Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
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この研究は、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究イノベーションプログラムグラント723106、スイス国立科学財団グラント(182019)、EPFLの下で欧州研究評議会によって支援されました。

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ここで提示するプロトコルは、標準組成物15に基づいて多目的なPURE発現システム20を調製する、シンプルで時間的かつ費用対効果の高い方法を説明する。プロトコルを提供された毎日のスケジュール(表1)と一緒に利用することで、すべての成分を1週間で調製し、最大50010 μL PURE反応に十分な量の収量を得ることができます。このプロトコルで使用されるタンパク質は、高コピープラスミドから過剰発現しており、大腸菌に対する毒性が低いため、必要なすべてのタンパク質に対して良好な発現レベルが観察される(図1)。これにより、株の容易な調整が可能になり、したがって、コカルチャーにおけるタンパク質組成も、接種株20の比率を単に改変するだけである。リボソームタンパク質以外にも、EF-Tuの濃度は発現収率6において基本的に重要であることが示された。これに対し、他のタンパク質成分の濃度の変化は、PUREシステム7,24の堅牢性に対して比較的低い影響を及ぼしていた。従って、他のすべての成分に関してEF−Tuの接種比を調整することにより、標準PURE組成物と同等の組成物が達成でき、かつ同様の収率20を有するPURE系を達成することができる。タンパク質溶液を調製する際には、すべての株がうまく成長し、誘導後にコードされたタンパク質を過剰発現することが重要である(図1)。
リボソーム機能は、PUREシステム24の全体的な性能の鍵です。このプロトコルでは、リボソーム溶液を調製するための2つの異なる方法、すなわちタグフリーおよびHisタグ付きリボソーム精製が実証される。タグフリーリボソーム精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィーに続いて、FPLC精製システムおよび超遠心分離機15へのアクセスを必要とするスクロースクッションによる遠心分離に基づいている。これに対し、Hisタグ付きリボソーム18 および重力流親和性クロマトグラフィー精製を利用した方法は、特殊な機器を必要とせず、ほとんどの研究室で行うことができる。したがって、後者の方法は、シンプルさとアクセシビリティなどの利点をもたらします。しかし、OnePot PUREでHisタグ付きリボソームを使用した場合、タグなしバリアントと比較して、合成収率が有意に低いことがわかった(図3)。アプリケーションの種類に基づいて、この低収率は許容できる場合があります。
エネルギー溶液は 、インビトロ TX-TL反応に燃料を供給するために必要な低分子量成分およびtRNAを提供する。このプロトコルは、ユーザーのニーズに基づいて簡単に調整できる典型的なエネルギーソリューションのレシピを提供します。tRNA、NTP、およびクレアチンリン酸と共に、Mg2+ イオンの豊富さと濃度は、トランスクリプションと翻訳の重要な要因であるため、PUREシステム8の全体的な性能にとって重要な存在でした。場合によっては、イオンの滴定が、したがって、全体的なPURE性能を大幅に向上させることができます。DNAの完全性は、PUREのパフォーマンスにとって非常に重要です。したがって、プロモーター領域、リボソーム結合部位、標的遺伝子を検証し、適切なDNA濃度(<2nM)を確保する配列は、PURE反応の設定中に生じる可能性のある問題のトラブルシューティングに役立ちます。
PUREシステムは最小限のTX-TLシステムであり、特定のアプリケーションは、このように追加の調整を必要とするかもしれません25.これらは、異なるRNAポリメラーゼ9、26、シャペロン13、およびEF-PまたはArfA8などのタンパク質因子を組み込むこともできる。これらのタンパク質に対する発現株は、コ培養物に含めることができるが、それらを調製されたシステムに別々に加えることは、必要なタンパク質レベルのより良い制御を提供するかもしれない。さらに、小胞の含みは、膜タンパク質10,11の産生に不可欠である。環境を還元するのではなく酸化し、ジスルフィド結合イソメラーゼは、適切なジスルフィド結合形成を促進し、例えば分泌タンパク質12に必要とされる。
