Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito della sovvenzione del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea 723106, una sovvenzione del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (182019) e l'EPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo qui presentato descrive un metodo semplice, rapido ed economico per preparare un versatile sistema di espressione PURE20 basato sulla composizione standard15. Utilizzando il protocollo insieme ai programmi giornalieri forniti (Tabella 1), tutti i componenti possono essere preparati in 1 settimana e produrre quantità sufficienti per un massimo di cinquecento reazioni PURE da 10 μL. Poiché le proteine utilizzate in questo protocollo sono sovraespresse da plasmidi ad alta copia e hanno una bassa tossicità per E. coli, si osservano buoni livelli di espressione per tutte le proteine richieste (Figura 1). Ciò consente la facile regolazione dei ceppi, e quindi anche della composizione proteica nelle cocolture, semplicemente modificando i rapporti dei ceppi di inoculazione20. Oltre alle proteine ribosomiali, la concentrazione di EF-Tu si è rivelata di fondamentale importanza per i rendimenti di espressione6. Al contrario, i cambiamenti nella concentrazione degli altri componenti proteici hanno avuto un impatto relativamente basso sulla robustezza del sistema PURE7,24. Pertanto, regolando il rapporto di inoculazione di EF-Tu per quanto riguarda tutti gli altri componenti, è possibile ottenere una composizione simile alla composizione PURE standard e ottenere un sistema PURE con una resa similea 20. Nella preparazione della soluzione proteica, è fondamentale assicurarsi che tutti i ceppi crescano bene e sovraesprimano la proteina codificata dopo l'induzione (Figura 1).
La funzione ribosoma è fondamentale per le prestazioni complessive del sistema PURE24. In questo protocollo, vengono dimostrati due diversi metodi per preparare la soluzione di ribosoma, cioè la purificazione del ribosoma senza tag e con tag His. La purificazione del ribosoma tag-free si basa sulla cromatografia di interazione idrofobica seguita da centrifugazione con un cuscino di saccarosio, che richiede l'accesso a un sistema di purificazione FPLC e un ultracentrifuga15. Al contrario, il metodo che utilizza i ribosomi18 con tag His e la purificazione della cromatografia per affinità del flusso gravitazionale non richiede attrezzature specializzate e può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori. Quest'ultimo metodo, quindi, porta vantaggi come la semplicità e l'accessibilità. Tuttavia, abbiamo osservato una resa di sintesi significativamente inferiore quando si utilizzano i ribosomi his-tagged in OnePot PURE rispetto alla variante senza tag (Figura 3). In base al tipo di applicazione, questa resa inferiore può essere accettabile.
La soluzione energetica fornisce i componenti a basso peso molecolare e i tRNA necessari per alimentare le reazioni TX-TL in vitro. Questo protocollo fornisce una ricetta per una tipica soluzione energetica, che può essere facilmente regolata in base alle esigenze dell'utente. Insieme a tRNA, NTP e creatina fosfato, l'abbondanza e la concentrazione di ioni Mg2+ sono state cruciali per le prestazioni complessive del sistema PURE8, in quanto sono cofattori critici per la trascrizione e la traduzione. In alcuni casi, la titolazione degli ioni può, quindi, migliorare notevolmente le prestazioni complessive di PURE. L'integrità del DNA è fondamentale per le prestazioni PURE. Pertanto, la sequenza che verifica la regione del promotore, il sito di legame del ribosoma e il gene bersaglio e garantisce che un'adeguata concentrazione di DNA (<2 nM) aiuterà a risolvere i problemi che possono sorgere durante la configurazione di una reazione PURE.
Il sistema PURE è un sistema TX-TL minimo e applicazioni specifiche possono quindi richiedere ulteriori regolazioni25. Questi possono includere l'incorporazione di diverse RNA polimerasi9,26,chaperoni13e fattori proteici come EF-P o ArfA8. Sebbene i ceppi di espressione per queste proteine possano essere inclusi nelle cocolture, aggiungerli separatamente al sistema preparato può fornire un migliore controllo dei livelli proteici richiesti. Inoltre, l'inclusione delle vescicole è essenziale per la produzione di proteine di membrana10,11. Ambienti ossidanti piuttosto che riducenti e un legame disolfuro isomerasi facilitano la corretta formazione del legame disolfuro, che sono, ad esempio, necessari per le proteine secretoria12.
