनर्संयोजन शुद्ध सेल-मुक्त टीएक्स-टीएल प्रणाली का उत्पादन करने के लिए एक तेज और लागत प्रभावी विधि पेश करते हैं।

वनपॉट शुद्ध सेल-फ्री सिस्टम

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

एक पुनर्संयोजन सेल-मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए यह प्रोटोकॉल, जिसे आमतौर पर शुद्ध प्रणाली के रूप में जाना जाता है, आवश्यक प्रोटीन शुद्धिकरण को कारगर बनाने के लिए सेल संस्कृति और सेल शुद्धिकरण का उपयोग करता है। यह काफी समय और श्रम आवश्यकताओं को कम करता है । OnePot विधि न केवल लागत प्रभावी है, लेकिन यह भी समय कुशल साबित हुआ है ।यह कई हफ्तों से तीन कार्य दिवसों के लिए तैयारी के समय में कटौती करता है। यह शुद्ध सेल मुक्त मंच को दुनिया भर में अधिक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाता है और सिंथेटिक सेल-मुक्त जीव विज्ञान के लिए इस वास्तव में शक्तिशाली मंच को लागू करने में मदद करता है। शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी उपभेदों पर अपने संबंधित प्रोटीन अच्छी तरह से व्यक्त करते हैं ।शुरू करने के लिए, वनपॉट प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए कॉलम तैयार करें जैसा कि पाठ पांडुलिपि में वर्णित है, जिसमें सेफ्रोज राल के दो मिलीलीटर का उपयोग किया गया है, और फिर कॉलम को निकल सल्फेट के साथ चार्ज करें। एम्पीसिलिन के 20 माइक्रोलीटर के साथ एलबी मीडिया के 20 मिलीलीटर के संयोजन से स्टार्टर संस्कृतियों को तैयार करें। एक बाँझ ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली के ३५ कुओं में मीडिया के ३०० माइक्रोलीटर जोड़ें ।उनमें से प्रत्येक को अपने संबंधित तनाव के साथ टीका लगाएं, विस्तार कारक थर्मो अस्थिर, या ईएफटीयू को छोड़कर, और एक सांस झिल्ली के साथ प्लेट को सील करें। EFTU संस्कृति के लिए, एक स्नैप कैप के साथ एक 14 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में एलबी मीडिया युक्त एम्पीसिलिन के तीन मिलीलीटर टीका । ईएफटीयू संस्कृति के लगभग तीन मिलीलीटर एक वनपॉट अभिव्यक्ति संस्कृति के लिए पर्याप्त है।रात भर २६० घूर्णन प्रति मिनट पर मिलाते हुए इसे ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । अगले दिन, एलबी मीडिया के 500 मिलीलीटर और एम्पिसिलिन के 500 माइक्रोलीटर को बाँझ चकित फ्लास्क में स्थानांतरित करें। ईएफटीयू संस्कृति के 1, 675 माइक्रोलीटर और गहरी अच्छी तरह से प्लेट से प्रत्येक संस्कृतियों के 55 माइक्रोलीटर के साथ वनपॉट शुद्ध संस्कृति का टीका लगाएं।प्रति मिनट 260 घूर्णन के झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें, या जब तक संस्कृति का ऑप्टिकल घनत्व 0.2 से 0.3 तक नहीं पहुंच जाता है। 0.1 मिलीमोलर आईपीटीजी के 500 माइक्रोलीटर के साथ संस्कृति को प्रेरित करें और अतिरिक्त तीन घंटे के लिए बढ़ें। 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस और 3, 220 बार जी पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को फसल, और आगे का उपयोग करने तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली स्टोर।तीन दिन, उनके शुद्धिकरण के लिए आवश्यक बफ़र्स की मात्रा को मापें और पाठ में दर्शाए गए रूप में उन सभी को टीएमईपी जोड़ें। भविष्य के शुद्धिकरण के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर TCEP के बिना शेष बफ़र्स स्टोर करें। बफर ए के 25 मिलीलीटर के माध्यम से पारित कर दिया गया है के बाद बफर ए के 30 मिलीलीटर के साथ आरोपित कॉलम समतुल्य, नीचे से कॉलम बंद करो ।कोशिकाओं को पिघलाएं और 130 वाट की जांच का उपयोग करके कोशिकाओं को बफर ए. लिसे की 7.5 मिलीलीटर में सेल पेलेट को फिर से व्यतीत करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। यदि सोनिकेशन सफल होता है, तो समाधान गहरा हो जाएगा। बर्फ पर कोशिकाओं को रखने के लिए सुनिश्चित करें और ट्यूब को छूने के बिना जांच काफी गहरी जगह है ।21 पर अपकेंद्रित्र द्वारा सेल मलबे को हटाएं, 130 बार जी चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए और बर्फ पर lysate रखें। समतुल्य स्तंभ में अधिनाट जोड़ें। ऊपर से कॉलम बंद करें और सुनिश्चित करें कि कोई रिसाव नहीं है।