Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом в рамках гранта Программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 723106, гранта Швейцарского национального научного фонда (182019) и EPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PURE+technology.">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).</li><li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li><li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli.">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).</li><li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Протокол, представленный здесь, описывает простой, экономически эффективный способ получения универсальной системы экспрессии20 PURE на основе стандартной композиции15. Используя протокол вместе с прилагаемыми суточными графиками(таблица 1),все компоненты могут быть приготовлены за 1 неделю и дают количества, достаточные для реакций PURE до пятисот 10 мкл. Поскольку белки, используемые в этом протоколе, чрезмерно экспрессируются из плазмид с высокой копией и имеют низкую токсичность для E. coli,хорошие уровни экспрессии наблюдаются для всех необходимых белков(рисунок 1). Это позволяет легко регулировать штаммы, а следовательно, и белковый состав в кокультурах, просто изменяя соотношения прививочных штаммов20. Помимо рибосомных белков, концентрация EF-Tu показала, что она имеет фундаментальное значение для экспрессии6. Напротив, изменения концентрации других белковых компонентов оказали относительно низкое влияние на надежность системы PURE7,24. Таким образом, регулируя коэффициент инокуляции EF-Tu по отношению ко всем другим компонентам, можно достичь сопоставимой композиции со стандартной композицией PURE, и можно достичь системы PURE с аналогичным выходом20. При приготовлении белкового раствора крайне важно убедиться, что все штаммы хорошо растут и сверхэкспрессируют кодируемый белок после индукции(рисунок 1).
Функция рибосом является ключевой для общей производительности системы PURE24. В этом протоколе демонстрируются два различных способа приготовления раствора рибосомы, т.е. очистка рибосом без меток и с метками His. Очистка рибосом без меток основана на гидрофобной хроматографии взаимодействия с последующим центрифугированием с сахарозной подушкой, что требует доступа к системе очистки FPLC и ультрацентрифуге15. Напротив, метод, использующий помеченные His-метки рибосомы18 и очистку гравитационной аффинной хроматографии, не требует специализированного оборудования и может быть выполнен в большинстве лабораторий. Последний метод, таким образом, приносит такие преимущества, как простота и доступность. Тем не менее, мы наблюдали значительно более низкий выход синтеза при использовании рибосом His-меток в OnePot PURE по сравнению с вариантом без тегов(рисунок 3). В зависимости от типа применения, этот более низкий выход может быть приемлемым.
Энергетическое решение обеспечивает низкомолекулярные компоненты и тРНК, необходимые для подпитки реакций TX-TL in vitro. Этот протокол предоставляет рецепт типичного энергетического решения, которое может быть легко скорректировано в зависимости от потребностей пользователя. Вместе с тРНК, NTP и креатинфосфатом обилие и концентрация ионов Mg2+ имеют решающее значение для общей производительности системы PURE8,поскольку они являются критическими кофакторами для транскрипции и трансляции. В некоторых случаях титрование ионов может, таким образом, значительно повысить общую производительность PURE. Целостность ДНК имеет решающее значение для производительности PURE. Таким образом, последовательность, верифицирующая промоторную область, сайт связывания рибосом и ген-мишень и гарантирующая, что адекватная концентрация ДНК (<2 нМ) поможет устранить проблемы, которые могут возникнуть при настройке реакции PURE.
Система PURE представляет собой минимальную систему TX-TL, и поэтому для конкретных применений могут потребоваться дополнительные корректировки25. Они могут включать включение различных РНК-полимераз9,26,шаперонов13и белковых факторов, таких как EF-P или ArfA8. Хотя экспрессионные штаммы для этих белков могут быть включены в кокультуры, добавление их отдельно в подготовленную систему может обеспечить лучший контроль требуемых уровней белка. Кроме того, включение везикул имеет важное значение для производства мембранных белков10,11. Окисление, а не восстанавливающие среды и дисульфидная связующая изомераза способствуют надлежащему образованию дисульфидных связей, которые, например, необходимы для секреторных белков12.
Важно убедиться, что любые дополнительные компоненты не мешают реакции. Наиболее важные факторы, на которые следует обратить внимание при настройке реакции или добавлении других компонентов, перечислены ниже. Убедитесь, что не используются несовместимые буферы и не нарушаются концентрации ионов. Избегайте растворов, содержащих глицерин, высокие концентрации калия, магния, ионов кальция, осмолитов, пирофосфатов, антибиотиков или ЭДТА, насколько это возможно. Например, замена буфера элюации водой во время очистки ДНК может быть полезной, поскольку ЭДТА является общей добавкой в этом буфере. Снабжение растворов дополнительными отрицательно заряженными молекулами, такими как NTP или dNTP, требует регулировки концентрации магния8,поскольку отрицательно заряженные молекулы ведут себя как хелатирующие агенты и связывают положительно заряженные молекулы. Нейтральный рН идеально подходит для реакции. Соответственно, все компоненты должны быть буферизованы до соответствующего рН; это особенно важно для высококислых или основных молекул, таких как NFP. Наконец, температура и объем являются ключевыми параметрами для реакции. Для достижения хорошего урожая следует ввести температуру около 37 °C, так как температура ниже 34 °C значительно снизит урожайность27° C.
Уместно отметить, что перед приготовлением OnePot PURE следует рассмотреть целевое применение и связанные с ним требования, такие как объем, чистота, простота модификации, а также включение или пропуск компонентов. Для многих приложений система будет отличным выбором, но другие могут потребовать урожайности, регулируемости и других факторов, которые система OnePot не может обеспечить. Независимо от этого, введенный протокол будет полезен для подготовки любой самодельной системы, поскольку здесь кратко изложены все критические шаги для такой подготовки.
Одним из главных преимуществ системы OnePot является ее совместимость с коммерчески доступной системой PURExpress, которая обеспечивает возможность тестирования функциональности и целостности всех компонентов в отдельности путем последовательной замены каждого компонента PURExpress на его эквивалент OnePot. Преимущества системы OnePot PURE, такие как настраиваемость и простая, быстрая и экономичная подготовка, сделают бесклеточный TX-TL доступным для большего количества лабораторий по всему миру и будут способствовать расширению внедрения этой мощной платформы в бесклеточной синтетической биологии.

