Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 Grant 723106, ett schweiziskt nationellt vetenskapsstiftelse (182019) och EPFL.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PURE+technology.">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).</li><li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li><li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli.">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).</li><li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Protokollet som presenteras här beskriver en enkel, tids- och kostnadseffektiv metod för att förbereda ett mångsidigt PURE-uttryckssystem20 baserat på standardkompositionen15. Genom att använda protokollet tillsammans med de medföljande dagliga schemana(tabell 1)kan alla komponenter beredas på 1 vecka och ge tillräckligt med avkastning för upp till femhundra 10 μL PURE-reaktioner. Eftersom de proteiner som används i detta protokoll är överuttryckta från högkopierade plasmider och har låg toxicitet för E. coli, observeras goda uttrycksnivåer för alla nödvändiga proteiner (figur 1). Detta möjliggör enkel justering av stammar, och därför också proteinkomposition i kokulturer, helt enkelt genom att ändra förhållandet mellan inokuleringsstammarna20. Förutom ribosomproteinerna visade sig koncentrationen av EF-Tu vara av grundläggande betydelse för uttrycksutbytet6. Däremot hade förändringar i koncentrationen av de andra proteinkomponenterna en relativt låg inverkan på robustheten hos PURE-systemet7,24. Genom att justera inokuleringsförhållandet för EF-Tu med avseende på alla andra komponenter kan därför en jämförbar sammansättning med standard PURE-kompositionen uppnås, och ett PURE-system med liknande avkastning20 kan uppnås. Vid beredningen av proteinlösningen är det viktigt att se till att alla stammar växer bra och överuttrycker det kodade proteinet efter induktion (figur 1).
Ribosomfunktionen är nyckeln till den totala prestandan hos PURE-systemet24. I detta protokoll demonstreras två olika metoder för att förbereda ribosomlösningen, det vill säga taggfri och his-märkt ribosomrening. Den taggfria ribosomreningen är baserad på hydrofob interaktionskromatografi följt av centrifugering med en sackaroskudde, vilket kräver tillgång till ett FPLC-reningssystem och en ultracentrifuge15. Däremot kräver metoden som använder his-märkta ribosomer18 och gravitationsflöde affinitetskromatografirening inte specialiserad utrustning och kan utföras i de flesta laboratorier. Den senare metoden medför därför fördelar som enkelhet och tillgänglighet. Vi observerade dock ett betydligt lägre syntesutbyte när vi använde his-märkta ribosomer i OnePot PURE jämfört med den taggfria varianten (figur 3). Baserat på typen av applikation kan denna lägre avkastning vara acceptabel.
Energilösningen ger de komponenter med låg molekylvikt och tRNA som krävs för att driva TX-TL-reaktioner in vitro. Detta protokoll ger ett recept på en typisk energilösning, som enkelt kan justeras baserat på användarnas behov. Tillsammans med tRNA, NTP och kreatinfosfat har överflöd och koncentration av Mg2 + joner varit avgörande för den totala prestandan hos PURE-systemet8, eftersom de är kritiska kofaktorer för transkription och översättning. I vissa fall kan titrering av joner därför kraftigt förbättra den totala PURE-prestandan. DNA-integritet är avgörande för PURE-prestanda. Således sekvens verifierar promotorn regionen, ribosom bindande plats och mål gen och se till att en adekvat DNA-koncentration (<2 nM) hjälper till att felsöka problem som kan uppstå när du ställer in en REN reaktion.
PURE-systemet är ett minimalt TX-TL-system, och specifika applikationer kan därför kräva ytterligare justeringar25. Dessa kan inkludera att innehålla olika RNA-polymeraser9,26,förkläden13och proteinfaktorer som EF-P eller ArfA8. Även om uttrycksstammarna för dessa proteiner kan inkluderas i kokulturerna, kan tillsats av dem separat till det beredda systemet ge bättre kontroll över de nödvändiga proteinnivåerna. Dessutom är införandet av blåsor avgörande för produktionen av membranproteiner10,11. Oxidera snarare än att minska miljöer och en disulfidbindning isomeras underlättar korrekt disulfidbindningsbildning, vilket till exempel krävs för sekretoriska proteiner12.
