Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa sob o Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia, Grant 723106, uma Bolsa da Fundação Nacional de Ciência suíça (182019) e a EPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo aqui apresentado descreve um método simples, de tempo e econômico para preparar um versátil sistema de expressão PURA20 com base na composição padrão15. Utilizando o protocolo juntamente com os horários diários fornecidos(Tabela 1),todos os componentes podem ser preparados em 1 semana e valores de rendimento suficientes para até quinhentos 10 μL DE reações PURAs. Uma vez que as proteínas utilizadas neste protocolo são superexpressas de plasmídeos de cópia alta e têm baixa toxicidade para E. coli,bons níveis de expressão são observados para todas as proteínas necessárias(Figura 1). Isso permite o fácil ajuste das cepas e, portanto, também a composição proteica em coculturas, simplesmente modificando as proporções das cepas de inoculação20. Além das proteínas ribossômicas, a concentração de EF-Tu mostrou-se de fundamental importância para a expressão6. Em contrapartida, as mudanças na concentração dos outros componentes proteicos tiveram um impacto relativamente baixo na robustez do sistema PURE7,24. Portanto, ajustando a razão de inoculação do EF-Tu em relação a todos os outros componentes, uma composição comparável à composição PURE padrão pode ser alcançada, e um sistema PURE com rendimento semelhante20 pode ser alcançado. No preparo da solução proteica, é fundamental garantir que todas as cepas cresçam bem e expressem demais a proteína codificada após a indução(Figura 1).
A função ribosso é fundamental para o desempenho geral do sistema PURE24. Neste protocolo, dois métodos diferentes para preparar a solução ribossosome são demonstrados, ou seja, purificação ribossoma sem etiqueta e sua marca. A purificação ribossoma sem tag é baseada na cromatografia de interação hidrofóbica seguida de centrifugação com uma almofada de sacarose, que requer acesso a um sistema de purificação FPLC e um ultracentrifuge15. Em contrapartida, o método utilizando ribossomos18 e purificação de cromatografia de afinidade de fluxo gravitacional não requer equipamento especializado e pode ser realizado na maioria dos laboratórios. Este último método, portanto, traz vantagens como simplicidade e acessibilidade. No entanto, observamos um rendimento de síntese significativamente menor ao usar os ribossomos marcados por Sua no OnePot PURE em comparação com a variante sem tag(Figura 3). Com base no tipo de aplicação, esse rendimento mais baixo pode ser aceitável.
A solução de energia fornece os componentes de baixo peso molecular e tRNAs necessários para alimentar reações in vitro TX-TL. Este protocolo fornece uma receita para uma solução energética típica, que pode ser facilmente ajustada com base nas necessidades do usuário. Juntamente com o tRNA, NTP e fosfato de creatina, a abundância e concentração de íons Mg2+ têm sido cruciais para o desempenho geral do sistema PURE8,pois são cofatores críticos para transcrição e tradução. Em alguns casos, a titulação de íons pode, portanto, melhorar muito o desempenho geral do PURE. A integridade do DNA é crucial para o desempenho puro. Assim, a sequência verificando a região do promotor, o local de ligação ribossomo e o gene alvo e garantindo que uma concentração de DNA adequada (<2 nM) ajudará a solucionar problemas que podem surgir ao configurar uma reação PURA.
O sistema PURE é um sistema TX-TL mínimo, e aplicações específicas podem, portanto, exigir ajustes adicionais25. Estes podem incluir a incorporação de diferentes polímerases de RNA9,26, acompanhantes13e fatores proteicos como EF-P ou ArfA8. Embora as cepas de expressão para essas proteínas possam ser incluídas nas coculturas, adicioná-las separadamente ao sistema preparado pode fornecer um melhor controle dos níveis de proteína necessários. Além disso, a inclusão de vesículas é essencial para a produção de proteínas de membrana10,11. Oxidar ao invés de reduzir ambientes e uma isomerase de ligação dissulfeto facilitam a formação adequada de vínculos de dissulfeto, que são, por exemplo, necessárias para proteínas secretas12.
É essencial garantir que quaisquer componentes adicionais não interfiram na reação. Os fatores mais importantes a serem atentos ao configurar uma reação ou adicionar outros componentes estão listados abaixo. Certifique-se de que nem buffers incompatíveis sejam usados nem as concentrações de íons sejam perturbadas. Evite soluções que contenham glicerol, altas concentrações de potássio, magnésio, íons de cálcio, osmólises, pirofosfato, antibióticos ou EDTA, tanto quanto possível. Por exemplo, substituir um tampão de elução por água durante a purificação do DNA pode ser benéfico, pois o EDTA é um aditivo comum neste buffer. Fornecer as soluções com moléculas adicionais com pressão negativa, como NTP ou dNTP, requer o ajuste da concentração de magnésio8,pois as moléculas carregadas negativamente se comportam como agentes queradores e ligam moléculas positivamente carregadas. Um pH neutro é ideal para a reação. Assim, todos os componentes devem ser tamponados para o pH correspondente; isso é especialmente importante para moléculas altamente ácidas ou básicas, como NTPs. Por fim, temperatura e volume são parâmetros-chave para a reação. Para obter um bom rendimento, deve-se implementar uma temperatura em torno de 37 °C, pois temperaturas abaixo de 34 °C reduzirão significativamente o rendimentoem 27.
É relevante notar que antes de preparar o OnePot PURE, deve-se considerar o aplicativo-alvo e os requisitos associados, como volume, pureza, facilidade de modificação e inclusão ou omissão de componentes. Para muitos aplicativos, o sistema será uma excelente escolha, mas outros podem exigir rendimentos, ajustabilidade e outros fatores, que o sistema OnePot não pode fornecer. Independentemente disso, o protocolo introduzido será benéfico para a elaboração de qualquer sistema caseiro, uma vez que todas as etapas críticas para tal preparação são resumidas aqui.
Uma das principais vantagens do sistema OnePot é sua compatibilidade com o sistema PURExpress comercialmente disponível, que oferece a possibilidade de testar a funcionalidade e a integridade de todos os componentes separadamente, substituindo sequencialmente cada componente PURExpress pelo seu equivalente OnePot. As vantagens do sistema OnePot PURE, como a sintonia e preparação fácil, rápida e econômica, tornarão o TX-TL livre de células acessível a mais laboratórios em todo o mundo e contribuirão para a expansão da implementação desta poderosa plataforma em biologia sintética livre de células.

