Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
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Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación en el marco de la Subvención del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea 723106, una Subvención de la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza (182019) y EPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo presentado aquí describe un método simple, efectivo en tiempo y costo para preparar un sistema de expresión PURE versátil20 basado en la composición estándar15. Al utilizar el protocolo junto con los horarios diarios suministrados(Tabla 1),todos los componentes se pueden preparar en 1 semana y producen cantidades suficientes para reacciones PURE de hasta quinientas 10 μL. Dado que las proteínas utilizadas en este protocolo están sobreexpresadas a partir de plásmidos de copia alta y tienen baja toxicidad para E. coli,se observan buenos niveles de expresión para todas las proteínas requeridas(Figura 1). Esto permite el fácil ajuste de las cepas, y por lo tanto también la composición de proteínas en los cocultivos, simplemente modificando las proporciones de las cepas de inoculación20. Además de las proteínas ribosómicas, la concentración de EF-Tu demostró ser de fundamental importancia para los rendimientos de expresión6. Por el contrario, los cambios en la concentración de los otros componentes de la proteína tuvieron un impacto relativamente bajo en la robustez del sistema PURE7,24. Por lo tanto, ajustando la relación de inoculación de EF-Tu con respecto a todos los demás componentes, se puede lograr una composición comparable a la composición PURE estándar, y se puede lograr un sistema PURE con un rendimiento similar20. Al preparar la solución proteica, es crucial asegurarse de que todas las cepas crezcan bien y sobreexpresen la proteína codificada después de la inducción(Figura 1).
La función de ribosoma es clave para el rendimiento general del sistema PURE24. En este protocolo, se demuestran dos métodos diferentes para preparar la solución de ribosoma, es decir, la purificación de ribosomas sin etiquetas y con etiqueta His. La purificación de ribosomas sin etiquetas se basa en cromatografía de interacción hidrofóbica seguida de centrifugación con un cojín de sacarosa, que requiere acceso a un sistema de purificación FPLC y una ultracentrífuga15. Por el contrario, el método que utiliza ribosomas marcados con His18 y la purificación por cromatografía de afinidad de flujo por gravedad no requiere equipo especializado y se puede realizar en la mayoría de los laboratorios. Este último método, por lo tanto, aporta ventajas como la simplicidad y la accesibilidad. Sin embargo, observamos un rendimiento de síntesis significativamente menor cuando se utilizaron los ribosomas marcados con His en el OnePot PURE en comparación con la variante sin etiquetas (Figura 3). Según el tipo de aplicación, este menor rendimiento puede ser aceptable.
La solución energética proporciona los componentes de bajo peso molecular y los ARNt necesarios para alimentar las reacciones TX-TL in vitro. Este protocolo proporciona una receta para una solución energética típica, que se puede ajustar fácilmente en función de las necesidades del usuario. Junto con el ARNt, el NTP y el fosfato de creatina, la abundancia y concentración de iones Mg2+ han sido cruciales para el rendimiento general del sistema PURE8,ya que son cofactores críticos para la transcripción y traducción. En algunos casos, la titulación de iones puede, por lo tanto, mejorar en gran medida el rendimiento general de PURE. La integridad del ADN es crucial para el rendimiento de PURE. Por lo tanto, la secuencia verifica la región promotora, el sitio de unión al ribosoma y el gen objetivo y garantiza que una concentración adecuada de ADN (<2 nM) ayudará a solucionar los problemas que puedan surgir al configurar una reacción PURE.
El sistema PURE es un sistema TX-TL mínimo y, por lo tanto, aplicaciones específicas pueden requerir ajustes adicionales25. Estos pueden incluir la incorporación de diferentes ARN polimerasas9,26,chaperonas13y factores proteicos como EF-P o ArfA8. Aunque las cepas de expresión para estas proteínas se pueden incluir en los cocultivos, agregarlas por separado al sistema preparado puede proporcionar un mejor control de los niveles de proteínas requeridos. Además, la inclusión de vesículas es esencial para la producción de proteínas de membrana10,11. La oxidación en lugar de reducir los ambientes y una isomerasa de enlace disulfuro facilitan la formación adecuada de enlaces disulfuro, que son, por ejemplo, necesarios para las proteínas secretoras12.