Det är viktigt att se till att eventuella ytterligare komponenter inte stör reaktionen. De viktigaste faktorerna att vara uppmärksam på när du ställer in en reaktion eller lägger till andra komponenter listas nedan. Se till att varken inkompatibla buffertar används eller att jonkoncentrationerna störs. Undvik lösningar som innehåller glycerol, höga koncentrationer av kalium, magnesium, kalciumjoner, osmolyter, pyrofosfat, antibiotika eller EDTA, så mycket som möjligt. Att till exempel ersätta en elutionsbuffert med vatten under DNA-rening kan vara fördelaktigt eftersom EDTA är en vanlig tillsats i denna buffert. Att förse lösningarna med ytterligare negativt laddade molekyler som NTP eller dNTP kräver att man justerar magnesiumkoncentrationen8, eftersom de negativt laddade molekylerna beter sig som kelaterande medel och binder positivt laddade molekyler. Ett neutralt pH-värdet är idealiskt för reaktionen. Alla komponenter bör därför buffras till motsvarande pH- Detta är särskilt viktigt för mycket sura eller grundläggande molekyler som NTPs. Slutligen är temperatur och volym viktiga parametrar för reaktionen. För att uppnå ett bra utbyte bör man införa en temperatur runt 37 °C, eftersom temperaturer under 34 °C avsevärt kommer att minska avkastningen27.
Det är relevant att notera att innan man förbereder OnePot PURE bör man överväga målapplikationen och tillhörande krav, såsom volym, renhet, enkel modifiering och införande eller utelämnande av komponenter. För många applikationer kommer systemet att vara ett utmärkt val, men andra kan kräva avkastning, justerbarhet och andra faktorer, som OnePot-systemet inte kan tillhandahålla. Oavsett kommer det införda protokollet att vara fördelaktigt för utarbetandet av alla hemgjorda system, eftersom alla kritiska steg för sådan förberedelse sammanfattas här.
En av de främsta fördelarna med OnePot-systemet är dess kompatibilitet med det kommersiellt tillgängliga PURExpress-systemet, vilket ger möjlighet att testa funktionaliteten och integriteten hos alla komponenter separat genom att sekventiellt ersätta varje PURExpress-komponent med sin OnePot-motsvarighet. Fördelarna med OnePot PURE-systemet, såsom tunability och enkel, snabb och kostnadseffektiv förberedelse, kommer att göra cellfri TX-TL tillgänglig för fler laboratorier över hela världen och bidra till att utöka implementeringen av denna kraftfulla plattform inom cellfri syntetisk biologi.

Cellfria TX-TL-system (Transcription-Translation) utgör en lovande plattform för att undersöka och konstruera biologiska system. De ger förenklade och tunable reaktionsförhållanden, eftersom de inte längre förlitar sig på livsuppehållande processer, inklusive tillväxt, homeostas eller regleringsmekanismer1. Således förväntas det att cellfria system kommer att bidra till undersökningen av biomolekylära system, erbjuda en ram för att testa rationella biodesignstrategier2och tillhandahålla ett chassi för en framtida syntetisk cell3,4. Det helt rekombinanta PURE-systemet erbjuder ett särskilt tilltalande chassi på grund av dess definierade och minimala sammansättning, liksom dess justerbarhet och justerbarhet5.
Sedan det första funktionella, helt rekombinanta PURE-systemet inrättades 20015har ansträngningar gjorts för att utöka systemgränserna och optimera systemets sammansättning för att förbättra systemets utbyten6,7,8, möjliggöra transkriptionsreglering9,membran10,11 och sekretorisk proteinsyntes12, och för att underlätta proteinvikning13,14 . Numera finns det tre kommersiellt tillgängliga system: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) och Magic PURE (Creative Biolabs). Dessa system är dock kostsamma, deras exakta sammansättning är proprietär och därmed okänd, och anpassningsförmågan är begränsad.
PURE-system som utarbetats internt visade sig vara det mest kostnadseffektiva och tunable alternativet15,16. De nödvändiga 37 reningsstegen för protein och ribosomfraktioner är dock tidskrävande och tråkiga. Flera försök har gjorts för att förbättra effektiviteten hos PURE-systemberedningen17,18,19. Vi visade nyligen att det är möjligt att kokultur och samrena alla nödvändiga icke-ribosomala proteiner som finns i PURE-systemet. Denna OnePot-metod har visat sig vara kostnadseffektiv och tidseffektiv, vilket minskar förberedelsetiden från flera veckor till 3 arbetsdagar. Tillvägagångssättet genererar ett PURE-system med en proteinproduktionskapacitet jämförbar med det kommersiellt tillgängliga PURExpress-systemet20. I motsats till de tidigare metoderna för att förenkla PURE-preparatet17,18,19, i OnePot-metoden uttrycks alla proteiner fortfarande i separata stammar. Detta gör det möjligt för användaren att justera sammansättningen av OnePot PURE-systemet genom att bara utelämna eller lägga till specifika stammar eller justera inokuleringsvolymerna, vilket genererar avhopp PURE-system eller ändra de slutliga proteinkvoterna.
