Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av European Research Council under EUs Horizon 2020 Research and Innovation Program Grant 723106, swiss National Science Foundation Grant (182019) og EPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PURE+technology.">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).</li><li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li><li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli.">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).</li><li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Protokollen som presenteres her beskriver en enkel, tids- og kostnadseffektiv metode for å forberede et allsidig PURE-uttrykkssystem20 basert på standardsammensetningen15. Ved å bruke protokollen sammen med de medfølgende daglige tidsplanene (tabell 1), kan alle komponenter fremstilles om 1 uke og gi beløp som er tilstrekkelige for opptil fem hundre 10 μL PURE-reaksjoner. Siden proteinene som brukes i denne protokollen er overekspressert fra høye kopiplasmider og har lav toksisitet til E. coli, observeres gode uttrykksnivåer for alle nødvendige proteiner (Figur 1). Dette muliggjør enkel justering av stammer, og derfor også proteinsammensetning i kokulturer, bare ved å endre forholdene i inokulasjonsstammene20. Foruten ribosomale proteiner viste konsentrasjonen av EF-Tu å være av grunnleggende betydning for uttrykk gir6. Endringer i konsentrasjonen av de andre proteinkomponentene hadde derimot en relativt lav innvirkning på robustheten til PURE-systemet7,24. Derfor, ved å justere inokulasjonsforholdet til EF-Tu med hensyn til alle de andre komponentene, kan en sammenlignbar sammensetning til standard PURE-sammensetningen oppnås, og et PURE-system med tilsvarende utbytte20 kan oppnås. Ved tilberedning av proteinoppløsningen er det avgjørende å sikre at alle stammer vokser godt og overekspresserer det kodede proteinet etter induksjon (figur 1).
Ribosomfunksjon er nøkkelen for den generelle ytelsen til PURE-systemet24. I denne protokollen demonstreres to forskjellige metoder for å forberede ribosomets løsning, det vil si tag-fri og his-tag ribosome rensing. Den tagfrie ribosomerensingen er basert på hydrofob interaksjonskromatografi etterfulgt av sentrifugering med en sukrosepute, som krever tilgang til et FPLC-rensesystem og en ultracentrifuge15. I motsetning krever metoden som bruker hismerkede ribosomer18 og tyngdekraftens strømningskromatografirensing ikke spesialisert utstyr og kan utføres i de fleste laboratorier. Sistnevnte metode gir derfor fordeler som enkelhet og tilgjengelighet. Vi observerte imidlertid et betydelig lavere synteseutbytte ved bruk av de hismerkede ribosomene i OnePot PURE sammenlignet med den tagfrie varianten (figur 3). Basert på applikasjonstypen kan dette lavere utbyttet være akseptabelt.
Energiløsningen gir de lave molekylvektkomponentene og tRNAene som kreves for å gi drivstoff til in vitro TX-TL-reaksjoner. Denne protokollen gir en oppskrift på en typisk energiløsning, som enkelt kan justeres basert på brukernes behov. Sammen med tRNA, NTP og kreatinfosfat har overflod og konsentrasjon av Mg2+ ioner vært avgjørende for den generelle ytelsen til PURE-systemet8, da de er kritiske kofaktorer for transkripsjon og oversettelse. I noen tilfeller kan titrering av ioner derfor i stor grad forbedre den generelle PURE-ytelsen. DNA-integritet er avgjørende for PURE-ytelsen. Dermed vil sekvens som verifiserer promotorregionen, ribosomets bindingssted og målgen og sikre at en tilstrekkelig DNA-konsentrasjon (<2 nM) vil bidra til å feilsøke problemer som kan oppstå mens du setter opp en PURE-reaksjon.
PURE-systemet er et minimalt TX-TL-system, og spesifikke applikasjoner kan dermed kreve ytterligere justeringer25. Disse kan omfatte å inkorporere forskjellige RNA-polymeraser9,26, anstander13og proteinfaktorer som EF-P eller ArfA8. Selv om uttrykksstammene for disse proteinene kan inkluderes i kokulturene, kan det å legge dem separat til det forberedte systemet gi bedre kontroll over de nødvendige proteinnivåene. Videre er inkludering av vesicles avgjørende for produksjon av membranproteiner10,11. Oksidasjon i stedet for å redusere miljøer og en disulfidbinding isomerase letter riktig disulfidbindingsdannelse, som for eksempel kreves for sekretoriske proteiner12.