追加の成分が反応を妨げないようにすることが不可欠です。反応を設定したり、他のコンポーネントを追加するときに注意を払う最も重要な要因を以下に示します。互換性のないバッファーが使用されず、イオン濃度が乱されていないことを確認します。グリセロール、カリウム、マグネシウム、カルシウムイオン、浸透糖、ピロリン酸塩、抗生物質、EDTAを含む溶液はできるだけ避けてください。例えば、DNA精製中に溶出バッファーを水に置き換えることは、この緩衝液中の一般的な添加剤であるEDTAとして有益であり得る。NTPやdNTPなどの追加の負電荷分子を溶液に供給するには、負に荷電した分子がキレート剤として動作し、正に荷電した分子に結合するため、マグネシウム濃度8を調整する必要があります。中性pHは反応に理想的である。したがって、すべてのコンポーネントは、対応するpHにバッファリングする必要があります。これは、特に、高酸性または塩基性分子(例えば、NTPなど)にとって重要です。良好な収率を達成するためには、34°C未満の温度が収率27を大幅に低下させるので、37°C付近の温度を実装する必要があります。
OnePot PURE を準備する前に、ターゲット アプリケーションと、ボリューム、純度、変更の容易さ、コンポーネントの含みやすさ、または省略などの関連する要件を考慮する必要があることに注意してください。多くのアプリケーションでは、システムは優れた選択肢になりますが、他のシステムには、収率、調整可能性、およびOnePotシステムでは提供できないその他の要因が必要な場合があります。これらのプロトコルは、このような準備のための重要なステップがすべてここに要約されるため、導入されたプロトコルは、任意の自家製システムの準備に有益です。
OnePotシステムの主な利点の1つは、市販のPURExpressシステムとの互換性であり、各PURExpressコンポーネントをOnePotと同等のコンポーネントに順次交換することで、すべてのコンポーネントの機能性と完全性を個別にテストする可能性があります。タンジーや簡単、高速、コスト効果の高い準備などのOnePot PUREシステムの利点は、無細胞TX-TLを世界中のより多くの研究所にアクセス可能にし、無細胞合成生物学におけるこの強力なプラットフォームの実装を拡大することに貢献します。

無細胞転写翻訳(TX-TL)システムは、生物学的システムの調査およびエンジニアリングのための有望なプラットフォームです。彼らはもはや成長、ホメオスタシス、または規制メカニズムを含む生命維持プロセスに依存しなくなるため、単純化された調整可能な反応条件を提供します1.このように、無細胞システムは生体分子システムの調査に貢献し、合理的なバイオデザイン戦略2をテストするフレームワークを提供し、将来の合成細胞3、4のシャシーを提供することが期待される。完全組換えPUREシステムは、その定義された最小限の構成、ならびにその調整性および調整可能性5のために特に魅力的なシャーシを提供する。
2001年5年に最初の機能的、完全組換えPUREシステムが確立されて以来、システム限界を拡大し、システムの組成を最適化して、転写調節9、膜10、11および分泌タンパク質合成12を可能にするシステムの組成を最適化し、タンパク質の折りたたみを容易にする。.現在では、PUREfrex(ジーンフロンティア)、PURExpress(NEB)、マジックピュア(クリエイティブバイオラボ)の3つの市販システムがあります。しかし、これらのシステムはコストがかかり、その正確な組成は独自であり、したがって未知であり、適応性は限られている。
社内で調製されたPUREシステムは、最も費用対効果が高く、チューニング可能なオプション15、16であることが判明しました。しかし、タンパク質およびリボソーム分画に必要な37の精製ステップは、時間と退屈です。PUREシステム調製17、18、19の効率を改善するためにいくつかの試みがなされている。我々は、最近、PUREシステムに存在するすべての必要な非リボソームタンパク質を共培養し、共精製することが可能であることを実証した。このOnePot法は、費用対効果が高く、時間効率が良く、準備時間を数週間から3営業日に短縮することが実証されています。このアプローチは、市販のPURExpressシステム20に匹敵するタンパク質産生能力を有するPUREシステムを生成する。PURE調製17、18、19を簡素化するための以前のアプローチとは対照的に、OnePotアプローチでは、すべてのタンパク質が依然として別々の株で発現している。これにより、ユーザーは単に特定の株を省略または追加したり、接種量を調整したりするだけでOnePot PUREシステムの組成を調整することができ、それぞれ中退PUREシステムを生成したり、最終的なタンパク質比を変更することができます。