एक ट्यूब रोटेटर का उपयोग कर रोटेशन के तहत चार डिग्री सेल्सियस पर तीन घंटे के लिए कॉलम इनक्यूबेट । कॉलम से एल्यूट अनबाउंड घटक और बफर ए के 25 मिलीलीटर के साथ धोएं कॉलम को 25 मिलीमोलर इमिडाजोल बफर के 25 मिलीलीटर के साथ धोएं। 450 मिलीमोलर इमिडाजोल बफर के पांच मिलीलीटर के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें और हर समय इल्यूटेड प्रोटीन को बर्फ पर रखें।एचटी बफर के 25 मिलीलीटर के साथ एलुएट पतला करें और मिश्रण को बर्फ पर रखें। 15 मिलीलीटर सहायक फिल्टर में 15 मिलीलीटर जोड़ें और 1.5 मिलीलीटर की मात्रा पर ध्यान केंद्रित करें। शेष 15 मिलीलीटर को केंद्रित समाधान के साथ फ़िल्टर में जोड़ें और एक बार फिर 1.5 मिलीलीटर पर ध्यान केंद्रित करें।ध्यान केंद्रित नमूने में एचटी बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें और एक मिलीलीटर पर ध्यान केंद्रित करें। केंद्रित नमूने को ठीक करें और स्टॉक बफर बी की बराबर मात्रा जोड़ें और आगे के उपयोग तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बफर एक्सचेंज के दौरान, पाठ में निर्दिष्ट कॉलम को बहाल करें।चार दिन, ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता को मापने । तीन किलोडलटन कटऑफ सेंट्रलाइज फिल्टर के 0.5 मिलीलीटर के साथ नमूना 20 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर ध्यान केंद्रित करें। एसडीएस पेज का उपयोग करके वनपॉट शुद्ध प्रोटीन संरचना को सत्यापित करें।दो एक्स लैमली बफर के 10 माइक्रोलीटर के साथ मिश्रित पानी के 7.5 माइक्रोलीटर के साथ नमूने के 2.5 माइक्रोलीटर पतला करें, और फिर जेल पर नमूनों के पांच माइक्रोलीटर और 2.5 माइक्रोलीटर लोड करें। पाठ में निर्दिष्ट एसडीएस पृष्ठ चलाएं। प्रतिक्रिया के लिए डीएनए के दो से 10 नैनोमोलर का उपयोग करके स्प्रेडशीट में संबंधित पीली कोशिकाओं में डीएनए की एकाग्रता और लंबाई भरें।माइक्रोलीटर में वांछित कुल प्रतिक्रिया मात्रा भरें। फ्रीजर से आवश्यक अभिकर्णों को निकालें और उन्हें बर्फ पर गल लें। फिर, पीसीआर ट्यूब के एक तरफ या 384 अच्छी प्लेट पर एक कुएं के एक कोने में पानी, डीएनए और ऊर्जा समाधान की गणना की मात्रा को पिपेट करें।पिपेट एक पीसीआर ट्यूब या 384 अच्छी तरह से प्लेट के विपरीत कोने के दूसरे पक्ष के लिए प्रोटीन और राइबोसोम समाधान की गणना की मात्रा। प्रतिक्रिया घटकों को मर्ज करने के लिए लगभग 30 सेकंड तक स्पिन करें। प्लेट रीडर प्रयोगों के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए, तरल मोम के 35 माइक्रोलीटर जोड़ें, और एक पारदर्शी सीलेंट के साथ प्लेट को सील करें।न्यूनतम तीन घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर। एक प्लेट रीडर पर रीडआउट के लिए, हर दो मिनट में आवश्यक तरंगदैर्ध्य पर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें। OnePot प्रोटीन तैयारी के लिए बाद में उपयोग किए जाने वाले सभी व्यक्तिगत उपभेदों में अभिव्यक्ति पर सफल यहां दिखाया गया है।एसडीएस पेज द्वारा अंतिम वनपॉट शुद्ध प्रोटीन समाधान की समग्र संरचना का विश्लेषण किया गया था। यह ध्यान देने योग्य है कि ईएफटीयू अन्य प्रोटीन की तुलना में उच्च एकाग्रता में मौजूद है, जैसा कि उम्मीद थी। वनपॉट प्रोटीन समाधान की संश्लेषण पैदावार को उनके टैग या गैर-टैग किए गए राइबोसोम्स के साथ संयुक्त समय के साथ eGFP फ्लोरेसेंस की निगरानी करके विश्लेषण किया गया था।तीन अलग-अलग प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर को इन विट्रो लेबलिंग सिस्टम, या कुमासी स्टेनिंग में ग्रीन लिस्ट tRNA का उपयोग करके लेबल किया गया था, एक एसडीएस पेज जेल पर विश्लेषण किया गया था। एक कार्यात्मक शुद्ध प्रणाली के लिए, यह बिल्कुल महत्वपूर्ण है कि सभी उपभेदों अपने संबंधित प्रोटीन अच्छी तरह से व्यक्त करते हैं । यह तकनीक शुद्ध प्रणाली को जैविक प्रणाली इंजीनियरिंग के कार्यान्वयन की सुविधा प्रदान करती है, जिससे उपन्यास आनुवंशिक नेटवर्क, आणविक निदान, चिकित्सीय और शैक्षिक किट के विकास को सक्षम किया जा सके।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