Es esencial asegurarse de que los componentes adicionales no interfieran con la reacción. Los factores más importantes a los que debe prestar atención al configurar una reacción o agregar otros componentes se enumeran a continuación. Asegúrese de que no se utilicen tampones incompatibles ni se alteren las concentraciones de iones. Evite las soluciones que contengan glicerol, altas concentraciones de potasio, magnesio, iones de calcio, osmolatos, pirofosfato, antibióticos o EDTA, tanto como sea posible. Por ejemplo, reemplazar un tampón de elución con agua durante la purificación del ADN puede ser beneficioso, ya que el EDTA es un aditivo común en este tampón. Suministrar a las soluciones moléculas adicionales cargadas negativamente como NTP o dNTP requiere ajustar la concentración de magnesio8,ya que las moléculas cargadas negativamente se comportan como agentes quelantes y se unen a moléculas cargadas positivamente. Un pH neutro es ideal para la reacción. En consecuencia, todos los componentes deben amortiguarse al pH correspondiente; esto es especialmente importante para moléculas altamente ácidas o básicas como los NTP. Por último, la temperatura y el volumen son parámetros clave para la reacción. Para lograr un buen rendimiento, se debe implementar una temperatura de alrededor de 37 ° C, ya que las temperaturas por debajo de 34 ° C reducirán significativamente el rendimiento27.
Es relevante tener en cuenta que antes de preparar el OnePot PURE, se debe considerar la aplicación de destino y los requisitos asociados, como el volumen, la pureza, la facilidad de modificación y la inclusión u omisión de componentes. Para muchas aplicaciones, el sistema será una excelente opción, pero otras pueden requerir rendimientos, capacidad de ajuste y otros factores, que el sistema OnePot no puede proporcionar. Independientemente, el protocolo introducido será beneficioso para la preparación de cualquier sistema casero, ya que aquí se resumen todos los pasos críticos para dicha preparación.
Una de las principales ventajas del sistema OnePot es su compatibilidad con el sistema PURExpress disponible comercialmente, que ofrece la posibilidad de probar la funcionalidad y la integridad de todos los componentes por separado mediante la sustitución secuencial de cada componente PURExpress por su equivalente OnePot. Las ventajas del sistema OnePot PURE, como la capacidad de ajuste y la preparación fácil, rápida y rentable, harán que tx-TL sin células sea accesible a más laboratorios en todo el mundo y contribuirán a expandir la implementación de esta poderosa plataforma en biología sintética libre de células.

Los sistemas de transcripción-traducción sin células (TX-TL) constituyen una plataforma prometedora para investigar e ingeniería de sistemas biológicos. Proporcionan condiciones de reacción simplificadas y sintonizables, ya que ya no dependen de procesos que sostienen la vida, incluido el crecimiento, la homeostasis o los mecanismos reguladores1. Por lo tanto, se anticipa que los sistemas libres de células contribuirán a la investigación de los sistemas biomoleculares, ofrecerán un marco para probar estrategias racionales de biodiseño2y proporcionarán un chasis para una futura célula sintética3,4. El sistema PURE totalmente recombinante ofrece un chasis especialmente atractivo debido a su composición definida y mínima, así como a su capacidad de ajuste y puesta a punto5.
Desde que se estableció el primer sistema PURE funcional y totalmente recombinante en 20015,se han realizado esfuerzos para ampliar los límites del sistema y optimizar la composición del sistema para mejorar los rendimientos del sistema6,7,8,permitir la regulación transcripcional9,la membrana10, 11 y la síntesis secretora de proteínas12,y facilitar el plegamientode proteínas 13,14 . Hoy en día, hay tres sistemas disponibles comercialmente: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) y Magic PURE (Creative Biolabs). Sin embargo, esos sistemas son costosos, su composición exacta es propietaria y, por lo tanto, desconocida, y la adaptabilidad es limitada.