ここに示すプロトコルは、前述の20のOnePot PUREシステムを作成するための詳細な方法を提供しますが、β-メルカプトエタノールはトリス(2-カルボクセチル)ホスフィン(TCEP)に置き換えられました。また、リボソーム精製の2つの方法は、疎水性相互作用とスクロースクッションを用いた伝統的なタグフリーリボソーム精製、清水ら15から適応し、および王らら18 およびエーデルスら21 に基づくNi-NTAリボソーム精製を著しく修飾する。後者の方法は、PUREシステムの調製をさらに容易にし、標準的な実験室用機器のみが必要であるため、より多くの実験室にアクセスできるようにします。
実験プロトコルは、1週間以内に標準的な実験装置を使用して調製することができるシンプルで、調整可能な、費用対効果の高い無細胞プラットフォームを提供するために、多目的なPURE無細胞TX-TLシステムの調製をまとめたものです。標準の PURE 構図を導入するほか、システムの機能性を確保するためにプロトコルの重要なステップに主に焦点を当てて、調整する方法と場所を示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

定義されたPURE(組換え元素を用いたタンパク質合成)転写翻訳システムは、無細胞合成生物学の魅力的なシャシーを提供します。残念ながら、市販のシステムはコストがかかり、そのタントは限られています。それに比べて、ユーザーのニーズに基づいて、自家製のアプローチをカスタマイズできます。しかし、自家製システムの調製は、リボソームと36の中規模タンパク質精製の必要性のために時間がかかり、困難です。タンパク質の精製をコキュレーションと共精製によって合理化することで、時間と労力の要件を最小限に抑えることができます。ここでは、標準の実験装置を使用して、1週間以内にすべてのPUREシステムコンポーネントを製造するための、簡単で調整可能で時間的でコスト効率の良い方法を紹介します。さらに、OnePot PUREの性能は、市販のシステムに匹敵する。OnePot PURE調製方法は、そのシンプルさと費用対効果のために、PUREシステムのアクセシビリティをより多くのラボに拡大します。

上記のプロトコルは、任意の実験室でPURE無細胞TX-TLシステムの確立を容易にするように設計されています。このプロトコルには、Pureシステムの3つの異なる部分の調製の詳細な説明が含まれています:OnePotタンパク質、リボソーム、およびエネルギー溶液。ワークフローを最適化する詳細な日次スケジュールを 表 1に示します。ワークフローは、Hisタグ付きリボソームの精製のために最適化されており、タグなしリボソーム精製が行われると、時間枠が若干異なる場合があります。1つの調製物は、500の10 μL反応の最小値のためのPUREの十分な量を提供する。さらに、調製された溶液は-80°Cで1年以上安定しており、複数の凍結融解サイクルに耐えることができます。
すべての株に対する十分な過剰発現レベルは、最終的なタンパク質溶液の機能性にとって非常に重要です。 図1 は、OnePotタンパク質調製のために続いて使用される36個の個々の株すべてにおいて成功した過剰発現を示す。過剰発現タンパク質のバンド強度の変動は、おそらくSDS-PAGEゲルにボリュームをロードする偏りのために起こった。予想されるタンパク質サイズを 表2にまとめた。GlyRS と PheRS は、さまざまな分子量の 2 つのサブユニットで構成されます。残りの34個のタンパク質は、単一のサブユニットで構成されています。このプロトコルのシンプルさと時間効果の鍵は、コキュレーションと共精製のステップです(図2)。OnePotタンパク質溶液は、他のすべての発現株に対するEF-Tu株の比率を増加させることによって調製した。最終的なタンパク質の全体組成をSDS-PAGE(図3A)で分析した。ゲル(レーン2、3)からは、EF-Tu(43.3 kDa)が他のタンパク質に比べて高濃度で存在することが顕著である。ゲルはタンパク質発現比の第一の指標を良好に提供するが、個々のタンパク質が発現したかどうか、どのレベルで発現したか否かを判断することは困難である。したがって、上記のように、コキュレーションの前に各株の過剰発現を確認することを強くお勧めします。
大腸菌リボソームは、50個以上の個々のタンパク質サブユニット23から構成される複雑な分子機械である。タグフリーリボソーム精製用260 nmにおける代表的な吸収スペクトルを図4に示す。第3のピークは、リボソーム溶出の成功の特徴である。両方のリボソーム精製法について、SDS-PAGEゲル上の期待される走行パターン(図3A)18が観察された。我々は、少量(<10%)ではあるが、両方の精製のための汚染を観察した。特に、異なる汚染物質は、方法の変動に起因するタグなし(レーン5、6)およびHisタグ付き(レーン11、12)リボソームに存在していた。ユーザーの参照のために、結合されたシステムのためのSDS-PAGEのゲルはまた含まれている(車線8、9、および14、15)。