विद्युत सेंसर का उपयोग बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

सेलुलर Mimics के निर्माण के लिए vesicles में सेल मुक्त ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद मशीनरी की इनकैप्सुलेशन

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

सेल मुक्त जीवविज्ञान के लिए sealable Femtoliter चैंबर सारणियों

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

एक ई. कोलाईआधारित कोशिका-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में संक्रामक Bacteriophages का संश्लेषण

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

वर्दी समुच्चय का उत्पादन करने के लिए ओ के आकार का जहाजों में स्तनधारी कोशिकाओं की एक परिक्रमा मिलाते संस्कृति

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

कोशिका मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति तेजी से बढ़ जीवाणु vibrio natriegens का उपयोग

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

लंबे समय तक सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के संचालन के लिए एक बहुपरत Microfluidic मंच

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

सेल फ्री बैक्टीरियल अर्क, लिपोसोम्स और इमल्शन ट्रांसफर का उपयोग करके प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Biplanar Videoradiography का उपयोग कर 3 डी इन-विवो शोल्डर कीनेमेटिक्स को मापना

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

सेल-फ्री सिस्टम का उपयोग करके प्रोटीन प्रोटोटाइप के लिए न्यूनतम, रैखिक टेम्पलेट्स के प्रवर्धन के लिए रैपिड, एंजाइमेटिक तरीके

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...