Det er viktig å sikre at eventuelle tilleggskomponenter ikke forstyrrer reaksjonen. De viktigste faktorene å være oppmerksom på når du setter opp en reaksjon eller legger til andre komponenter, er oppført nedenfor. Kontroller at verken inkompatible buffere brukes eller at ionkonsentrasjonene forstyrres. Unngå løsninger som inneholder glyserol, høye konsentrasjoner av kalium, magnesium, kalsiumioner, osmolytter, pyrofosfat, antibiotika eller EDTA, så mye som mulig. For eksempel kan det være gunstig å erstatte en elutionbuffer med vann under DNA-rensing, da EDTA er et vanlig tilsetningsstoff i denne bufferen. Å forsyne løsningene med ekstra negativt ladede molekyler som NTP eller dNTP krever justering av magnesiumkonsentrasjonen8, da de negativt ladede molekylene oppfører seg som chelateringsmidler og binder positivt ladede molekyler. En nøytral pH er ideell for reaksjonen. Følgelig bør alle komponenter bufres til tilsvarende pH; Dette er spesielt viktig for svært sure eller grunnleggende molekyler som NTPs. Til slutt er temperatur og volum nøkkelparametere for reaksjonen. For å oppnå et godt utbytte, bør man implementere en temperatur rundt 37 °C, da temperaturer under 34 °C vil redusere utbyttetbetydelig 27.
Det er relevant å merke seg at før man forbereder OnePot PURE, bør man vurdere målapplikasjonen og de tilknyttede kravene, for eksempel volum, renhet, enkel modifikasjon og inkludering eller utelatelse av komponenter. For mange applikasjoner vil systemet være et utmerket valg, men andre kan kreve utbytte, justerbarhet og andre faktorer, som OnePot-systemet ikke kan gi. Uansett vil den introduserte protokollen være gunstig for utarbeidelsen av ethvert hjemmelaget system, da alle kritiske trinn for slik forberedelse er oppsummert her.
En av de viktigste fordelene med OnePot-systemet er kompatibiliteten med det kommersielt tilgjengelige PURExpress-systemet, som gir muligheten til å teste funksjonaliteten og integriteten til alle komponenter separat ved å erstatte hver PURExpress-komponent sekvensielt med sin OnePot-ekvivalent. Fordelene med OnePot PURE-systemet, som tunability og enkel, rask og kostnadseffektiv forberedelse, vil gjøre cellefri TX-TL tilgjengelig for flere laboratorier over hele verden og bidra til å utvide implementeringen av denne kraftige plattformen i cellefri syntetisk biologi.

Cellefrie transkripsjonsoversettelsessystemer (TX-TL) utgjør en lovende plattform for utredning og prosjektering av biologiske systemer. De gir forenklede og justerbare reaksjonsforhold, da de ikke lenger er avhengige av livsoppholdende prosesser, inkludert vekst, homeostase eller regulatoriskemekanismer 1. Dermed forventes det at cellefrie systemer vil bidra til utredning av biomolekylære systemer, tilby et rammeverk for å teste rasjonelle biodesignstrategier2, og gi et chassis for en fremtidig syntetisk celle3,4. Det fullt rekombinante PURE-systemet tilbyr et spesielt tiltalende kabinett på grunn av den definerte og minimale sammensetningen, i tillegg til justerbarheten og justerbarheten5.
Siden det første funksjonelle, fullt rekombinante PURE-systemet ble etablert i 20015, er det gjort forsøk på å utvide systemgrensene og optimalisere systemets sammensetning for å forbedre systemutbyttet6,7,8, tillate transkripsjonsregulering9, membran10,11 og sekretorisk proteinsyntese12, og for å lette proteinfolding13,14 . I dag er det tre kommersielt tilgjengelige systemer: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) og Magic PURE (Creative Biolabs). Imidlertid er disse systemene kostbare, deres eksakte sammensetning er proprietær og dermed ukjent, og tilpasningsevnen er begrenset.