最後に、異なるリボソームバリアントを用いた準備システム(図3)の性能を比較する。 in vitro eGFP発現の時間コースは、両方のPUREシステムが機能し、蛍光eGFPを生成することを示しています。しかし、OnePotタンパク質溶液をHisタグ付きリボソームと組み合わせて、滴定によって最適化されたリボソーム濃度を用いて、非タグリボソームバージョンの発現量の3分の1しか得られなかった(図3B)。同様の結果は、異なるサイズの3つのタンパク質を発現させ、緑色のLys tRNA in vitro 標識システムを用いて標識した場合に観察された(図3C)。蛍光ゲルに見られるように、完全長の製品は両方のシステムで正常に発現されました。しかし、表現レベルの約半分だけがHisタグリボソームシステムで達成されました。蛍光標識に加えて、3つのタンパク質すべてについて期待されるバンドは、クーマッシー染色ゲルで区別可能である(図3D)。この結果は、標準装置を用いた実験室で1週間以内に調製できる発現系が、線形テンプレートからT7プロモーターの下流にコードされるタンパク質の インビトロ 発現に使用できることを示している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> 図1: PUREシステムのすべての発現株に対する過剰発現試験の代表的な結果 PUREタンパク質の数とサイズを 表2にまとめた。タンパク質番号21、24、27は、より良い視覚化のために星でマークされています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> 図2:OnePotタンパク質精製 OnePotタンパク質溶液の製造に関与するすべてのステップの模式的描写および対応する写真。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> 図3:異なるリボソーム変異体を用いた調製システムの性能(A)OnePotタンパク質溶液のクーマシーブルー染色SDS-PAGEゲル(レーン2、3)、タンパク質溶液なしのタグフリーリボソーム(レーン5、6)、タンパク質溶液(レーン8、9)、タンパク質溶液なしのリボソーム(レーン8、9)、タンパク質溶液なしのリボソーム(レーン11、12)と14のタンパク質溶液を用いた。1サンプルにつき2つの異なる濃度がロードされた。(B) ヒズタグリボソームとタグフリーリボソームのeGFP発現の比較in vitro eGFP発現の蛍光強度は、タグフリーリボソーム(1.8 μM、青)およびHisタグ付きリボソーム(0.62 μM、赤色)を使用してPURE反応を経て監視します。線形鋳型およびOnePotタンパク質溶液の濃度はそれぞれ4 nMおよび2mg/mLであった。パネル(C)および(D)は、タグフリー(1.8 μM、青、レーン3、4、5)とHisタグリボソーム(0.62 μM、赤、レーン6、7、8)で示されたOnePotで合成されたタンパク質のSDS-PAGEゲルを示し、それぞれ緑色のインビトロラベリングキット(C)で標識し、クーマスDと染色する)黒矢印は、合成タンパク質の予想バンドを示します: eGFP (26.9 kDa), ArgRS (64.7 kDa), T7 RNAP (98.9 kDa).線形鋳型およびOnePotタンパク質溶液濃度はそれぞれ4nMおよび1.6mg/mLであった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> 図4:260nmの吸光スペクトル タグフリーリボソームの疎水性相互作用精製中の260nmにおける吸光スペクトルの代表的な結果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1: すべてのOnePot PUREソリューションの準備のための毎日の時間最適化スケジュール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">このテーブルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a>