Los sistemas PURE preparados internamente demostraron ser la opción más rentable y sintonizable15,16. Sin embargo, los 37 pasos de purificación requeridos para las fracciones de proteínas y ribosomas consumen mucho tiempo y son tediosos. Se han hecho varios intentos para mejorar la eficiencia de la preparación del sistema PURE17,18,19. Recientemente demostramos que es posible cocultivar y copurpurar todas las proteínas no ribosómicas requeridas presentes en el sistema PURE. Este método OnePot ha demostrado ser rentable y eficiente en el tiempo, reduciendo el tiempo de preparación de varias semanas a 3 días hábiles. El enfoque genera un sistema PURE con una capacidad de producción de proteínas comparable al sistema PURExpress disponible comercialmente20. Contrariamente a los enfoques anteriores para simplificar la preparación PURE17,18,19, en el enfoque OnePot todas las proteínas todavía se expresan en cepas separadas. Esto permite al usuario ajustar la composición del sistema OnePot PURE simplemente omitiendo o agregando cepas específicas o ajustando los volúmenes de inoculación, generando así sistemas PURE de abandono o alterando las proporciones de proteínas finales, respectivamente.
El protocolo presentado aquí proporciona un método detallado para crear el sistema OnePot PURE como se describió anteriormente20,aunque β-mercaptoetanol fue reemplazado por tris(2-carboxietilo)fosfina (TCEP). Además, se describen dos métodos para la purificación de ribosomas: la purificación tradicional de ribosomas sin etiquetas utilizando interacción hidrofóbica y cojín de sacarosa, adaptado de Shimizu et al.15, y la purificación de ribosomas Ni-NTA basada en Wang et al.18 y Ederth et al.21 pero significativamente modificada. Este último método facilita aún más la preparación del sistema PURE y lo hace accesible a más laboratorios, ya que solo se requiere un equipo de laboratorio estándar.
El protocolo experimental resume la preparación de un versátil sistema TX-TL libre de células PURE para proporcionar una plataforma sin células simple, sintonizable y rentable, que se puede preparar utilizando equipos de laboratorio estándar en una semana. Además de introducir la composición PURE estándar, indicamos cómo y dónde se puede ajustar, con un enfoque principal en los pasos críticos en el protocolo para garantizar la funcionalidad del sistema.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

El sistema definido de transcripción-traducción PURE (síntesis de proteínas utilizando elementos recombinantes) proporciona un chasis atractivo para la biología sintética libre de células. Desafortunadamente, los sistemas disponibles comercialmente son costosos y su capacidad de ajuste es limitada. En comparación, un enfoque casero se puede personalizar en función de las necesidades del usuario. Sin embargo, la preparación de sistemas caseros requiere mucho tiempo y es ardua debido a la necesidad de ribosomas, así como 36 purificaciones de proteínas a mediana escala. La racionalización de la purificación de proteínas mediante el coculturización y la copurificación permite minimizar los requisitos de tiempo y mano de obra. Aquí, presentamos un método fácil, ajustable, rentable y de tiempo para producir todos los componentes del sistema PURE en 1 semana, utilizando equipos de laboratorio estándar. Además, el rendimiento del OnePot PURE es comparable al de los sistemas disponibles comercialmente. El método de preparación OnePot PURE amplía la accesibilidad del sistema PURE a más laboratorios debido a su simplicidad y rentabilidad.