PURE-systemer utarbeidet internt viste seg å være det mest kostnadseffektive og justerbare alternativet15,16. Imidlertid er de nødvendige 37 rensetrinnene for protein- og ribosomefraksjoner tidkrevende og kjedelige. Det er gjort flere forsøk på å forbedre effektiviteten til PURE-systemforberedelsene17,18,19. Vi viste nylig at det er mulig å kokulturere og korense alle nødvendige ikke-ribosomale proteiner som finnes i PURE-systemet. Denne OnePot-metoden har vist seg å være kostnadseffektiv og tidseffektiv, og reduserer tilberedningstiden fra flere uker til 3 arbeidsdager. Tilnærmingen genererer et PURE-system med en proteinproduksjonskapasitet som kan sammenlignes med det kommersielt tilgjengelige PURExpress-systemet20. I motsetning til de tidligere tilnærmingene for å forenklePURE-preparatet 17,18,19, i OnePot-tilnærmingen er alle proteiner fortsatt uttrykt i separate stammer. Dette gjør det mulig for brukeren å justere sammensetningen av OnePot PURE-systemet ved bare å utelate eller legge til spesifikke stammer eller justere inokulasjonsvolumene, og dermed generere dropout PURE-systemer eller endre henholdsvis de endelige proteinforholdene.
Protokollen som presenteres her gir en detaljert metode for å lage OnePot PURE-systemet som beskrevet tidligere20, selv om β-mercaptoetanol ble erstattet med tris (2-karboksyetyl)fosfin (TCEP). Videre er to metoder for ribosomrensing beskrevet: tradisjonell tag-fri ribosomrensing ved hjelp av hydrofob interaksjon og sukrosepute, tilpasset fra Shimizu et al.15, og Ni-NTA ribosomrensing basert på Wang et al.18 og Ederth et al.21, men betydelig modifisert. Sistnevnte metode letter videre utarbeidelsen av PURE-systemet og gjør det tilgjengelig for flere laboratorier, da det bare er nødvendig med standard laboratorieutstyr.
Den eksperimentelle protokollen oppsummerer utarbeidelsen av et allsidig PURE cellefritt TX-TL-system for å gi en enkel, justerbar, kostnadseffektiv cellefri plattform, som kan tilberedes ved hjelp av standard laboratorieutstyr innen en uke. I tillegg til å introdusere standard PURE-komposisjon, angir vi hvordan og hvor den kan justeres, med hovedfokus på kritiske trinn i protokollen for å sikre systemets funksjonalitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

Det definerte PURE(proteinsyntesen ved hjelp av rekombinante elementer) transkripsjonsoversettelsessystem gir et tiltalende chassis for cellefri syntetisk biologi. Dessverre er kommersielt tilgjengelige systemer kostbare, og deres tunability er begrenset. Til sammenligning kan en hjemmelaget tilnærming tilpasses basert på brukernes behov. Imidlertid er utarbeidelsen av hjemmelagde systemer tidkrevende og vanskelig på grunn av behovet for ribosomer samt 36 mellomstore proteinrensinger. Effektivisering av proteinrensing ved kokulturering og korensing gjør det mulig å minimere tids- og arbeidskrav. Her presenterer vi en enkel, justerbar, tids- og kostnadseffektiv metode for å produsere alle PURE-systemkomponenter innen 1 uke, ved hjelp av standard laboratorieutstyr. Videre er ytelsen til OnePot PURE sammenlignbar med kommersielt tilgjengelige systemer. OnePot PURE-forberedelsesmetoden utvider tilgjengeligheten til PURE-systemet til flere laboratorier på grunn av sin enkelhet og kostnadseffektivitet.