表2:PUREタンパク質リスト<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:試薬 この表には、この研究で使用された試薬と成分の濃度、体積、およびその他の特定の詳細がリストされています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 2: バッファー。 このスプレッドシートには、タンパク質、タグフリーリボソーム、Hisタグリボソーム精製のための正確なバッファー組成、および調製に使用されるストックソリューションの濃度がリストされています。さらに、バッファボリュームに基づいて必要なコンポーネントの量を計算します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表3:アミノ酸計算 このスプレッドシートには、エネルギー溶液に必要なアミノ酸と推奨ストック溶液濃度が記載されています。実際の重み付けされた質量に基づいて各アミノ酸に添加される水の量を算出し、また、最終的なアミノ酸の混合物に添加されるアミノ酸溶液の体積を計算する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表4:エネルギーソリューションのストックソリューション この表は、エネルギーソリューションに必要なストックソリューションの濃度と量を一覧表示し、貯蔵条件を含むさらなる詳細を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 5: エネルギーソリューション 次の表に、エネルギー溶液成分とその推奨濃度を示します。さらに、ストック溶液濃度とエネルギー溶液の体積に基づいて、最終解に追加される必要量を計算します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 6: PCR. この表は、拡張PCRに使用されるプライマーの配列と濃度をリストし、高忠実度DNAポリメラーゼに最適化された融解温度とサーモサイクラーステップを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表7:PURE反応。 スプレッドシートは PURE リアクションの設定例を示しています。タグフリーリボソームまたはHisタグリボソームを使用して、PURE反応に使用される濃度と成分の体積をリストします。また、タンパク質とリボソーム滴定の体積比を計算します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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OnePot PURE Cell-Free System

標準的な実験装置を用いて組換え純粋な無細胞TX-TLシステムを製造するための迅速かつ費用対効果の高い方法を提示します。

ワンポット純粋な無細胞システム

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

一般にPUREシステムとして知られている組換え無細胞タンパク質発現系のためのこのプロトコルは、必要なタンパク質精製を合理化するために細胞培養および細胞精製を利用する。これにより、時間と労働要件が大幅に最小化されます。OnePot法は、費用対効果が高いだけでなく、時間効率も高いことが証明されています。それは、数週間から3営業日に準備時間を削減します。これにより、PURE無細胞プラットフォームは世界中のより多くの研究所にアクセス可能になり、合成細胞フリー生物学のためのこの本当に強力なプラットフォームを実装するのに役立ちます。始める前に、すべての株がそれぞれのタンパク質をうまく発現していることを確認してください。まず、2ミリリットルのセファロース樹脂を用いてテキスト原稿に記載されているOnePotタンパク質精製用カラムを準備し、そのカラムに硫酸ニッケルをチャージします。20マイクロリットルのアンピシリンとLB培地を20ミリリットル組み合わせてスターター培養を準備します。滅菌96深井戸プレートの35個の井戸に300マイクロリットルの培地を加えます。伸び率が熱不安定、またはEFTUを除き、それぞれの株でそれぞれの株を接種し、通気性のある膜でプレートを密封する。EFTU培養の場合、LB培地を含むアンピシリンを3ミリリットルのアンピシリンをスナップキャップ付き14ミリリットル培養チューブに接種する。EFTU培養の約3ミリリットルは、1つのOnePot発現培養に十分である。一晩毎分260回転で揺れながら、摂氏37度でインキュベートします。翌日、500ミリリットルのLB培地と500マイクロリットルのアンピシリンを無菌バッフルフラスコに移す。1,675マイクロリットルのEFTU培養液と深層ウェルプレートから各培養物の55マイクロリットルでOnePot PURE培養を接種します。1分間に260回転の揺れで37°Cで2時間培養するか、または培養の光学密度が0.2〜0.3に達するまで培養をインキュベートする。