È essenziale assicurarsi che eventuali componenti aggiuntivi non interferiscano con la reazione. I fattori più importanti a cui prestare attenzione quando si imposta una reazione o si aggiungono altri componenti sono elencati di seguito. Assicurarsi che non vengano utilizzati tamponi incompatibili né che le concentrazioni di ioni siano disturbate. Evitare soluzioni contenenti glicerolo, alte concentrazioni di potassio, magnesio, ioni calcio, osmoliti, pirofosfato, antibiotici o EDTA, per quanto possibile. Ad esempio, la sostituzione di un tampone di eluizione con acqua durante la purificazione del DNA può essere utile in quanto l'EDTA è un additivo comune in questo tampone. Fornire alle soluzioni ulteriori molecole caricate negativamente come NTP o dNTP richiede la regolazione della concentrazione di magnesio8, poiché le molecole caricate negativamente si comportano come agenti chelanti e legano molecole caricate positivamente. Un pH neutro è ideale per la reazione. Di conseguenza, tutti i componenti devono essere tamponati al pH corrispondente; ciò è particolarmente importante per molecole altamente acide o basiche come le NTP. Infine, temperatura e volume sono parametri chiave per la reazione. Per ottenere una buona resa, si dovrebbe implementare una temperatura intorno ai 37 °C, poiché temperature inferiori a 34 °C ridurranno significativamente la resa27.
È importante notare che prima di preparare OnePot PURE, è necessario considerare l'applicazione di destinazione e i requisiti associati, come volume, purezza, facilità di modifica e inclusione o omissione di componenti. Per molte applicazioni, il sistema sarà una scelta eccellente, ma altri potrebbero richiedere rendimenti, regolabilità e altri fattori, che il sistema OnePot non può fornire. Indipendentemente da ciò, il protocollo introdotto sarà utile per la preparazione di qualsiasi sistema fatto in casa, poiché tutti i passaggi critici per tale preparazione sono riassunti qui.
Uno dei principali vantaggi del sistema OnePot è la sua compatibilità con il sistema PURExpress disponibile in commercio, che offre la possibilità di testare la funzionalità e l'integrità di tutti i componenti separatamente sostituendo sequenzialmente ciascun componente PURExpress con il suo equivalente OnePot. I vantaggi del sistema OnePot PURE, come la sintonizzazione e la preparazione facile, veloce ed economica, renderanno tx-TL senza cellule accessibile a più laboratori in tutto il mondo e contribuiranno ad espandere l'implementazione di questa potente piattaforma nella biologia sintetica senza cellule.

I sistemi di trascrizione-traduzione senza cellule (TX-TL) costituiscono una piattaforma promettente per lo studio e l'ingegneria dei sistemi biologici. Forniscono condizioni di reazione semplificate e sintonizzabili, in quanto non si basano più su processi di sostegno vitale, tra cui crescita, omeostasi o meccanismi di regolazione1. Pertanto, si prevede che i sistemi privi di cellule contribuiranno allo studio dei sistemi biomolecolari, offriranno un quadro per testare strategie di biodesign razionale2e forniranno un telaio per una futura cellula sintetica3,4. Il sistema PURE completamente ricombinante offre uno chassis particolarmente accattivante grazie alla sua composizione definita e minimale, nonché alla sua regolabilità e sintonizzazione5.
Da quando il primo sistema PURE funzionale e completamente ricombinante è stato istituito nel 20015,sono stati fatti sforzi per espandere i limiti del sistema e ottimizzare la composizione del sistema per migliorare i rendimenti del sistema6,7,8,consentire la regolazione trascrizionale9,la membrana10, 11 e la sintesi proteica secretoria12e facilitare il ripiegamento proteico13,14 . Al giorno d'oggi, ci sono tre sistemi disponibili in commercio: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) e Magic PURE (Creative Biolabs). Tuttavia, questi sistemi sono costosi, la loro composizione esatta è proprietaria e quindi sconosciuta e l'adattabilità è limitata.