Protokollet som presenteras här ger en detaljerad metod för att skapa OnePot PURE-systemet som beskrivits tidigare20, även om β-mercaptoethanol ersattes med tris (2-karboxytyl)fosfin (TCEP). Dessutom beskrivs två metoder för ribosomrening: traditionell taggfri ribosomrening med hydrofobisk interaktion och sackaroskudde, anpassad från Shimizu et al.15, och Ni-NTA ribosomrening baserad på Wang et al.18 och Ederth et al.21 men väsentligt modifierad. Den senare metoden underlättar ytterligare beredningen av PURE-systemet och gör den tillgänglig för fler laboratorier, eftersom endast standard laboratorieutrustning krävs.
Det experimentella protokollet sammanfattar beredningen av ett mångsidigt PURE-cellfritt TX-TL-system för att tillhandahålla en enkel, tunable, kostnadseffektiv cellfri plattform, som kan förberedas med standard laboratorieutrustning inom en vecka. Förutom att införa standard PURE-kompositionen anger vi hur och var den kan justeras, med ett primärt fokus på kritiska steg i protokollet för att säkerställa systemets funktionalitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

Det definierade PURE (proteinsyntesen med hjälp av rekombinanta element) transkriptionsöversättningssystem ger ett tilltalande chassi för cellfri syntetisk biologi. Tyvärr är kommersiellt tillgängliga system kostsamma, och deras bedövningsförmåga är begränsad. I jämförelse kan en hemgjord metod anpassas baserat på användarnas behov. Beredningen av hemgjorda system är dock tidskrävande och mödosam på grund av behovet av ribosomer samt 36 medelstora proteinreningar. Effektivisering av proteinrening genom kokulturering och samrening gör det möjligt att minimera tids- och arbetskraven. Här presenterar vi en enkel, justerbar, tids- och kostnadseffektiv metod för att producera alla PURE-systemkomponenter inom 1 vecka, med hjälp av standard laboratorieutrustning. Dessutom är OnePot PURE:s prestanda jämförbar med kommersiellt tillgängliga system. OnePot PURE-beredningsmetoden utökar tillgängligheten till PURE-systemet till fler laboratorier på grund av dess enkelhet och kostnadseffektivitet.

Ovanstående protokoll är utformat för att underlätta upprättandet av PURE-cellfria TX-TL-systemet i alla laboratorier. Protokollet innehåller en detaljerad beskrivning av beredningen av de tre distinkta delarna av PURE-systemet: OnePot-proteinet, ribosomen och energilösningen. Ett detaljerat dagligt schema som optimerar arbetsflödet visas i tabell 1. Arbetsflödet är optimerat för rening av his-märkta ribosomer, och tidsramarna kan skilja sig något om taggfri ribosomrening utförs. Ett preparat ger en tillräcklig mängd PURE för minst femhundra 10 μL reaktioner. Dessutom är de förberedda lösningarna stabila i mer än ett år vid -80 °C och tål flera frys-tina-cykler.
Adekvata överuttrycksnivåer för alla stammar är avgörande för funktionaliteten hos den slutliga proteinlösningen. Figur 1 visar framgångsrik överuttryck i alla 36 enskilda stammar som därefter används för OnePot-proteinpreparatet. Variationen i de över uttryckta proteinernas bandintensiteter inträffade troligen på grund av en förspänning i lastvolymerna på SDS-PAGE-gelen. De förväntade proteinstorlekarna sammanfattas i tabell 2. GlyRS och PheRS består av två underenheter av olika molekylvikter; de återstående 34 proteinerna består av en enda underenhet. Nyckeln till detta protokolls enkelhet och tidseffektivitet är kokulturerings- och samreningssteget (figur 2). OnePot-proteinlösningen framställdes genom att öka förhållandet mellan EF-Tu-stammen med avseende på alla andra uttrycksstammar. Den totala sammansättningen av de slutliga proteinerna analyserades av SDS-PAGE (figur 3A). Från gelerna (körfält 2, 3) märks det att EF-Tu (43,3 kDa) finns i en högre koncentration jämfört med de andra proteinerna, som förväntat. Medan gelén ger en bra första indikation på proteinuttrycksförhållanden, är det svårt att avgöra om och på vilken nivå varje enskilt protein uttrycktes. Därför rekommenderas det starkt att bekräfta överuttryck i varje stam före kokulation, som visas ovan.