El protocolo anterior está diseñado para facilitar el establecimiento del sistema TX-TL libre de células PURE en cualquier laboratorio. El protocolo incluye una descripción detallada de la preparación de las tres partes distintas del sistema PURE: la proteína OnePot, el ribosoma y la solución energética. En la Tabla 1se muestra una programación diaria detallada, que optimiza el flujo de trabajo. El flujo de trabajo está optimizado para la purificación de ribosomas marcados con His, y los marcos de tiempo pueden diferir ligeramente si se realiza la purificación de ribosomas sin etiquetas. Una preparación proporciona una cantidad suficiente de PURE para un mínimo de quinientas reacciones de 10 μL. Además, las soluciones preparadas son estables durante más de un año a -80 °C y pueden soportar múltiples ciclos de congelación-descongelación.
Los niveles adecuados de sobreexpresión para todas las cepas son cruciales para la funcionalidad de la solución proteica final. La Figura 1 muestra una sobreexpresión exitosa en las 36 cepas individuales utilizadas posteriormente para la preparación de proteínas OnePot. La variación en las intensidades de banda de las proteínas sobreres expresadas ocurrió muy probablemente debido a un sesgo en los volúmenes de carga en el gel SDS-PAGE. Los tamaños de proteína esperados se resumen en la Tabla 2. GlyRS y PheRS consisten en dos subunidades de varios pesos moleculares; las 34 proteínas restantes consisten en una sola subunidad. La clave de la simplicidad y la eficacia del tiempo de este protocolo es el paso de coculturización y co-purificación (Figura 2). La solución de proteína OnePot se preparó aumentando la proporción de cepa EF-Tu con respecto a todas las demás cepas de expresión. La composición global de las proteínas finales fue analizada por SDS-PAGE (Figura 3A). A partir de los geles (carriles 2, 3), se nota que EF-Tu (43,3 kDa) está presente en una concentración más alta en comparación con las otras proteínas, como se esperaba. Si bien el gel proporciona una buena primera indicación de las proporciones de expresión de proteínas, es difícil determinar si y en qué nivel se expresó cada proteína individual. Por lo tanto, es muy recomendable confirmar la sobreexpresión en cada cepa antes de coculturar, como se muestra arriba.
El ribosoma de E. coli es una máquina molecular compleja compuesta por más de 50 subunidades de proteínas individuales23. En la Figura 4se muestra un espectro de absorción representativo a 260 nm para la purificación de ribosomas sin etiquetas; el tercer pico es característico de la elución exitosa del ribosoma. Para ambos métodos de purificación de ribosomas, se observó el patrón de funcionamiento esperado en el gel SDS-PAGE (Figura 3A)18. Observamos contaminaciones para ambas purificaciones, aunque en pequeñas cantidades (<10%). En particular, diferentes contaminantes estaban presentes en los ribosomas sin etiquetas (carriles 5, 6) e hisetiquetados (carriles 11, 12) debido a la variación en el método. Para referencia del usuario, también se incluyen los geles SDS-PAGE para los sistemas combinados (carriles 8, 9 y 14, 15).