I sistemi PURE preparati internamente si sono rivelati l'opzione più economica e sintonizzabile15,16. Tuttavia, le 37 fasi di purificazione richieste per le frazioni proteiche e ribosomiche richiedono molto tempo e sono noiose. Sono stati fatti diversi tentativi per migliorare l'efficienza della preparazione del sistema PURE17,18,19. Recentemente abbiamo dimostrato che è possibile co-coltura e co-purificare tutte le proteine non ribosomiali necessarie presenti nel sistema PURE. Questo metodo OnePot ha dimostrato di essere conveniente ed efficiente in termini di tempo, riducendo i tempi di preparazione da diverse settimane a 3 giorni lavorativi. L'approccio genera un sistema PURE con una capacità di produzione di proteine paragonabile al sistema PURExpress20disponibile in commercio . Contrariamente ai precedenti approcci per semplificare la preparazione PURE17,18,19,nell'approccio OnePot tutte le proteine sono ancora espresse in ceppi separati. Ciò consente all'utente di regolare la composizione del sistema OnePot PURE semplicemente omettendo o aggiungendo ceppi specifici o regolando i volumi di inoculazione, generando così sistemi PURE dropout o alterando rispettivamente i rapporti proteici finali.
Il protocollo qui presentato fornisce un metodo dettagliato per la creazione del sistema OnePot PURE come descritto in precedenza20, sebbene β-mercaptoetanolo sia stato sostituito con tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP). Inoltre, vengono descritti due metodi per la purificazione dei ribosomi: la tradizionale purificazione del ribosoma senza tag utilizzando l'interazione idrofobica e il cuscino di saccarosio, adattata da Shimizu et al.15e la purificazione del ribosoma Ni-NTA basata su Wang et al.18 e Ederth et al.21 ma significativamente modificata. Quest'ultimo metodo facilita ulteriormente la preparazione del sistema PURE e lo rende accessibile a più laboratori, poiché sono necessarie solo attrezzature di laboratorio standard.
Il protocollo sperimentale riassume la preparazione di un versatile sistema TX-TL privo di celle PURE per fornire una piattaforma senza celle semplice, sintonizzabile ed economica, che può essere preparata utilizzando apparecchiature di laboratorio standard entro una settimana. Oltre a introdurre la composizione standard PURE, indichiamo come e dove può essere regolata, con particolare attenzione ai passaggi critici del protocollo per garantire la funzionalità del sistema.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

Il sistema di trascrizione-traduzione DEFINITO PURE (sintesi proteica utilizzando elementi ricombinanti) fornisce uno chassis accattivante per la biologia sintetica senza cellule. Sfortunatamente, i sistemi disponibili in commercio sono costosi e la loro sintonizzazione è limitata. In confronto, un approccio fatto in casa può essere personalizzato in base alle esigenze dell'utente. Tuttavia, la preparazione di sistemi fatti in casa è dispendiosa in termini di tempo e ardua a causa della necessità di ribosomi e di 36 purificazioni proteiche su media scala. La razionalizzazione della purificazione delle proteine mediante coculturazione e co-purificazione consente di ridurre al minimo i requisiti di tempo e manodopera. Qui, presentiamo un metodo semplice, regolabile, rapido ed economico per produrre tutti i componenti del sistema PURE entro 1 settimana, utilizzando apparecchiature di laboratorio standard. Inoltre, le prestazioni di OnePot PURE sono paragonabili ai sistemi disponibili in commercio. Il metodo di preparazione OnePot PURE espande l'accessibilità del sistema PURE a più laboratori grazie alla sua semplicità ed economicità.