Protokollen ovenfor er utformet for å lette etableringen av PURE cellefritt TX-TL-system i ethvert laboratorium. Protokollen inneholder en detaljert beskrivelse av utarbeidelsen av de tre forskjellige delene av PURE-systemet: OnePot-proteinet, ribosomet og energiløsningen. En detaljert daglig tidsplan, som optimaliserer arbeidsflyten, vises i Tabell 1. Arbeidsflyten er optimalisert for rensing av hans taggede ribosomer, og tidsrammer kan variere noe hvis tag-fri ribosomrensing utføres. Ett preparat gir tilstrekkelig mengde PURE for minst fem hundre 10 μL reaksjoner. Videre er de forberedte løsningene stabile i mer enn et år ved -80 °C og tåler flere fryse-tine sykluser.
Tilstrekkelig overekspressjonsnivå for alle stammer er avgjørende for funksjonaliteten til den endelige proteinløsningen. Figur 1 viser vellykket overekspresjon i alle de 36 individuelle stammene som senere brukes til OnePot-proteinpreparatet. Variasjon i de over-uttrykte proteinenes båndintensiteter skjedde mest sannsynlig på grunn av en skjevhet i lastevolumene på SDS-PAGE gelen. De forventede proteinstørrelsene er oppsummert i tabell 2. GlyRS og PheRS består av to underenheter av ulike molekylvekter; De resterende 34 proteinene består av en enkelt underenhet. Nøkkelen til denne protokollens enkelhet og tidseffektivitet er trinnet for kokulturering og korensing (figur 2). OnePot-proteinløsningen ble utarbeidet ved å øke forholdet mellom EF-Tu-stammen med hensyn til alle de andre uttrykksstammene. Den totale sammensetningen av de endelige proteinene ble analysert av SDS-PAGE (Figur 3A). Fra gelene (baner 2, 3) er det merkbart at EF-Tu (43,3 kDa) er tilstede i en høyere konsentrasjon sammenlignet med de andre proteinene, som forventet. Mens gelen gir en god første indikasjon på proteinuttrykksforhold, er det vanskelig å avgjøre om og på hvilket nivå hvert enkelt protein ble uttrykt. Derfor anbefales det på det sterkeste å bekrefte overekspressjonen i hver stamme før kokulturering, som vist ovenfor.
E. coli ribosomet er en kompleks molekylær maskin som består av over 50 individuelle proteinunderenheter23. Et representativt absorpsjonsspekter ved 260 nm for tag-fri ribosomrensing er vist i figur 4; Den tredje toppen er karakteristisk for vellykket ribosom elution. For begge ribosomrensingsmetodene ble det forventede løpemønsteret på SDS-PAGE gel (figur 3A)18 observert. Vi observerte forurensninger for begge rensingene, om enn i små mengder (<10%). Spesielt var forskjellige forurensninger til stede i tag-free (baner 5, 6) og His-tagget (baner 11, 12) ribosomer på grunn av variasjonen i metoden. For brukerreferanse er SDS-PAGE gels for de kombinerte systemene også inkludert (bane 8, 9 og 14, 15).
Til slutt sammenlignes ytelsen til de forberedte systemene (figur 3) ved hjelp av de forskjellige ribosomvariantene. Tidsforløpene for in vitro eGFP-uttrykk viser at begge PURE-systemene er funksjonelle og produserer fluorescerende eGFP. Imidlertid ga OnePot-proteinløsningen kombinert med his-taggede ribosomer, ved hjelp av ribosomekonsentrasjonen optimalisert ved titrering, bare en tredjedel av uttrykksnivået til den ikke-taggede ribosomversjonen (Figur 3B). Lignende resultater ble observert når tre proteiner av forskjellige størrelser ble uttrykt og merket ved hjelp av Green Lys tRNA in vitro merkingssystem (Figur 3C). Som sett på fluorescerende gel, ble produkter i full lengde vellykket uttrykt i begge systemene; Imidlertid ble bare rundt halvparten av uttrykksnivået oppnådd med His-tag ribosome-systemet. I tillegg til fluorescensmerkingen skiller de forventede båndene for alle tre proteinene seg på en Coomassie-farget gel (Figur 3D). Resultatene viser at det introduserte uttrykkssystemet, som kan utarbeides innen en uke i et laboratorium med standardutstyr, kan brukes til in vitro-uttrykket av proteiner kodet nedstrøms for T7-promotoren fra lineære maler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Figur 1: Representative resultater for overekspressjonstesten for alle uttrykksstammer i PURE-systemet. PURE-proteintall og -størrelser er oppsummert i tabell 2. Proteintallene 21, 24 og 27 er merket med en stjerne for bedre visualisering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Figur 