Os sistemas de tradução de transcrição sem células (TX-TL) constituem uma plataforma promissora para investigar e engenharia de sistemas biológicos. Eles fornecem condições de reação simplificadas e incapazes, pois não dependem mais de processos de sustentação da vida, incluindo crescimento, homeostase ou mecanismos regulatórios1. Assim, prevê-se que sistemas livres de células contribuam para a investigação de sistemas biomoleculares, ofereçam uma estrutura para testar estratégias racionais de biodesign2, e forneçam um chassi para uma futura célula sintética3,4. O sistema PURE totalmente recombinante oferece um chassi especialmente atraente devido à sua composição definida e mínima, bem como sua ajustabilidade e capacidade de sintonia5.
Desde que o primeiro sistema PURE funcional e totalmente recombinante foi criado em 20015, esforços foram feitos para expandir os limites do sistema e otimizar a composição do sistema para melhorar a produção do sistema6,7,8, permitir a regulação transcricional9,membrana10,11 e síntese de proteínas secretas12, e facilitar a dobra de proteína13,14 . Atualmente, existem três sistemas disponíveis comercialmente: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) e Magic PURE (Creative Biolabs). No entanto, esses sistemas são caros, sua composição exata é proprietária e, portanto, desconhecida, e a adaptabilidade é limitada.
Os sistemas PURE preparados internamente provaram ser a opção mais econômica e inuspecível15,16. No entanto, os 37 passos necessários de purificação para proteínas e frações ribossósmos são demorados e tediosos. Várias tentativas foram feitas para melhorar a eficiência da preparação do sistema PURE17,18,19. Recentemente demonstramos que é possível cocultura e co-purificar todas as proteínas não ribossômicas necessárias presentes no sistema PURE. Este método OnePot provou ser econômico e com eficiência de tempo, reduzindo o tempo de preparação de várias semanas para 3 dias úteis. A abordagem gera um sistema PURE com capacidade de produção de proteínas comparável ao sistema PURExpress20disponível comercialmente . Ao contrário das abordagens anteriores para simplificar a preparação pura17,18,19, na abordagem OnePot todas as proteínas ainda são expressas em cepas separadas. Isso permite que o usuário sintonize a composição do sistema OnePot PURE, apenas omitindo ou adicionando cepas específicas ou ajustando os volumes de inoculação, gerando assim sistemas PURE de abandono ou alterando as relações de proteína final, respectivamente.
O protocolo aqui apresentado fornece um método detalhado para a criação do sistema OnePot PURE, como descrito anteriormente20, embora β-mercaptoetanol tenha sido substituído por tris(2-carboxyethyl)fospfina (TCEP). Além disso, dois métodos de purificação ribossosome são descritos: purificação ribossosome tradicional sem tag usando interação hidrofóbica e almofada de sacarose, adaptada de Shimizu et al.15, e purificação ribossoma Ni-NTA baseada em Wang et al.18 e Ederth et al.21, mas significativamente modificada. Este último método facilita ainda a elaboração do sistema PURE e o torna acessível a mais laboratórios, pois apenas equipamentos de laboratório padrão são necessários.
O protocolo experimental resume a preparação de um versátil sistema TX-TL sem células PURA para fornecer uma plataforma simples, tgêneo e econômica sem células, que pode ser preparada usando equipamentos de laboratório padrão dentro de uma semana. Além de introduzir a composição padrão PURE, indicamos como e onde ela pode ser ajustada, com foco principal em etapas críticas no protocolo para garantir a funcionalidade do sistema.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