Il protocollo di cui sopra è progettato per facilitare la creazione del sistema TX-TL privo di cellule PURE in qualsiasi laboratorio. Il protocollo include una descrizione dettagliata della preparazione delle tre parti distinte del sistema PURE: la proteina OnePot, il ribosoma e la soluzione energetica. Una pianificazione giornaliera dettagliata, che ottimizza il flusso di lavoro, è mostrata nella Tabella 1. Il flusso di lavoro è ottimizzato per la purificazione dei ribosomi his-tagged e gli intervalli di tempo possono differire leggermente se viene eseguita la purificazione dei ribosomi senza tag. Un preparato fornisce una quantità sufficiente di PURE per un minimo di cinquecento reazioni da 10 μL. Inoltre, le soluzioni preparate sono stabili per più di un anno a -80 °C e possono resistere a più cicli di congelamento-disgelo.
Livelli di sovraespressione adeguati per tutti i ceppi sono cruciali per la funzionalità della soluzione proteica finale. La Figura 1 mostra una sovraespressione riuscita in tutti i 36 singoli ceppi utilizzati successivamente per la preparazione proteica OnePot. La variazione delle intensità di banda delle proteine sovra-espresse si è verificata molto probabilmente a causa di una distorsione nei volumi di carico sul gel SDS-PAGE. Le dimensioni proteiche previste sono riassunte nella Tabella 2. GlyRS e PheRS sono costituiti da due subunità di vari pesi molecolari; le restanti 34 proteine sono costituite da una singola subunità. La chiave della semplicità e dell'efficacia temporale di questo protocollo è la fase di coculturazione e co-purificazione (Figura 2). La soluzione proteica OnePot è stata preparata aumentando il rapporto tra il ceppo EF-Tu e tutti gli altri ceppi di espressione. La composizione complessiva delle proteine finali è stata analizzata da SDS-PAGE (Figura 3A). Dai gel (corsie 2, 3), si nota che EF-Tu (43,3 kDa) è presente in una concentrazione maggiore rispetto alle altre proteine, come previsto. Mentre il gel fornisce una buona prima indicazione dei rapporti di espressione proteica, è difficile determinare se e a quale livello ogni singola proteina è stata espressa. Pertanto, si consiglia vivamente di confermare la sovraespressione in ciascun ceppo prima della coculturazione, come mostrato sopra.
Il ribosoma E. coli è una macchina molecolare complessa composta da oltre 50 singole subunità proteiche23. Uno spettro di assorbimento rappresentativo a 260 nm per la purificazione del ribosoma senza tag è mostrato nella Figura 4; il terzo picco è caratteristico dell'eluizione ribososoma riuscita. Per entrambi i metodi di purificazione dei ribosomi, è stato osservato il modello di esecuzione previsto sul gel SDS-PAGE (Figura 3A)18. Abbiamo osservato contaminazioni per entrambe le purificazioni, anche se in piccole quantità (<10%). In particolare, diversi contaminanti erano presenti nei ribosomi tag-free (corsie 5, 6) e His-tagged (corsie 11, 12) a causa della variazione del metodo. Per riferimento dell'utente, sono inclusi anche i gel SDS-PAGE per i sistemi combinati (corsie 8, 9 e 14, 15).