Бесклеточные транскрипционно-трансляционные системы (TX-TL) представляют собой перспективную платформу для исследования и проектирования биологических систем. Они обеспечивают упрощенные и настраиваемые условия реакции, поскольку они больше не зависят от жизнеобеспеспеивающих процессов, включая рост, гомеостаз или регуляторные механизмы1. Таким образом, ожидается, что бесклеточные системы будут способствовать исследованию биомолекулярных систем, предложат основу для тестирования рациональных стратегий биодизайна2и обеспечат шасси для будущей синтетической клетки3,4. Полностью рекомбинантная система PURE предлагает особенно привлекательное шасси благодаря своему определенному и минимальному составу, а также его регулируемости и настраиваемости5.
С тех пор, как в 2001 году была создана первая функциональная, полностью рекомбинантная система PURE5,были предприняты усилия по расширению границ системы и оптимизации состава системы для улучшения системы, дающей6,7,8,позволяющей транскрипционную регуляцию9,мембрану10,11 и секреторной синтез белка12,а также облегчить сворачивание белка13,14 . В настоящее время существует три коммерчески доступные системы: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) и Magic PURE (Creative Biolabs). Однако эти системы являются дорогостоящими, их точный состав является запатентованным и, следовательно, неизвестным, а адаптивность ограничена.
Системы PURE, подготовленные на месте, оказались наиболее экономичным и настраиваемым вариантом15,16. Однако требуемые 37 этапов очистки белковых и рибосомных фракций являются трудоемкими и утомительными. Было предпринято несколько попыток повысить эффективность подготовки системы PURE17,18,19. Недавно мы продемонстрировали, что можно кокультурировать и совместно очищать все необходимые небибосомные белки, присутствующие в системе PURE. Этот метод OnePot оказался экономически эффективным и эффективным по времени, сократив время подготовки с нескольких недель до 3 рабочих дней. Подход генерирует систему PURE с производительностью белка, сопоставимой с коммерчески доступной системой PURExpress20. В отличие от предыдущих подходов к упрощению препарата PURE17,18,19,в подходе OnePot все белки по-прежнему экспрессируются в отдельных штаммах. Это позволяет пользователю настраивать состав системы OnePot PURE, просто пропуская или добавляя определенные штаммы или регулируя объемы прививки, тем самым генерируя системы ВЫпадения PURE или изменяя конечные соотношения белков, соответственно.
Протокол, представленный здесь, предоставляет подробный метод создания системы OnePot PURE, как описаноранее 20,хотя β-меркаптоэтанол был заменен трис(2-карбоксиэтил)фосфином (TCEP). Кроме того, описаны два способа очистки рибосом: традиционная очистка рибосом без меток с использованием гидрофобного взаимодействия и сахарозной подушки, адаптированная из Shimizu et al.15,и очистка рибосом Ni-NTA на основе Wang et al.18 и Ederth et al.21, но значительно модифицированная. Последний метод дополнительно облегчает подготовку системы PURE и делает ее доступной для большего количества лабораторий, поскольку требуется только стандартное лабораторное оборудование.
Экспериментальный протокол суммирует подготовку универсальной бесклеточной системы PURE TX-TL для обеспечения простой, перестраиваемой, экономически эффективной бесклеточной платформы, которая может быть подготовлена с использованием стандартного лабораторного оборудования в течение недели. Помимо введения стандартной композиции PURE, мы указываем, как и где она может быть скорректирована, уделяя основное внимание критическим шагам в протоколе для обеспечения функциональности системы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