O sistema de transcrição pure (síntese proteica definida usando elementos recombinantes) fornece um chassi atraente para biologia sintética livre de células. Infelizmente, os sistemas disponíveis comercialmente são caros, e sua sintonia é limitada. Em comparação, uma abordagem caseira pode ser personalizada com base nas necessidades do usuário. No entanto, a preparação de sistemas caseiros é demorada e árdua devido à necessidade de ribossomos, bem como 36 purificações proteicas de média escala. Simplificar a purificação de proteínas por coculturação e co-purificação permite minimizar os requisitos de tempo e trabalho. Aqui, apresentamos um método fácil, ajustável, de tempo e econômico para produzir todos os componentes do sistema PURE dentro de 1 semana, utilizando equipamentos de laboratório padrão. Além disso, o desempenho do OnePot PURE é comparável aos sistemas disponíveis comercialmente. O método de preparação OnePot PURE expande a acessibilidade do sistema PURE para mais laboratórios devido à sua simplicidade e custo-benefício.

O protocolo acima foi projetado para facilitar o estabelecimento do sistema TX-TL sem células PURA em qualquer laboratório. O protocolo inclui uma descrição detalhada da preparação das três partes distintas do sistema PURE: a proteína OnePot, ribossomo e solução energética. Um cronograma diário detalhado, que otimiza o fluxo de trabalho, é mostrado na Tabela 1. O fluxo de trabalho é otimizado para a purificação de ribossomos marcados por Sua, e os períodos de tempo podem diferir ligeiramente se a purificação ribossomo sem tag for realizada. Uma preparação fornece uma quantidade suficiente de PURO para um mínimo de 500 10 μL reações. Além disso, as soluções preparadas são estáveis por mais de um ano a -80 °C e podem suportar múltiplos ciclos de congelamento.
Níveis adequados de superexpressão para todas as cepas são cruciais para a funcionalidade da solução final de proteína. A Figura 1 mostra uma superexpressão bem sucedida em todas as 36 cepas individuais usadas posteriormente para a preparação da proteína OnePot. A variação das intensidades da banda de proteínas super expressas ocorreu provavelmente devido a um viés no volume de carregamento do gel SDS-PAGE. Os tamanhos de proteína esperados são resumidos na Tabela 2. GlyRS e PheRS consistem em duas subunidades de vários pesos moleculares; as 34 proteínas restantes consistem em uma única subunidade. A chave para a simplicidade e eficácia do tempo deste protocolo é a etapa de cocultura e co-purificação(Figura 2). A solução proteica OnePot foi preparada aumentando a proporção de cepa EF-Tu em relação a todas as outras cepas de expressão. A composição geral das proteínas finais foi analisada pela SDS-PAGE (Figura 3A). Dos géis (faixas 2, 3), é perceptível que o EF-Tu (43,3 kDa) está presente em maior concentração em relação às outras proteínas, como esperado. Embora o gel forneça uma boa primeira indicação das relações de expressão proteica, é difícil determinar se e em que nível cada proteína individual foi expressa. Portanto, é altamente recomendável confirmar a superexpressão em cada cepa antes de coculpe, como mostrado acima.
O E. coli ribosome é uma máquina molecular complexa composta por mais de 50 subunidades proteicas individuais23. Um espectro de absorção representativo a 260 nm para purificação ribossópica sem tag é mostrado na Figura 4; o terceiro pico é característico de eluição ribossópica bem sucedida. Para ambos os métodos de purificação ribossomos, observou-se o padrão de execução esperado no gel SDS-PAGE(Figura 3A)18. Observamos contaminações para ambas as purificações, embora em pequenas quantidades (<10%). Notavelmente, diferentes contaminantes estavam presentes nos ribossomos livres de etiquetas (faixas 5, 6) e sua marcada (faixas 11, 12) ribossomos devido à variação do método. Para referência ao usuário, os géis SDS-PAGE para os sistemas combinados também estão incluídos (faixas 8, 9 e 14, 15).
Por fim, o desempenho dos sistemas preparados(Figura 3)utilizando as diferentes variantes ribossomos são comparados. Os cursos de tempo de expressão in vitro eGFP mostram que ambos os sistemas PURE são funcionais e produzem eGFP fluorescentes. No entanto, a solução proteica OnePot combinada com os ribossomos sua marcada, usando a concentração ribossosome otimizada pela titulação, rendeu apenas um terço do nível de expressão da versão ribossomo não marcada(Figura 3B). Resultados semelhantes foram observados quando três proteínas de diferentes tamanhos foram expressas e rotuladas utilizando-se o sistema de rotulagem in vitro Green Lys tRNA(Figura 3C). Como visto no gel fluorescente, os produtos de comprimento completo foram expressos com sucesso em ambos os sistemas; no entanto, apenas cerca de metade do nível de expressão foi alcançado com o sistema ribossomo His-tag. Além da rotulagem de fluorescência, as bandas esperadas para as três proteínas são distinguíveis em um gel coomassie -manchado(Figura 3D). Os resultados mostram que o sistema de expressão introduzido, que pode ser preparado dentro de uma semana em um laboratório com equipamento padrão, pode ser usado para a expressão in vitro de proteínas codificadas a jusante do promotor T7 a partir de modelos lineares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Figura 1: Resultados representativos para o teste de superexpressão para todas as cepas de expressão do sistema PURE. Os números e tamanhos de proteínas puras são resumidos na Tabela 2. Os números de proteínas 21, 24 e 27 são marcados com uma estrela para melhor visualização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Figura 2: Purificação de proteínas OnePot. A representação esquemática e fotografias correspondentes de todas as etapas envolvidas na produção da solução proteica OnePot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Figura 3: Desempenho dos sistemas preparados utilizando as diferentes variantes ribossomos. (A) Géis SDS-PAGE manchados de azul Coomassie da solução de proteína OnePot (faixas 2, 3), ribossomos sem etiqueta sem solução proteica (pistas 5, 6) e com solução proteica (pistas 8, 9), ribossomos sua marcado sem solução proteica (pistas 11, 12) e com solução proteica (pistas 14, 15). Duas concentrações diferentes foram carregadas por amostra. (B) Comparação da expressão eGFP de ribossomos marcados e ribossomos sem etiqueta. A intensidade de fluorescência da expressão eGFP in vitro é monitorada ao longo do tempo para uma reação PURA usando ribossomos sem tag (1,8 μM, azul) e ribossomos marcados (0,62 μM, vermelho). As concentrações do modelo linear e da solução proteica OnePot foram de 4 nM e 2 mg/mL, respectivamente. Os painéis (C) e(D) mostram o gel SDS-PAGE de proteínas sintetizadas no OnePot com tag-free (1,8 μM, azul, faixas 3, 4, 5) e ribossomos (0,62 μM, vermelho, faixas 6, 7, 8) rotulados com um kit de rotulagem in vitro GreenLys(C) e manchado com azul Coomassie(D),respectivamente. As setas pretas indicam as faixas esperadas de proteínas sintetizadas: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). O modelo linear e as concentrações de solução proteica OnePot foram de 4 nM e 1,6 mg/mL, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Figura 4: Espectro de absorvância a 260 nm. Resultados representativos de espectros de absorção a 260 nm durante a purificação da interação hidrofóbica de ribossomos livres de etiquetas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Um cronograma otimizado de tempo diário para a preparação de todas as soluções OnePot PURE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 2: Lista de proteínas PURA <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela suplementar 1: Reagentes. A tabela lista concentrações, volumes e outros detalhes específicos dos reagentes e componentes utilizados durante este estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela suplementar 2: Tampões. A planilha lista as composições exatas de tampão para proteínas, ribossomos sem etiqueta e purificações ribossomos his-tag, bem como as concentrações das soluções de estoque usadas para sua preparação. Além disso, calcula as quantidades necessárias de componentes com base no volume do buffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela complementar 3: Cálculos de aminoácidos. A planilha lista os aminoácidos e suas concentrações recomendadas de solução de estoque necessárias para a solução energética. Ele calcula a quantidade de água a ser adicionada a cada aminoácido com base na massa real ponderada, e também calcula o volume da solução de aminoácido a ser adicionada à mistura final de aminoácidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela Suplementar 4: Soluções de estoque para a solução energética. A tabela lista as concentrações e volumes de soluções de estoque necessárias para a solução de energia e indica mais detalhes, incluindo condições de armazenamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela Suplementar 5: Solução energética. A tabela lista os componentes da solução energética e suas concentrações recomendadas. Além disso, calcula seus volumes necessários a serem adicionados à solução final com base em suas concentrações de solução de estoque e no volume da solução energética. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela Suplementar 6: PCR. A tabela lista sequências e concentrações dos primers usados para a extensão PCR e indica temperaturas de fusão e passos termocicros otimizados para uma polimerase de DNA de alta fidelidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela suplementar 7: reação PURA. A planilha mostra uma configuração de exemplo de uma reação PURE. Ele lista as concentrações e volumes usados dos componentes para uma reação PURE usando ribossomos sem marca ou ribossomos his-tag. Além disso, calcula as relações de volume para proteínas e titulações ribossóis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