Por último, se compara el rendimiento de los sistemas preparados (Figura 3) utilizando las diferentes variantes de ribosomas. Los cursos de tiempo de expresión in vitro de eGFP muestran que ambos sistemas PURE son funcionales y producen eGFP fluorescente. Sin embargo, la solución de proteína OnePot combinada con los ribosomas marcados con His, utilizando la concentración de ribosomas optimizada por titulación, produjo solo un tercio del nivel de expresión de la versión de ribosoma no etiquetada(Figura 3B). Se observaron resultados similares cuando se expresaron y etiquetaron tres proteínas de diferentes tamaños utilizando el sistema de etiquetado in vitro Green Lys tRNA(Figura 3C). Como se ve en el gel fluorescente, los productos de longitud completa se expresaron con éxito en ambos sistemas; sin embargo, solo alrededor de la mitad del nivel de expresión se logró con el sistema de ribosoma His-tag. Además del etiquetado de fluorescencia, las bandas esperadas para las tres proteínas se distinguen en un gel teñido de Coomassie(Figura 3D). Los resultados muestran que el sistema de expresión introducido, que se puede preparar en una semana en un laboratorio con equipo estándar, se puede utilizar para la expresión in vitro de proteínas codificadas aguas abajo del promotor T7 a partir de plantillas lineales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Figura 1: Resultados representativos para la prueba de sobreexpresión para todas las cepas de expresión del sistema PURE. Los números y tamaños de proteínas PURAS se resumen en la Tabla 2. Los números de proteína 21, 24 y 27 están marcados con una estrella para una mejor visualización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Figura 2: Purificación de proteínas OnePot. La representación esquemática y las fotografías correspondientes de todos los pasos involucrados en la producción de la solución de proteína OnePot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Figura 3: Rendimiento de los sistemas preparados utilizando las diferentes variantes de ribosomas. (A) Geles SDS-PAGE teñidos de azul coomassie de la solución proteica OnePot (carriles 2, 3), ribosomas sin etiquetas sin solución proteica (carriles 5, 6) y con solución proteica (carriles 8, 9), ribosomas his-etiquetados sin solución proteica (carriles 11, 12) y con solución proteica (carriles 14, 15). Se cargaron dos concentraciones diferentes por muestra. (B) Comparación de la expresión de eGFP de ribosomas marcados con His y ribosomas sin etiquetas. La intensidad de fluorescencia de la expresión in vitro de eGFP se controla a lo largo del tiempo para una reacción PURA utilizando ribosomas sin etiquetas (1,8 μM, azul) y ribosomas marcados con His (0,62 μM, rojo). Las concentraciones de la plantilla lineal y la solución de proteína OnePot fueron de 4 nM y 2 mg/ml, respectivamente. Los paneles (C) y (D) muestran el gel SDS-PAGE de proteínas sintetizadas en OnePot con tag-free (1.8 μM, azul, carriles 3, 4, 5) y ribosomas His-tag (0.62 μM, rojo, carriles 6, 7, 8) etiquetados con un kit de etiquetado in vitro GreenLys (C) y teñidos con azul Coomassie (D), respectivamente. Las flechas negras indican las bandas esperadas de proteínas sintetizadas: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Las concentraciones de la plantilla lineal y de la solución de proteína OnePot fueron de 4 nM y 1,6 mg/ml, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Figura 4: Espectros de absorbancia a 260 nm. Resultados representativos de espectros de absorbancia a 260 nm durante la purificación por interacción hidrofóbica de ribosomas sin etiquetas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Un calendario diario optimizado para la preparación de todas las soluciones OnePot PURE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Lista de proteínas PURAS <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta Tabla.</a>
Tabla suplementaria 1: Reactivos. La tabla enumera concentraciones, volúmenes y otros detalles específicos de los reactivos y componentes utilizados durante este estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Cuadro complementario 2: Colchones. La hoja de cálculo enumera las composiciones tampón exactas para las purificaciones de proteínas, ribosomas sin etiquetas y ribosomas His-tag, así como las concentraciones de las soluciones de stock utilizadas para su preparación. Además, calcula las cantidades requeridas de componentes en función del volumen del búfer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla complementaria 3: Cálculos de aminoácidos. La hoja de cálculo enumera los aminoácidos y sus concentraciones de solución de stock recomendadas requeridas para la solución energética. Calcula la cantidad de agua que se agregará a cada aminoácido en función de la masa pesada real, y también calcula el volumen de la solución de aminoácidos que se agregará a la mezcla final de aminoácidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla complementaria 4: Soluciones de stock para la solución energética. La tabla enumera las concentraciones y volúmenes de soluciones de stock necesarias para la solución energética e indica más detalles, incluidas las condiciones de almacenamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Cuadro complementario 5: Solución energética. La tabla enumera los componentes de la solución energética y sus concentraciones recomendadas. Además, calcula sus volúmenes requeridos para ser agregados a la solución final en función de sus concentraciones de solución de stock y el volumen de la solución de energía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Cuadro complementario 6: PCR. La tabla enumera las secuencias y concentraciones de los cebadores utilizados para la extensión PCR e indica las temperaturas de fusión y los pasos del termociclador optimizados para una ADN polimerasa de alta fidelidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla complementaria 7: Reacción PURA. La hoja de cálculo muestra un ejemplo de configuración de una reacción PURE. Enumera las concentraciones y volúmenes utilizados de los componentes para una reacción PURA utilizando ribosomas sin etiquetas o ribosomas His-tag. Además, calcula las proporciones de volumen para las valoraciones de proteínas y ribosomas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

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OnePot PURE Cell-Free System

Presentamos un método rápido y rentable para producir el sistema TX-TL recombinante PURE libre de células utilizando equipos de laboratorio estándar.