2: OnePot proteinrensing. Den skjematiske skildringen og tilsvarende fotografier av alle trinn som er involvert i produksjonen av OnePot-proteinløsningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Figur 3: Ytelsen til de klargjorte systemene ved hjelp av de forskjellige ribosolevariantene. (A) Coomassie blåfargede SDS-PAGE geler av OnePot proteinoppløsning (baner 2, 3), tagfrie ribosomer uten proteinoppløsning (baner 5, 6) og med proteinoppløsning (baner 8, 9), Hans taggede ribosomer uten proteinoppløsning (baner 11, 12) og med proteinløsning (baner 14, 15). To forskjellige konsentrasjoner ble lastet per prøve. (B) Sammenligning av eGFP-uttrykk for hans taggede ribosomer og tagfrie ribosomer. Fluorescensintensiteten til in vitro eGFP-uttrykket overvåkes over tid for en PURE-reaksjon ved hjelp av tagfrie ribosomer (1,8 μM, blå) og hansmerkede ribosomer (0,62 μM, rød). Konsentrasjonene av den lineære malen og OnePot proteinoppløsningen var henholdsvis 4 nM og 2 mg/ml. Paneler (C) og (D) viser SDS-PAGE gel av proteiner syntetisert i OnePot med tag-free (1,8 μM, blå, baner 3, 4, 5) og His-tag ribosomer (0,62 μM, rød, baner 6, 7, 8) merket med et GreenLys in vitro-merkingssett (C) og farget med Coomassie blå (D), henholdsvis. De svarte pilene indikerer de forventede båndene av syntetiserte proteiner: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Den lineære malen og OnePot proteinoppløsningskonsentrasjonene var henholdsvis 4 nM og 1,6 mg/ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Figur 4: Absorbansspektra ved 260 nm. Representative resultater av absorbansspektra ved 260 nm under hydrofob interaksjonsrensing av tagfrie ribosomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: En daglig tidsoptimalisert tidsplan for utarbeidelse av alle OnePot PURE-løsningene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 2: PURE protein liste <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tabell 1: Reagenser. Tabellen viser konsentrasjoner, volumer og andre spesifikke detaljer om reagensene og komponentene som ble brukt i denne studien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tabell 2: Buffere. Regnearket viser de nøyaktige buffersammensetningene for protein, tagfritt ribosot og His-tag ribosomrensing, samt konsentrasjonene av lagerløsningene som brukes til forberedelsen. I tillegg beregner den de nødvendige mengdene komponenter basert på buffervolumet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tabell 3: Aminosyreberegninger. Regnearket viser aminosyrene og deres anbefalte lagerløsningskonsentrasjoner som kreves for energiløsningen. Den beregner mengden vann som skal tilsettes hver aminosyre basert på den faktiske veide massen, og beregner også volumet av aminosyreoppløsningen som skal legges til den endelige aminosyreblandingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tabell 4: Lagerløsninger for energiløsningen. Tabellen viser konsentrasjonene og volumene av lagerløsninger som trengs for energiløsningen og indikerer ytterligere detaljer, inkludert lagringsforhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tabell 5: Energiløsning. Tabellen viser energiløsningskomponentene og deres anbefalte konsentrasjoner. I tillegg beregner den de nødvendige volumene som skal legges til den endelige løsningen basert på deres lagerløsningskonsentrasjoner og volumet av energiløsningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tabell 6: PCR. Tabellen viser sekvenser og konsentrasjoner av primerne som brukes for utvidelsen PCR og indikerer smeltetemperaturer og termosycler trinn optimalisert for en høy-troskap DNA polymerase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tabell 7: PURE reaksjon. Regnearket viser et eksempeloppsett av en PURE-reaksjon. Den viser de brukte konsentrasjonene og volumene til komponentene for en PURE-reaksjon ved hjelp av tagfrie ribosomer eller His-tag ribosomer. Videre beregner den volumforholdene for protein- og ribosomtitreringer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

OnePot PURE Cell-Free System

Vi presenterer en rask og kostnadseffektiv metode for å produsere det rekombinante PURE cellefrie TX-TL-systemet ved hjelp av standard laboratorieutstyr.