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OnePot PURE Cell-Free System

Apresentamos um método rápido e econômico para produzir o sistema TX-TL sem células PURE recombinante usando equipamentos de laboratório padrão.

Sistema sem células OnePot PURE

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Este protocolo para um sistema de expressão proteica livre de células recombinantes, comumente conhecido como sistema PURE, utiliza a cultura celular e a purificação celular para agilizar as purificações proteicas necessárias. Isso minimiza significativamente os requisitos de tempo e trabalho. O método OnePot provou ser não apenas econômico, mas também eficiente no tempo.Reduz o tempo de preparação de várias semanas para três dias úteis. Isso torna a plataforma sem células PURE acessível a mais laboratórios em todo o mundo e ajuda a implementar essa plataforma realmente poderosa para biologia livre de células sintéticas. Antes de começar, certifique-se de que todas as cepas expressam bem suas respectivas proteínas.Para começar, prepare a coluna para a purificação de proteínas OnePot, conforme descrito no manuscrito do texto usando dois mililitros de resina sepharose, e, em seguida, carregue a coluna com sulfato de níquel. Prepare as culturas iniciais combinando 20 mililitros de mídia LB com 20 microliters de ampicilina. Adicione 300 microliters da mídia em 35 poços de uma placa de poço estéril de 96.Inocular cada um deles com sua respectiva cepa, exceto fator de alongamento termo instável, ou EFTU, e selar a placa com uma membrana respirável. Para a cultura EFTU, inocularei três mililitros de ampicillina contendo mídia LB em um tubo de cultura de 14 mililitros com uma tampa de estalo. Cerca de três mililitros da cultura EFTU são suficientes para uma cultura de expressão OnePot.Incuba-o a 37 graus Celsius enquanto treme a 260 rotações por minuto durante a noite. No dia seguinte, transfira 500 mililitros de mídia LB e 500 microliters de ampicilina para o frasco estéril perplexo. Inocular a cultura OnePot PURE com 1.675 microliters da cultura EFTU e 55 microliters de cada uma das culturas do prato do poço profundo.Incubar a cultura por duas horas a 37 graus Celsius com um tremor de 260 rotações por minuto, ou até que a densidade óptica da cultura atinja 0,2 a 0,3. Induzir a cultura com 500 microlitres de 0,1 milimólar IPTG e crescer por mais três horas. Colher as células por centrifugação a quatro graus Celsius e 3.220 vezes G por 10 minutos, e armazenar a pelota de célula a menos 80 graus Celsius até uso posterior.No terceiro dia, meça as quantidades de buffers necessários para sua purificação e adicione TCEP a todos eles conforme indicado no texto. Armazene os buffers restantes sem TCEP a quatro graus Celsius para futuras purificações. Equilibre a coluna carregada com 30 mililitros de buffer A.Depois que 25 mililitros de buffer A tiver passado, feche a coluna a partir da parte inferior.Descongele as células e use uma pipeta sorológica para resuspensar a pelota celular em 7,5 mililitros de tampão A.Lyse as células usando uma sonda de 130 watts. Se a sônica for bem sucedida, a solução ficará mais escura. Certifique-se de manter as células no gelo e colocar a sonda profunda o suficiente sem tocar no tubo.Remova os detritos celulares por centrifugação a 21, 130 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius e mantenha o lysate no gelo. Adicione o supernatante à coluna equilibrada. Feche a coluna do topo e certifique-se de que não há vazamento.Incubar a coluna por três horas a quatro graus Celsius em rotação usando um rotador de tubo. Elute desvincula componentes da coluna e lave com 25 mililitros de tampão A.Lave a coluna com 25 mililitros de 25 mililitros de tampão imidazol. Elute as proteínas com cinco