0.1ミリモルIPTGの500マイクロリットルで培養を誘導し、さらに3時間増殖させる。摂氏4度、G220倍10分間、摂心度3、220倍で細胞を収穫し、さらに使用するまでマイナス80度で細胞ペレットを貯蔵する。3日目に、精製に必要なバッファの量を測定し、テキストに示されているように、それらのすべてにTCEPを追加します。将来の精製のために、TCEP なしで残りのバッファーを摂氏 4 度で保管してください。30ミリリットルのバッファーAで荷電カラムを平衡化し、25ミリリットルのバッファーAが通過した後、カラムを底部から閉じます。細胞を解凍し、血清学的ピペットを使用して、130ワットのプローブを使用して細胞を7.5ミリリットルのバッファーA.Lyseで再懸濁させます。超音波処理が成功した場合、ソリューションは暗くなります。細胞を氷の上に置き、チューブに触れることなく十分な深さをプローブに置くようにしてください。21、130倍Gで摂氏4度で20分間遠心分離して細胞の破片を取り除き、氷の上にライセートを保ちます。平衡化された列に上澄み剤を追加します。上から列を閉じ、漏れがないことを確認します。チューブ回転器を使用して回転下で摂氏4度で3時間カラムをインキュベートします。カラムから非結合成分をエルトし、25ミリリットルのバッファーAで洗浄し、25ミリモルイミダゾールバッファーの25ミリリットルでカラムを洗浄します。450ミリモルイミダゾール緩衝液の5ミリリットルでタンパク質をエル化し、溶出したタンパク質を常に氷の上に保ちます。25ミリリットルのHTバッファーで溶出液を希釈し、氷の上に混合物を保ちます。15ミリリットルの遠心フィルターに15ミリリットルを加え、1.5ミリリットルの体積に濃縮します。残りの15ミリリットルを濃縮液でフィルターに加え、もう一度1.5ミリリットルに濃縮します。濃縮サンプルにHTバッファーの10ミリリットルを追加し、1ミリリットルに濃縮.濃縮サンプルを回収し、同量のストックバッファBを追加し、さらに使用するまでマイナス80°Cで保存します。バッファー交換中に、テキストで指定されたとおりに列を復元します。4日目に、ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。0.5キロダルトンカットオフ遠心フィルターの0.5ミリリットルを1ミリリットルあたり20ミリグラムに濃縮します。SDS ページを使用して OnePot PURE タンパク質組成を確認します。2.5マイクロリットルの水を2つのX Laemmliバッファーの10マイクロリットルと混合した7.5マイクロリットルの水で希釈し、5マイクロリットルと2.5マイクロリットルのサンプルをゲルにセットします。テキストで指定されたとおりに SDS ページを実行します。反応のためにDNAの2〜10ナノモルを使用して、スプレッドシート内の対応する黄色の細胞内のDNAの濃度と長さを記入します。所望の総反応量をマイクロリットルで満たします。必要な試薬を冷凍庫から取り出し、氷の上で解凍します。次に、計算された量の水、DNAおよびエネルギー溶液をPCRチューブの片側または384ウェルプレート上のウェルの片隅にピペットします。PCRチューブの反対側または384ウェルプレートの反対側の角にタンパク質およびリボソーム溶液の計算量をピペットします。約30秒間回転し、反応成分を合合させます。プレートリーダーの実験中の蒸発を防ぐには、35マイクロリットルの液体ワックスを加え、透明なシーラントでプレートを密封します。37°Cで最低3時間インキュベートします。プレートリーダーで読み出しを行う場合は、必要な波長での蛍光強度を2分ごとに測定します。OnePotタンパク質調製のために続いて使用されるすべての個々の株における過剰発現が図示される。最終的なOnePot PUREタンパク質溶液の全体的な組成をSDSページで分析した。EFTUは、予想通り他のタンパク質に比べて高濃度で存在することが顕著である。Hisタグ付きまたはタグなしリボソームと組み合わせたOnePotタンパク質溶液の合成収率を、eGFP蛍光を時間の経過とともにモニタリングして分析した。緑色リストtRNA in vitro標識システム、またはクマシ染色を用いて標識した3種類のタンパク質の発現レベルを、SDSページゲルで分析した。機能性PUREシステムの場合、すべての株がそれぞれのタンパク質をうまく発現することが絶対に重要です。この技術は、生物学的システム工学へのPUREシステムの実装を容易にし、新しい遺伝子ネットワーク、分子診断、治療薬および教育キットの開発を可能にする。

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