Sistema OnePot PURE Cell-Free

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Este protocolo para un sistema de expresión de proteínas libres de células recombinantes, comúnmente conocido como el sistema PURE, utiliza el cultivo celular y la purificación celular para agilizar las purificaciones de proteínas requeridas. Esto minimiza significativamente los requisitos de tiempo y mano de obra. El método OnePot ha demostrado ser no solo rentable, sino también eficiente en el tiempo.Reduce los tiempos de preparación de varias semanas a tres días hábiles. Esto hace que la plataforma PURE libre de células sea accesible a más laboratorios en todo el mundo y ayuda a implementar esta plataforma realmente poderosa para la biología sintética libre de células. Antes de comenzar, asegúrese de que todas las cepas expresen bien sus respectivas proteínas.Para comenzar, prepare la columna para la purificación de proteínas OnePot como se describe en el manuscrito de texto usando dos mililitros de resina de Sepharose, y luego cargue la columna con sulfato de níquel. Prepare los cultivos iniciadores combinando 20 mililitros de medios LB con 20 microlitros de ampicilina. Agregue 300 microlitros del medio en 35 pozos de una placa estéril de 96 pozos profundos.Inocular cada uno de ellos con su respectiva cepa, excepto el factor de elongación termoestable, o EFTU, y sellar la placa con una membrana transpirable. Para el cultivo EFTU, inocule tres mililitros de ampicilina que contengan medios LB en un tubo de cultivo de 14 mililitros con una tapa a presión. Alrededor de tres mililitros de cultivo EFTU son suficientes para una cultura de expresión OnePot.Incubarlo a 37 grados centígrados mientras tiembla a 260 rotaciones por minuto durante la noche. Al día siguiente, transfiera 500 mililitros de medios LB y 500 microlitros de ampicilina al matraz desconcertado estéril. Inocular el cultivo OnePot PURE con 1,675 microlitros del cultivo EFTU y 55 microlitros de cada uno de los cultivos de la placa del pozo profundo.Incubar el cultivo durante dos horas a 37 grados centígrados con una sacudida de 260 rotaciones por minuto, o hasta que la densidad óptica del cultivo alcance 0,2 a 0,3. Inducir el cultivo con 500 microlitros de 0,1 milimolares IPTG y crecer durante tres horas adicionales. Cosechar las células por centrifugación a cuatro grados Celsius y 3, 220 veces G durante 10 minutos, y almacenar el pellet celular a menos 80 grados Celsius hasta su uso posterior.En el tercer día, mida las cantidades de tampones necesarios para su purificación y agregue TCEP a todos ellos como se indica en el texto. Almacene los tampones restantes sin TCEP a cuatro grados Celsius para futuras purificaciones. Equilibre la columna cargada con 30 mililitros de tampón A.Después de que hayan pasado 25 mililitros de búfer A, cierre la columna desde la parte inferior.Descongele las células y use una pipeta serológica para resuspend el pellet celular en 7,5 mililitros de tampón A.Lyse las células utilizando una sonda de 130 vatios. Si la sonicación es exitosa, la solución se volverá más oscura. Asegúrese de mantener las células en hielo y coloque la sonda lo suficientemente profunda sin tocar el tubo.Retire los restos celulares por centrifugación a 21, 130 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados y mantenga el lisato en hielo. Agregue el sobrenadante a la columna equilibrada. Cierre la columna desde la parte superior y asegúrese de que no haya fugas.Incubar la columna durante tres horas a cuatro grados centígrados bajo rotación utilizando un rotador de tubo. Elute los componentes no unidos de la columna y lávelos con 25 mililitros de tampón A.Lave la columna con 25 mililitros de tampón de imidazol de 25 milimolares. Elute