E. coli ribosom är en komplex molekylär maskin som består av över 50 enskilda proteinunderenheter23. Ett representativt absorptionsspektrum vid 260 nm för taggfri ribosomrening visas i figur 4. den tredje toppen är karakteristisk för framgångsrik ribosom elution. För båda ribosomreningsmetoderna observerades det förväntade körmönstret på SDS-PAGE-gelen (figur 3A)18. Vi observerade föroreningar för båda reningarna, om än i små mängder (<10%). Noterbart var att olika föroreningar fanns i de taggfria (körfält 5, 6) och His-märkta (körfält 11, 12) ribosomer på grund av variationen i metoden. Som användarreferens ingår även SDS-PAGE-gelerna för de kombinerade systemen (körfälten 8, 9 och 14, 15).
Slutligen jämförs de förberedda systemens prestanda (figur 3) med hjälp av de olika ribosomvarianterna. Tidskurserna för in vitro eGFP-uttryck visar att båda PURE-systemen är funktionella och producerar fluorescerande eGFP. OnePot-proteinlösningen i kombination med his-märkta ribosomer, med hjälp av ribosomkoncentrationen optimerad genom titrering, gav dock endast en tredjedel av uttrycksnivån för den icke-märkta ribosomversionen (figur 3B). Liknande resultat observerades när tre proteiner av olika storlekar uttrycktes och märktes med hjälp av Green Lys tRNA in vitro-märkningssystem (figur 3C). Som ses på fluorescerande gel, fullängdsprodukter uttrycktes framgångsrikt i båda systemen; Emellertid uppnåddes endast omkring halvan av uttrycksnivån med His-tag ribosomsystemet. Förutom fluorescensmärkningen kan de förväntade banden för alla tre proteinerna särskiljas på en Coomassie-betsad gel (figur 3D). Resultaten visar att det introducerade uttryckssystemet, som kan förberedas inom en vecka i ett laboratorium med standardutrustning, kan användas för in vitro-uttryck av proteiner som kodas nedströms T7-promotorn från linjära mallar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Figur 1: Representativa resultat för överuttryckstestet för alla uttrycksstammar i PURE-systemet. RENA proteinnummer och storlekar sammanfattas i tabell 2. Proteinnummer 21, 24 och 27 är markerade med en stjärna för bättre visualisering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Figur 2: OnePot proteinrening. Den schematiska skildringen och motsvarande fotografier av alla steg som är involverade i produktionen av OnePot-proteinlösningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Figur 3: Prestanda hos de beredda systemen med hjälp av de olika ribosomvarianterna. (A) Coomassie blåbetsade SDS-PAGE-geler i OnePot-proteinlösningen (körfält 2, 3), taggfria ribosomer utan proteinlösning (körfält 5, 6) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning (körfält 11, 12) och med proteinlösning (körfält 8, 9), hismärkta ribosomer utan proteinlösning Två olika koncentrationer laddades per prov. (B) Jämförelse av eGFP-uttryck av his-märkta ribosomer och taggfria ribosomer. Fluorescensintensiteten hos eGFP-uttrycket in vitro övervakas över tid för en PURE-reaktion med hjälp av taggfria ribosomer (1,8 μM, blå) och hismärkta ribosomer (0,62 μM, röd). Koncentrationerna av den linjära mallen och OnePot proteinlösningen var 4 nM respektive 2 mg/mL. Panelerna (C) och (D) visar SDS-PAGE-gelen av proteiner syntetiserade i OnePot med taggfria (1,8 μM, blå, körfält 3, 4, 5) och his-tag ribosomer (0,62 μM, röd, körfält 6, 7, 8) märkta med en GreenLys in vitro-märkningssats (C) och färgade med Coomassie blue (D). De svarta pilarna indikerar de förväntade banden av syntetiserade proteiner: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Den linjära mallen och OnePot protein lösning koncentrationer var 4 nM respektive 1,6 mg/mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Figur 4: Absorbansspektra vid 260 nm. Representativa resultat av absorbansspektra vid 260 nm under hydrofobisk interaktionsrening av taggfria ribosomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Tabell 1: Ett dagligt tidsoptimerat schema för utarbetandet av alla OnePot PURE-lösningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tabell 2: PURE proteinlista <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tilläggstabell 1: Reagenser. Tabellen innehåller en förteckning över koncentrationer, volymer och andra specifika uppgifter om de reagenser och komponenter som använts under denna studie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tilläggstabell 2: Buffertar. Kalkylbladet listar de exakta buffertkompositionerna