Infine, vengono confrontate le prestazioni dei sistemi preparati (Figura 3) utilizzando le diverse varianti di ribosomi. I corsi temporali di espressione eGFP in vitro mostrano che entrambi i sistemi PURE sono funzionali e producono eGFP fluorescenti. Tuttavia, la soluzione proteica OnePot combinata con i ribosomi His-tagged, utilizzando la concentrazione di ribosomi ottimizzata dalla titolazione, ha prodotto solo un terzo del livello di espressione della versione ribosoma non marcata (Figura 3B). Risultati simili sono stati osservati quando tre proteine di diverse dimensioni sono state espresse ed etichettate utilizzando il sistema di etichettatura in vitro del tRNA Green Lys (Figura 3C). Come si vede sul gel fluorescente, i prodotti a figura intera sono stati espressi con successo in entrambi i sistemi; tuttavia, solo circa la metà del livello di espressione è stato raggiunto con il sistema di ribosomi His-tag. Oltre all'etichettatura di fluorescenza, le bande previste per tutte e tre le proteine sono distinguibili su un gel colorato di Coomassie (Figura 3D). I risultati mostrano che il sistema di espressione introdotto, che può essere preparato entro una settimana in un laboratorio con attrezzature standard, può essere utilizzato per l'espressione in vitro di proteine codificate a valle del promotore T7 da modelli lineari.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Figura 1: Risultati rappresentativi per il test di sovraespressione per tutti i ceppi di espressione del sistema PURE. I numeri e le dimensioni delle proteine PURE sono riassunti nella Tabella 2. I numeri proteici 21, 24 e 27 sono contrassegnati con una stella per una migliore visualizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Figura 2: Purificazione delle proteine OnePot. La rappresentazione schematica e le fotografie corrispondenti di tutte le fasi coinvolte nella produzione della soluzione proteica OnePot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Figura 3: Prestazioni dei sistemi preparati utilizzando le diverse varianti di ribosomi. (A) Gel SDS-PAGE colorati blu Coomassie della soluzione proteica OnePot (corsie 2, 3), ribosomi privi di tag senza soluzione proteica (corsie 5, 6) e con soluzione proteica (corsie 8, 9), ribosomi his-tagged senza soluzione proteica (corsie 11, 12) e con soluzione proteica (corsie 14, 15). Sono state caricate due diverse concentrazioni per campione. (B) Confronto dell'espressione eGFP di ribosomi con tag His e ribosomi privi di tag. L'intensità di fluorescenza dell'espressione di eGFP in vitro viene monitorata nel tempo per una reazione PURE utilizzando ribosomi privi di tag (1,8 μM, blu) e ribosomi his-tagged (0,62 μM, rosso). Le concentrazioni del modello lineare e della soluzione proteica OnePot erano rispettivamente di 4 nM e 2 mg/ml. I pannelli (C) e (D) mostrano il gel SDS-PAGE di proteine sintetizzate in OnePot con tag-free (1,8 μM, blu, corsie 3, 4, 5) e ribosomi His-tag (0,62 μM, rosso, corsie 6, 7, 8) etichettati con un kit di etichettatura in vitro GreenLys(C)e colorati con blu Coomassie (D), rispettivamente. Le frecce nere indicano le bande previste di proteine sintetizzate: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Le concentrazioni del modello lineare e della soluzione proteica OnePot erano rispettivamente di 4 nM e 1,6 mg/ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Figura 4: Spettri di assorbanza a 260 nm. Risultati rappresentativi degli spettri di assorbanza a 260 nm durante la purificazione dell'interazione idrofobica di ribosomi privi di tag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Un programma giornaliero ottimizzato per il tempo per la preparazione di tutte le soluzioni OnePot PURE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Elenco delle proteine PURE Fare clic qui per scaricare questa <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">tabella.</a>
Tabella supplementare 1: Reagenti. La tabella elenca concentrazioni, volumi e altri dettagli specifici dei reagenti e dei componenti utilizzati durante questo studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 2: Buffer. Il foglio di calcolo elenca le esatte composizioni tampone per le purificazioni di proteine, ribosomi privi di tag e ribosomi His-tag, nonché le concentrazioni delle soluzioni stock utilizzate per la loro preparazione. Inoltre, calcola le quantità richieste di componenti in base al volume del buffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 3: Calcoli degli amminoacidi. Il foglio di calcolo elenca gli amminoacidi e le loro concentrazioni raccomandate di soluzione stock necessarie per la soluzione energetica. Calcola la quantità di acqua da aggiungere a ciascun amminoacido in base alla massa pesata effettiva e calcola anche il volume della soluzione di amminoacidi da aggiungere alla miscela di amminoacidi finali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella complementare 4: Soluzioni stock per la soluzione energetica. La tabella elenca le concentrazioni e i volumi di soluzioni stock necessarie per la soluzione energetica e indica ulteriori dettagli, comprese le condizioni di stoccaggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella complementare 5: Soluzione energetica. La tabella elenca i componenti della soluzione energetica e le loro concentrazioni raccomandate. Inoltre, calcola i volumi necessari da aggiungere alla soluzione finale in base alle concentrazioni della soluzione stock e al volume della soluzione energetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 6: PCR. La tabella elenca sequenze e concentrazioni dei primer utilizzati per la PCR di estensione e indica le temperature di fusione e i passaggi del termociclatore ottimizzati per una DNA polimerasi ad alta fedeltà. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 7: Reazione PURA. Il foglio di calcolo mostra un esempio di configurazione di una reazione PURE. Elenca le concentrazioni e i volumi utilizzati dei componenti per una reazione PURE utilizzando ribosomi privi di tag o ribosomi His-tag. Inoltre, calcola i rapporti di volume per le titolazioni di proteine e ribosomi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

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OnePot PURE Cell-Free System

Presentiamo un metodo rapido ed economico per produrre il sistema TX-TL ricombinante PURE cell-free utilizzando apparecchiature di laboratorio standard.