Определенная система транскрипции-трансляции PURE (синтез белка с использованием рекомбинантных элементов) обеспечивает привлекательное шасси для бесклеточной синтетической биологии. К сожалению, коммерчески доступные системы являются дорогостоящими, а их настраиваемость ограничена. Для сравнения, самодельный подход может быть настроен на основе потребностей пользователя. Однако приготовление самодельных систем является трудоемким и трудным из-за необходимости рибосом, а также 36 белковых чисток среднего масштаба. Оптимизация очистки белка путем кокультурирования и совместной очистки позволяет свести к минимуму временные и трудовые требования. Здесь мы представляем простой, настраиваемый, экономичный и экономичный метод производства всех компонентов системы PURE в течение 1 недели с использованием стандартного лабораторного оборудования. Кроме того, производительность OnePot PURE сопоставима с коммерчески доступными системами. Метод подготовки OnePot PURE расширяет доступность системы PURE для большего количества лабораторий благодаря своей простоте и экономической эффективности.

Вышеуказанный протокол предназначен для облегчения создания бесклеточной системы PURE TX-TL в любой лаборатории. Протокол включает подробное описание приготовления трех отдельных частей системы PURE: белка OnePot, рибосомы и энергетического раствора. Подробное ежедневное расписание, оптимизирует рабочий процесс, приведено в таблице 1. Рабочий процесс оптимизирован для очистки рибосом, помеченных His, и временные рамки могут немного отличаться, если выполняется очистка рибосом без меток. Один препарат обеспечивает достаточное количество PURE для реакций не менее пятисот 10 мкл. Кроме того, приготовленные растворы стабильны более года при -80 °C и могут выдерживать множественные циклы замораживания-оттаивания.
Адекватные уровни сверхэкспрессии для всех штаммов имеют решающее значение для функциональности конечного белкового раствора. На рисунке 1 показана успешная сверхэкспрессия во всех 36 отдельных штаммах, используемых впоследствии для приготовления белка OnePot. Изменение интенсивности полосы перегражённым белкам произошло, скорее всего, из-за смещения объемов загрузки на гель SDS-PAGE. Ожидаемые размеры белков обобщены в таблице 2. GlyRS и PheRS состоят из двух субъединиц различной молекулярной массы; остальные 34 белка состоят из одной субъедицы. Ключом к простоте и эффективности этого протокола по времени является этап кокультурирования и совместной очистки(рисунок 2). Белковый раствор OnePot готовили путем увеличения соотношения штамма EF-Tu по отношению ко всем остальным штаммам экспрессии. Общий состав конечных белков анализировали с помощью SDS-PAGE(рисунок 3А). Из гелей (полосы 2, 3) заметно, что EF-Tu (43,3 кДа) присутствует в более высокой концентрации по сравнению с другими белками, как и ожидалось. В то время как гель обеспечивает хорошее первое указание на соотношение экспрессии белка, трудно определить, был ли экспрессирован каждый отдельный белок и на каком уровне. Поэтому настоятельно рекомендуется подтвердить сверхэкспрессию у каждого штамма перед кокультурированием, как показано выше.
Рибосома E. coli представляет собой сложную молекулярную машину, состоящую из более чем 50 отдельных белковых субъединиц23. Репрезентативный спектр поглощения при 260 нм для очистки рибосом без меток показан на фиг.4; третий пик характерен для успешного элюции рибосом. Для обоих методов очистки рибосом наблюдалась ожидаемая картина выполнения на гелене SDS-PAGE(рисунок 3A)18. Мы наблюдали загрязнения для обеих очистк, хотя и в небольших количествах (<10%). Примечательно, что различные загрязняющие вещества присутствовали в рибосомах без меток (полосы 5, 6) и His-tagged (полосы 11, 12) из-за различий в методе. Для справки для пользователей также включены гели SDS-PAGE для комбинированных систем (полосы 8, 9 и 14, 15).
Наконец, сравниваются характеристики подготовленных систем(рисунок 3)с использованием различных вариантов рибосом. Временные курсы экспрессии eGFP in vitro показывают, что обе системы PURE функциональны и производят флуоресцентный eGFP. Однако белковый раствор OnePot в сочетании с рибосомами, помеченными His, с использованием концентрации рибосом, оптимизированной титрованием, дал только одну треть уровня экспрессии версии без помеченных рибосом(рисунок 3B). Аналогичные результаты наблюдались, когда три белка разных размеров были экспрессированы и помечены с использованием системы маркировки Green Lys tRNA in vitro (рисунок 3C). Как видно на флуоресцентном геле, полноразмерные продукты были успешно выражены в обеих системах; однако только около половины уровня экспрессии было достигнуто с помощью рибосомной системы His-tag. В дополнение к флуоресцентной маркировке, ожидаемые полосы для всех трех белков различимы на геле, окрашенном Кумасси(рисунок 3D). Результаты показывают, что введенная система экспрессии, которая может быть подготовлена в течение недели в лаборатории со стандартным оборудованием, может быть использована для экспрессии in vitro белков, кодируемых после промотора Т7 из линейных шаблонов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Рисунок 1:Репрезентативные результаты теста на сверхэкспрессию для всех штаммов экспрессии системы PURE. Количество и размеры белка PURE обобщены в таблице 2. Белковые числа 21, 24 и 27 отмечены звездочкой для лучшей визуализации. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Рисунок 2:Очистка белка OnePot. Схематическое изображение и соответствующие фотографии всех этапов, участвующих в производстве белкового раствора OnePot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Рисунок 3:Производительность подготовленных систем с использованием различных рибосомных вариантов. (A) Coomassie окрашенные синим цветом SDS-PAGE гели из белкового раствора OnePot (полосы 2, 3), рибосомы без меток без белкового раствора (полосы 5, 6) и с белковым раствором (полосы 8, 9), His-метки рибосом без белкового раствора (полосы 11, 12) и с белковым раствором (полосы 14, 15). На образец были загружены две различные концентрации. (B) Сравнение экспрессии eGFP помеченных His-меток рибосом и рибосом без меток. Интенсивность флуоресценции экспрессии eGFP in vitro контролируется с течением времени для реакции PURE с использованием рибосом без меток (1,8 мкМ, синий) и рибосом с гисс-метками (0,62 мкМ, красный). Концентрации линейного шаблона и белкового раствора OnePot составляли 4 нМ и 2 мг/мл соответственно. Панели(C)и(D)показывают гель SDS-PAGE белков, синтезированных в OnePot с безметочными (1,8 мкМ, синие, полосы 3, 4, 5) и Рибосомами His-tag (0,62 мкМ, красный, полосы 6, 7, 8), помеченными набором маркировки GreenLys in vitro (C)и окрашенными синим цветом Coomassie(D),соответственно. Черными стрелками обозначены ожидаемые полосы синтезированных белков: eGFP (26,9 кДа), ArgRS (64,7 кДа), T7 RNAP (98,9 кДа). Линейный шаблон и концентрации белкового раствора OnePot составляли 4 нМ и 1,6 мг/мл соответственно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Рисунок 4:Спектры поглощения при 260 нм. Репрезентативные результаты спектров поглощения при 260 нм при гидрофобной очистке взаимодействия рибосом без меток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Ежедневный оптимизированный по времени график подготовки всех решений OnePot PURE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 2: Список чистых белков <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица 1: Реагенты. В таблице перечислены концентрации, объемы и другие конкретные детали реагентов и компонентов, используемых во время этого исследования. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица 2: Буферы. В электронной таблице перечислены точные буферные композиции для очистки белка, рибосомы без меток и рибосомы His-tag, а также концентрации стоковых растворов, используемых для их приготовления. Кроме того, он вычисляет необходимое количество компонентов на основе объема буфера. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица 3: Расчет аминокислот. В электронной таблице перечислены аминокислоты и рекомендуемые концентрации их в растворе, необходимые для энергетического раствора. Он рассчитывает количество воды, добавляемой к каждой аминокислоте, на основе фактической взвешенной массы, а также рассчитывает объем раствора аминокислоты, который будет добавлен в конечную смесь аминокислот. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица 4: Складовые решения для энергетического решения. В таблице перечислены концентрации и объемы запасов растворов, необходимых для энергетического раствора, и указаны дополнительные сведения, включая условия хранения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица 5: Энергетическое решение. В таблице перечислены компоненты энергетического раствора и их рекомендуемые концентрации. Кроме того, он рассчитывает их необходимые объемы для добавления в конечный раствор на основе их концентраций в запасе раствора и объема энергетического раствора. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица 6: ПЦР. В таблице перечислены последовательности и концентрации праймеров, используемых для удлинительной ПЦР, и указаны температуры плавления и этапы термоциклера, оптимизированные для высокоточной ДНК-полимеразы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительная таблица 7: Реакция PURE. В электронной таблице приведен пример настройки реакции PURE. В нем перечислены используемые концентрации и объемы компонентов для реакции PURE с использованием рибосом без меток или рибосом His-tag. Кроме того, он рассчитывает объемные соотношения для титрования белка и рибосомы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