las proteínas con cinco mililitros de tampón de imidazol de 450 milimolares y mantenga las proteínas eluidas en hielo en todo momento.Diluya el eluido con 25 mililitros de tampón HT y mantenga la mezcla en hielo. Agregue 15 mililitros a un filtro centrífugo de 15 mililitros y concéntrese a un volumen de 1,5 mililitros. Agregue los 15 mililitros restantes al filtro con la solución concentrada y concéntrese a 1,5 mililitros una vez más.Agregue 10 mililitros de tampón HT a la muestra concentrada y concéntrese a un mililitro. Recupere la muestra concentrada y agregue una cantidad igual de tampón B de stock y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Durante el intercambio de búfer, restaure la columna como se especifica en el texto.En el cuarto día, mida la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford. Concentre la muestra con 0,5 mililitros de filtro centrífugo de corte de tres kilodalton a 20 miligramos por mililitro. Verifique la composición de la proteína OnePot PURE usando la página SDS.Diluya 2,5 microlitros de la muestra con 7,5 microlitros de agua mezclados con 10 microlitros de dos tampón X Laemmli, y luego cargue cinco microlitros y 2,5 microlitros de las muestras en el gel. Ejecute la página SDS como se especifica en el texto. Complete la concentración y la longitud del ADN en las células amarillas correspondientes en la hoja de cálculo utilizando de dos a 10 nanomolares de ADN para la reacción.Rellene el volumen de reacción total deseado en microlitros. Retire los reactivos necesarios del congelador y descongelarlos en hielo. Luego, pipetee las cantidades calculadas de agua, ADN y solución de energía a un lado del tubo de PCR o a una esquina de un pozo en la placa de 384 pozos.Pipetear las cantidades calculadas de proteína y solución de ribosoma al otro lado de un tubo de PCR o a la esquina opuesta de la placa de 384 pozos. Gire durante unos 30 segundos para fusionar los componentes de reacción. Para evitar la evaporación durante los experimentos con lectores de placas, agregue 35 microlitros de cera líquida y selle la placa con un sellador transparente.Incubar durante un mínimo de tres horas a 37 grados centígrados. Para la lectura en un lector de placas, mida la intensidad de la florescencia en la longitud de onda requerida cada dos minutos. La sobreexpresión exitosa en todas las cepas individuales utilizadas posteriormente para la preparación de la proteína OnePot se muestra aquí.La composición general de la solución final de proteína OnePot PURE fue analizada por la página SDS. Es notable que EFTU está presente en una concentración más alta en comparación con las otras proteínas, como se esperaba. Los rendimientos de síntesis de la solución de proteína OnePot combinada con los ribosomas marcados o no marcados con His se analizaron mediante el monitoreo de la fluorescencia de eGFP a lo largo del tiempo.Los niveles de expresión de tres proteínas diferentes etiquetadas utilizando el sistema de etiquetado in vitro de ARNt de lista verde, o tinción de Kumasi, se analizaron en un gel de página SDS. Para un sistema PURE funcional, es absolutamente crítico que todas las cepas expresen bien sus respectivas proteínas. Esta técnica facilita la implementación del sistema PURE a la ingeniería de sistemas biológicos, permitiendo el desarrollo de nuevas redes genéticas, diagnósticos moleculares, terapéuticos y kits educativos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioingeniería

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La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

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Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

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