Sistema OnePot PURE Cell-Free

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Questo protocollo per un sistema di espressione proteica senza cellule ricombinanti, comunemente noto come sistema PURE, utilizza la coltura cellulare e la purificazione cellulare per semplificare le purificazioni proteiche richieste. Ciò riduce significativamente i requisiti di tempo e manodopera. Il metodo OnePot ha dimostrato di essere non solo conveniente, ma anche efficiente in termini di tempo.Riduce i tempi di preparazione da diverse settimane a tre giorni lavorativi. Ciò rende la piattaforma PURE cell-free accessibile a più laboratori in tutto il mondo e aiuta a implementare questa piattaforma davvero potente per la biologia sintetica senza cellule. Prima di iniziare, assicurati che tutti i ceppi esprimano bene le rispettive proteine.Per iniziare, preparare la colonna per la purificazione delle proteine OnePot come descritto nel manoscritto di testo usando due millilitri di resina di sefarosio, quindi caricare la colonna con solfato di nichel. Preparare le colture starter combinando 20 millilitri di media LB con 20 microlitri di ampicillina. Aggiungere 300 microlitri del mezzo in 35 pozzetti di una piastra sterile a 96 pozzi profondi.Inoculare ciascuno di essi con il rispettivo ceppo, ad eccezione del fattore di allungamento termo instabile, o EFTU, e sigillare la piastra con una membrana traspirante. Per la coltura EFTU, inoculare tre millilitri di ampicillina contenente mezzi LB in un tubo di coltura da 14 millilitri con un tappo a scatto. Circa tre millilitri di cultura EFTU sono sufficienti per una cultura di espressione OnePot.Incubarlo a 37 gradi Celsius mentre scuote a 260 rotazioni al minuto durante la notte. Il giorno dopo, trasferire 500 millilitri di supporti LB e 500 microlitri di ampicillina nel pallone sterile sconcertato. Inoculare la coltura OnePot PURE con 1.675 microlitri della coltura EFTU e 55 microlitri di ciascuna delle colture dalla piastra del pozzo profondo.Incubare la coltura per due ore a 37 gradi Celsius con uno scuotimento di 260 rotazioni al minuto, o fino a quando la densità ottica della coltura raggiunge da 0,2 a 0,3. Indurre la coltura con 500 microlitri di IPTG 0,1 millimolari e crescere per altre tre ore. Raccogliere le cellule per centrifugazione a quattro gradi Celsius e 3, 220 volte G per 10 minuti e conservare il pellet cellulare a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.Il terzo giorno, misurare le quantità di tamponi necessari per la loro purificazione e aggiungere TCEP a tutti loro come indicato nel testo. Conservare i buffer rimanenti senza TCEP a quattro gradi Celsius per future purificazioni. Equilibrare la colonna carica con 30 millilitri di tampone A.Dopo aver attraversato 25 millilitri di tampone A, chiudere la colonna dal basso.Scongelare le celle e utilizzare una pipetta sierologica per risusciere il pellet cellulare in 7,5 millilitri di tampone A.Lyse le celle utilizzando una sonda da 130 watt. Se la sonicazione ha successo, la soluzione diventerà più scura. Assicurati di mantenere le cellule sul ghiaccio e posiziona la sonda abbastanza in profondità senza toccare il tubo.Rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione a 21, 130 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius e mantenere il lisiato sul ghiaccio. Aggiungete il surnatante alla colonna equilibrata. Chiudi la colonna dall'alto e assicurati che non ci siano perdite.Incubare la colonna per tre ore a quattro gradi Celsius in rotazione utilizzando un rotatore a tubo. Eluire i componenti non legati dalla colonna e lavare con 25 millilitri di tampone A.Lavare la colonna con 25 