OnePot PURE Cell-Free System

Мы представляем быстрый и экономичный метод получения рекомбинантной бесклеточной системы PURE TX-TL с использованием стандартного лабораторного оборудования.

Бесклеточная система OnePot PURE

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Этот протокол для рекомбинантной бесклеточной системы экспрессии белка, широко известной как система PURE, использует культивирование клеток и очистку клеток для оптимизации требуемых белковых очистк. Это значительно минимизирует временные и трудовые требования. Метод OnePot оказался не только экономичным, но и эффективным по времени.Это сокращает время подготовки с нескольких недель до трех рабочих дней. Это делает бесклеточную платформу PURE доступной для большего количества лабораторий по всему миру и помогает реализовать эту действительно мощную платформу для синтетической бесклеточной биологии. Прежде чем начать, убедитесь, что все штаммы хорошо экспрессуют свой соответствующий белок.Для начала подготовьте колонку для очистки белка OnePot, как описано в текстовой рукописи, используя два миллилитра смолы сефарозы, а затем зарядите колонку сульфатом никеля. Подготовьте закваски, соединив 20 миллилитров среды LB с 20 микролитрами ампициллина. Добавьте 300 микролитров среды в 35 лунок стерильной плиты глубиной 96 лунок.Инокулируйте каждый из них соответствующей деформацией, за исключением термостабильного коэффициента удлинения, или EFTU, и запечатайте пластину дышащей мембраной. Для культуры EFTU привите три миллилитра ампициллина, содержащего LB-носок, в 14-миллилитровой культурной трубке с защелкиванием. Около трех миллилитров культуры EFTU достаточно для одной культуры выражения OnePot.Высиживая его при 37 градусах Цельсия, встряхивая со скоростью 260 оборотов в минуту в течение ночи. На следующий день переложите 500 миллилитров среды LB и 500 микролитров ампициллина в стерильную сбитую колбу. Инокулируйте культуру OnePot PURE 1 675 микролитрами культуры EFTU и 55 микролитрами каждой из культур из глубокой плиты скважины.Инкубируют культуру в течение двух часов при 37 градусах Цельсия с встряхиванием 260 оборотов в минуту, или до тех пор, пока оптическая плотность культуры не достигнет от 0,2 до 0,3. Индуцируют культуру 500 микролитрами 0,1 миллимолярного IPTG и растут в течение дополнительных трех часов. Собирайте клетки центрифугированием при четырех градусах Цельсия и 3, 220 раз g в течение 10 минут и храните гранулы ячейки при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования.На третий день измерьте количество буферов, необходимых для их очистки, и добавьте TCEP ко всем из них, как указано в тексте. Храните оставшиеся буферы без TCEP при четырех градусах Цельсия для будущих очистк. Уравновешивайте заряженную колонну 30 миллилитрами буфера А.После того, как через него прошло 25 миллилитров буфера А, закройте колонну снизу.Разморозить клетки и использовать серологическую пипетку для повторного суспендирования клеточной гранулы в 7,5 миллилитрах буфера A.Lyse клеток с помощью зонда мощностью 130 Вт. Если ультразвуковая хищность будет успешной, раствор станет темнее. Убедитесь, что клетки держатся на льду и поместите зонд достаточно глубоко, не касаясь трубки.Удалите обломки клеток центрифугированием при 21, 130 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и держите лисат на льду. Добавьте супернатант в уравновешивающий столбец. Закройте колонну сверху и убедитесь, что нет утечки.Инкубировать колонну в течение трех часов при четырех градусах Цельсия при вращении с помощью трубчатого ротатора. Элюйте несвязанные компоненты из колонны и промывайте 25 миллилитрами буфера А.Промыть колонну 25 миллилитрами 25 миллимолярного имидазол-буфера. Элюируют белки пятью миллилитрами 450-миллимолярного имидазолового буфера и сохраняют элюированные белки на льду в любое время.Разбавьте элюат 25 миллилитрами буфера HT и держите смесь на льду. Добавьте 15 миллилитров в 15-миллилитровый центробежный фильтр и сконцентрируйте до объема 1,5 миллилитров. Добавьте оставшиеся 15 миллилитров в фильтр с концентрированным раствором и еще раз сконцентрируйте до 1,5 миллилитра.