mililitros de 450 milimidazol tampão e mantenha as proteínas elucidadas no gelo o tempo todo.Diluir o elunato com 25 mililitros de tampão HT e manter a mistura no gelo. Adicione 15 mililitros a um filtro centrífugo de 15 mililitros e concentre-se em um volume de 1,5 mililitros. Adicione os 15 mililitros restantes ao filtro com a solução concentrada e concentre-se em 1,5 mililitros mais uma vez.Adicione 10 mililitros de tampão HT à amostra concentrada e concentre-se em um mililitro. Recupere a amostra concentrada e adicione uma quantidade igual de tampão de estoque B e armazene a menos 80 graus Celsius até que seja usado. Durante a troca de buffer, restaure a coluna conforme especificado no texto.No quarto dia, meça a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford. Concentre a amostra com 0,5 mililitros de três kilodalton cortar filtro centrífugo a 20 miligramas por mililitro. Verifique a composição proteica OnePot PURE usando a página SDS.Diluir 2,5 microliters da amostra com 7,5 microliters de água misturados com 10 microliters de dois tampão X Laemmli, e então carregar cinco microlitres e 2,5 microlitres das amostras no gel. Execute a página SDS conforme especificado no texto. Preencha a concentração e o comprimento do DNA nas células amarelas correspondentes na planilha usando de 2 a 10 nanomolar de DNA para a reação.Preencha o volume total de reação desejado em microliters. Retire os reagentes necessários do congelador e descongele-os no gelo. Em seguida, pipeta as quantidades calculadas de água, DNA e solução de energia para um lado do tubo PCR ou um canto de um poço na placa 384.Pipeta as quantidades calculadas de proteína e solução ribossosome para o outro lado de um tubo PCR ou o canto oposto da placa 384. Gire por cerca de 30 segundos para mesclar os componentes de reação. Para evitar a evaporação durante os experimentos do leitor de placas, adicione 35 microliters de cera líquida e sele a placa com um selante transparente.Incubar por um mínimo de três horas a 37 graus Celsius. Para leitura em um leitor de placas, meça a intensidade de floresnce no comprimento de onda necessário a cada dois minutos. O sucesso sobre a expressão em todas as cepas individuais usadas posteriormente para a preparação da proteína OnePot é mostrado aqui.A composição geral da última solução de proteína OnePot PURE foi analisada pela página da SDS. É perceptível que o EFTU está presente em uma maior concentração em comparação com as outras proteínas, como esperado. Os rendimentos da síntese da solução proteica OnePot combinada com os ribossomos não marcados ou não marcados foram analisados pelo monitoramento da fluorescência eGFP ao longo do tempo.Os níveis de expressão de três proteínas diferentes rotuladas usando o sistema de rotulagem in vitro tRNA da lista verde, ou mancha kumasi, foram analisados em um gel de página SDS. Para um sistema PURE funcional, é absolutamente crítico que todas as cepas expressem bem suas respectivas proteínas. Essa técnica facilita a implantação do sistema PURE à engenharia do sistema biológico, possibilitando o desenvolvimento de novas redes genéticas, diagnósticos moleculares, terapêuticas e kits educacionais.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

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O encapsulamento de transcrição livre de células e Tradução Máquinas em vesículas para a Construção de Mimics celulares

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Medindo kinemática de ombro 3D in vivo usando videoradiografia biplanar

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Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos mínimos e lineares para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células

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