millilitri di tampone imidazolico da 25 millimolari. Eluire le proteine con cinque millilitri di tampone imidazolo da 450 millimolari e mantenere le proteine eluite sul ghiaccio in ogni momento.Diluire l'eluato con 25 millilitri di tampone HT e mantenere la miscela su ghiaccio. Aggiungere 15 millilitri a un filtro centrifugo da 15 millilitri e concentrare fino a un volume di 1,5 millilitri. Aggiungere i restanti 15 millilitri al filtro con la soluzione concentrata e concentrare nuovamente a 1,5 millilitri.Aggiungere 10 millilitri di tampone HT al campione concentrato e concentrare a un millilitro. Recuperare il campione concentrato e aggiungere una quantità uguale di buffer di riserva B e conservare a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Durante lo scambio del buffer, ripristinare la colonna come specificato nel testo.Il quarto giorno, misurare la concentrazione proteica utilizzando il test bradford. Concentrare il campione con 0,5 millilitri di tre kilodalton cutoff filtro centrifugo a 20 milligrammi per millilitro. Verificare la composizione proteica onePot PURE utilizzando la pagina SDS.Diluire 2,5 microlitri del campione con 7,5 microlitri di acqua miscelati con 10 microlitri di due tamponi X Laemmli, quindi caricare cinque microlitri e 2,5 microlitri dei campioni sul gel. Eseguire la pagina SDS come specificato nel testo. Inserisci la concentrazione e la lunghezza del DNA nelle corrispondenti cellule gialle nel foglio di calcolo usando da due a 10 nanomolari di DNA per la reazione.Riempire il volume di reazione totale desiderato in microlitri. Rimuovere i reagenti necessari dal congelatore e scongelarli sul ghiaccio. Quindi, pipettare le quantità calcolate di acqua, DNA e soluzione energetica su un lato del tubo PCR o un angolo di un pozzo sulla piastra del pozzo 384.Pipettare le quantità calcolate di proteine e soluzione di ribosomi all'altro lato di un tubo PCR o all'angolo opposto della piastra del pozzo 384. Ruotare per circa 30 secondi per unire i componenti della reazione. Per evitare l'evaporazione durante gli esperimenti con il lettore di lastre, aggiungere 35 microlitri di cera liquida e sigillare la piastra con un sigillante trasparente.Incubare per un minimo di tre ore a 37 gradi Celsius. Per la lettura su un lettore di lastre, misurare l'intensità di fioritura alla lunghezza d'onda richiesta ogni due minuti. La sovraespressione di successo in tutti i singoli ceppi utilizzati successivamente per la preparazione proteica OnePot è mostrata qui.La composizione complessiva della soluzione proteica finale onePot PURE è stata analizzata dalla pagina SDS. È evidente che EFTU è presente in una concentrazione più elevata rispetto alle altre proteine, come previsto. I rendimenti di sintesi della soluzione proteica OnePot combinati con i ribosomi His-tagged o non-tagged sono stati analizzati monitorando la fluorescenza eGFP nel tempo.I livelli di espressione di tre diverse proteine etichettate utilizzando il sistema di etichettatura in vitro tRNA della lista verde, o colorazione Kumasi, sono stati analizzati su un gel di pagina SDS. Per un sistema PURE funzionale, è assolutamente fondamentale che tutti i ceppi esprimano bene le rispettive proteine. Questa tecnica facilita l'implementazione del sistema PURE all'ingegneria del sistema biologico, consentendo lo sviluppo di nuove reti genetiche, diagnostica molecolare, terapie e kit educativi.

Research

JoVE Journal

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L&#39;incapsulamento di trascrizione privo di cellule e macchinari traduzione in vescicole per la costruzione di Mimics cellulari

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