Добавьте 10 миллилитров буфера HT к концентрированной пробе и концентрат до одного миллилитра. Извлеким концентрированный образец и добавьте равное количество запасного буфера В и храните при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Во время буферного обмена восстановите столбец, указанный в тексте.На четвертый день измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. Сконцентрируйте образец с помощью 0,5 миллилитров трех килодалтонного отсечных центробежных фильтров до 20 миллиграммов на миллилитр. Проверьте состав белка OnePot PURE с помощью страницы SDS.Разбавьте 2,5 микролитра образца 7,5 микролитрами воды, смешанной с 10 микролитрами двух буферов X Laemmli, а затем загрузите на гель пять микролитров и 2,5 микролитра образцов. Запустите страницу SDS, как указано в тексте. Заполните концентрацию и длину ДНК в соответствующих желтых клетках в электронной таблице, используя от двух до 10 наномоляров ДНК для реакции.Заполните желаемый общий объем реакции микролитрами. Извлеките необходимые реагенты из морозильной камеры и разморозьте их на льду. Затем пипетка рассчитанного количества воды, ДНК и энергетического раствора на одну сторону ПЦР-трубки или один угол скважины на пластине 384 скважины.Пипетка рассчитанных количеств белка и рибосомного раствора на другую сторону ПЦР-трубки или противоположный угол 384-й колодезной пластины. Вращайтесь около 30 секунд, чтобы объединить компоненты реакции. Чтобы предотвратить испарение во время экспериментов со считывателем пластин, добавьте 35 микролитров жидкого воска и запечатайте пластину прозрачным герметиком.Инкубировать в течение минимум трех часов при 37 градусах Цельсия. Для считывания на пластинчатом считывателе измеряйте интенсивность цветения на требуемой длине волны каждые две минуты. Успешная экспрессия во всех отдельных штаммах, используемых впоследствии для белкового препарата OnePot, показана здесь.Общий состав конечного белкового раствора OnePot PURE был проанализирован на странице SDS. Заметно, что EFTU присутствует в более высокой концентрации по сравнению с другими белками, как и ожидалось. Выходы синтеза белкового раствора OnePot в сочетании с his-помеченными или непомеченными рибосомами анализировали путем мониторинга флуоресценции eGFP с течением времени.Уровни экспрессии трех различных белков, помеченных с использованием системы маркировки tRNA in vitro с зеленым списком или окрашивания Kumasi, были проанализированы на геле страницы SDS. Для функциональной системы PURE абсолютно важно, чтобы все штаммы хорошо экспрессивали свои соответствующие белки. Этот метод облегчает внедрение системы PURE в биологическую системную инженерию, позволяя создавать новые генетические сети, молекулярную диагностику, терапевтические и образовательные наборы.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Бактериальные обнаружения и идентификации с использованием электрохимических датчиков

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Инкапсуляция Бесклеточные транскрипции и трансляции в машинный Пузырьки, для построения клеточных Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Пломбируемая Femtoliter палата массивы для сотового без биологии

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Орбиталь, пожимая культуры Mammalian клеток в O-образный судов для получения единообразных агрегатов

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Ячейки бесплатно белка выражение с использованием быстро растущих бактерией Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Многослойная микрофлюидная платформа для проведения длительного выражения генов без клеток

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Подготовка белка Производство синтетических клеток с использованием клеток бесплатные бактериальные экстракты, липосомы и эмульсии передачи

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Измерение 3D In-vivo Кинематика плеча с помощью бипланарной видеорадиографии

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Быстрые ферментативные методы амплификации минимальных линейных шаблонов для прототипирования белка с использованием бесклеточных систем

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...