OnePot PURE cellefritt system

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Denne protokollen for et rekombinant cellefritt proteinuttrykkssystem, kjent som PURE-systemet, bruker cellekultur og cellerensing for å effektivisere de nødvendige proteinrensingene. Dette minimerer tids- og arbeidskravene betydelig. OnePot-metoden har vist seg å være ikke bare kostnadseffektiv, men også tidseffektiv.Det reduserer forberedelsestidene fra flere uker til tre arbeidsdager. Dette gjør PURE cellefri plattform tilgjengelig for flere laboratorier over hele verden og bidrar til å implementere denne virkelig kraftige plattformen for syntetisk cellefri biologi. Før du begynner, sørg for at alle stammer over uttrykker sitt respektive protein godt.Til å begynne med, forbered kolonnen for OnePot proteinrensing som beskrevet i tekstmanuskriptet ved hjelp av to milliliter Sepharose-harpiks, og lad deretter kolonnen med nikkelsulfat. Forbered startkulturene ved å kombinere 20 milliliter LB-medier med 20 mikroliter ampicillin. Tilsett 300 mikroliter av mediet i 35 brønner med en steril 96 dyp brønnplate.Inokuler hver av dem med sin respektive stamme, unntatt forlengelsesfaktor termo ustabil, eller EFTU, og forsegle platen med en pustende membran. For EFTU-kulturen inokulerer tre milliliter ampicillin som inneholder LB-medier i et 14 milliliter kulturrør med en snap cap. Omtrent tre milliliter EFTU-kultur er tilstrekkelig for en OnePot-uttrykkskultur.Inkuber den ved 37 grader Celsius mens du rister på 260 rotasjoner per minutt over natten. Neste dag overfører du 500 milliliter LB-medier og 500 mikroliter ampicillin til den sterile, forvirrede kolben. Inokuler OnePot PURE-kulturen med 1675 mikrolitere av EFTU-kulturen og 55 mikrolitere av hver av kulturene fra den dype brønnplaten.Inkuber kulturen i to timer ved 37 grader Celsius med en risting på 260 rotasjoner per minutt, eller til kulturens optiske tetthet når 0,2 til 0,3. Induser kulturen med 500 mikroliter 0,1 millimolar IPTG og vokse i ytterligere tre timer. Høst cellene ved sentrifugering ved fire grader Celsius og 3220 ganger G i 10 minutter, og lagre cellepellet på minus 80 grader Celsius til videre bruk.På dag tre måler du mengden buffere som trengs for rensingen, og legger til TCEP i dem alle som angitt i teksten. Lagre de resterende bufferne uten TCEP ved fire grader Celsius for fremtidige rensinger. Likevekt den ladede kolonnen med 30 milliliter buffer A.Etter at 25 milliliter buffer A har passert, lukker du kolonnen fra bunnen.Tine cellene og bruk en serologisk pipette for å resuspendere cellepellet i 7,5 milliliter buffer A.Lyse cellene ved hjelp av en 130 watt sonde. Hvis sonikeringen er vellykket, blir løsningen mørkere. Sørg for å holde cellene på is og plasser sonden dypt nok uten å berøre røret.Fjern cellerester ved sentrifugering ved 21,130 ganger G i 20 minutter ved fire grader Celsius og hold lysatet på is. Legg til supernatanten i kolonnen med likevekt. Lukk kolonnen fra toppen og sørg for at det ikke er noen lekkasje.Inkuber kolonnen i tre timer ved fire grader Celsius under rotasjon ved hjelp av en rørrotator. Elute ubundne komponenter fra kolonnen og vask med 25 milliliter buffer A.Vask kolonnen med 25 milliliter 25 millimolar imidazolbuffer. Elute proteiner med fem milliliter av 450 millimolar imidazol buffer og holde de eluted proteiner på is til enhver tid.Fortynn eluatet med 25 milliliter HT-buffer og hold blandingen på is. Tilsett 15 milliliter til et 15 milliliter sentrifugalfilter og konsentrer deg til et volum på 1,5 milliliter. Tilsett de resterende 15 milliliterene i filteret med den konsentrerte løsningen og konsentrer deg til 1,5 milliliter igjen.Tilsett 10 milliliter HT-buffer i den konsentrerte prøven og konsentrer deg til en milliliter. Gjenopprett den konsentrerte prøven og legg til en lik mengde lagerbuffer B og lagre på minus 80 grader Celsius til videre bruk. Under bufferutvekslingen gjenoppretter du kolonnen som angitt i teksten.På dag fire måler du proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen. Konsentrer prøven med 0,5 milliliter tre kilodalton cutoff sentrifugalfilter til 20 milligram per milliliter. Kontroller OnePot PURE proteinsammensetningen ved hjelp av SDS-siden.Fortynn 2,5 mikroliter av prøven med 7,5 mikroliter vann blandet med 10 mikroliter av to X Laemmli-buffere, og last deretter fem mikroliter og 2,5 mikroliter av prøvene på gelen. Kjør SDS-siden som angitt i teksten. Fyll ut konsentrasjonen og lengden på DNA-et i de tilsvarende gule cellene i regnearket ved hjelp av to til ti nanomolar AV DNA for reaksjonen.Fyll ut ønsket totalreaksjonsvolum i mikroliter. Fjern de nødvendige reagensene fra fryseren og tine dem på is. Rør deretter de beregnede mengdene vann, DNA og energiløsning til den ene siden av PCR-røret eller et hjørne av en brønn på 384 brønnplaten.Pipette de beregnede mengdene protein og ribosomløsning til den andre siden av et PCR-rør eller motsatt hjørne av 384-brønnplaten. Spinn i ca. 30 sekunder for å slå sammen reaksjonskomponentene. For å forhindre fordampning under platelesereksperimenter, tilsett 35 mikroliter flytende voks, og forsegle platen med et gjennomsiktig tetningsmiddel.Inkuber i minst tre timer ved 37 grader Celsius. For avlesning på en plateleser, mål florescensintensiteten ved ønsket bølgelengde hvert annet minutt. Vellykket over uttrykk i alle individuelle stammer som brukes senere for OnePot proteinpreparat er vist her.Den samlede sammensetningen av den endelige OnePot PURE proteinløsningen ble analysert av SDS-siden. Det er merkbart at EFTU er til stede i en høyere konsentrasjon sammenlignet med de andre proteinene, som forventet. Synteseutbyttet av OnePot-proteinløsningen kombinert med his-taggede eller ikke-taggede ribosomer ble analysert ved å overvåke eGFP-fluorescensen over tid.Uttrykksnivåene til tre forskjellige proteiner merket med den grønne listen tRNA in vitro merkingssystem, eller Kumasi-farging, ble analysert på en SDS-sidegel. For et funksjonelt PURE-system er det helt avgjørende at alle stammer uttrykker sine respektive proteiner godt. Denne teknikken letter implementeringen av PURE-systemet til biologisk systemteknikk, noe som muliggjør utvikling av nye genetiske nettverk, molekylær diagnostikk, terapeutiske og pedagogiske sett.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; Identification hjelp elektrokjemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Lukkbar Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese av smittsomme Bacteriophages i en E. coli -basert Cell-free uttrykk System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital risting kultur pattedyrceller i O-formet fartøy å produsere Uniform aggregater

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellen gratis Protein uttrykk ved hjelp av den raskt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En flerlags Mikrovæskebasert plattform for gjennomføring av langvarig Cell-gratis Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forbereder proteinproduserende syntetiske celler ved hjelp av cellefrie bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsjonsoverføring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Måling av 3D In-vivo skulderkinematikk ved hjelp av biplanet videoradiografi

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Raske, enzymatiske metoder for forsterkning av minimale, lineære maler for proteinprototyping ved hjelp av cellefrie systemer

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...