för protein, taggfri ribosom och his-tag ribosomrening, liksom koncentrationerna av de lagerlösningar som används för deras beredning. Dessutom beräknas de nödvändiga mängderna komponenter baserat på buffertvolymen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tilläggstabell 3: Beräkningar av aminosyror. Kalkylbladet listar aminosyrorna och deras rekommenderade lagerlösningskoncentrationer som krävs för energilösningen. Den beräknar mängden vatten som ska tillsättas till varje aminosyra baserat på den faktiska vägda massan, och beräknar också volymen av aminosyralösningen som ska tillsättas till den slutliga aminosyrablandningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tilläggstabell 4: Lagerlösningar för energilösningen. I tabellen anges de koncentrationer och volymer av lagerlösningar som behövs för energilösningen och ytterligare detaljer, inklusive lagringsförhållanden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tilläggstabell 5: Energilösning. Tabellen innehåller en förteckning över energilösningskomponenterna och deras rekommenderade koncentrationer. Dessutom beräknar den att deras erforderliga volymer ska läggas till den slutliga lösningen baserat på deras koncentrationer av stamlösningar och energilösningens volym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tilläggstabell 6: PCR. Tabellen listar sekvenser och koncentrationer av primers som används för förlängning PCR och indikerar smälttemperaturer och termocykelsteg optimerade för ett DNA-polymeras med hög återgivning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tilläggstabell 7: REN reaktion. Kalkylbladet visar en exempelinställning av en PURE-reaktion. Den listar de använda koncentrationerna och volymerna av komponenterna för en PURE-reaktion med hjälp av taggfria ribosomer eller his-tag ribosomer. Dessutom beräknar den volymkvoterna för protein och ribosomtiteriter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

OnePot PURE Cell-Free System

Vi presenterar en snabb och kostnadseffektiv metod för att producera det rekombinanta PURE cellfria TX-TL-systemet med hjälp av standard laboratorieutrustning.

OnePot PURE cellfritt system

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Detta protokoll för ett rekombinant cellfritt proteinuttryckssystem, allmänt känt som PURE-systemet, använder cellodling och cellrening för att effektivisera de nödvändiga proteinreningarna. Detta minimerar avsevärt tids- och arbetskraven. OnePot-metoden har visat sig inte bara vara kostnadseffektiv utan också tidseffektiv.Det minskar förberedelsetiderna från flera veckor till tre arbetsdagar. Detta gör pure-cellfria plattformen tillgänglig för fler laboratorier över hela världen och hjälper till att implementera denna riktigt kraftfulla plattform för syntetisk cellfri biologi. Innan du börjar, se till att alla stammar över uttrycker sina respektive protein väl.Till att börja med, förbered kolonnen för OnePot-proteinrening enligt beskrivningen i textmanuskriptet med två milliliter Sepharose-harts och ladda sedan kolonnen med nickelsulfat. Förbered startkulturerna genom att kombinera 20 milliliter LB-media med 20 mikroliter ampicillin. Tillsätt 300 mikroliter av mediet i 35 brunnar av en steril 96 djup brunnsplatta.Inokulera var och en av dem med sin respektive stam, förutom töjningsfaktorn termo instabil, eller EFTU, och försegla plattan med ett andningsbart membran. För EFTU-kulturen, inokulera tre milliliter ampicillin som innehåller LB-media i ett 14 milliliter odlingsrör med ett snäpplock. Ungefär tre milliliter EFTU-kultur räcker för en OnePot-uttryckskultur.Inkubera den vid 37 grader Celsius medan du skakar vid 260 rotationer per minut över natten. Nästa dag överför du 500 milliliter LB-media och 500 mikroliter ampicillin till den sterila förbryllade kolven. Inokulera OnePot PURE-kulturen med 1 675 mikroliter eftukulturen och 55 mikroliter av var och en av kulturerna från den djupa brunnsplattan.Inkubera kulturen i två timmar vid 37 grader Celsius med en skakning av 260 rotationer per minut, eller tills kulturens optiska densitet når 0,2 till 0,3. Inducera kulturen med 500 mikroliter på 0,1 millimolar IPTG och växa i ytterligare tre timmar. Skörda cellerna genom centrifugering vid fyra grader Celsius och 3, 220 gånger G i 10 minuter, och lagra cellpelleten vid minus 80 grader Celsius tills vidare användning.På dag tre mäter du de mängder buffertar som behövs för deras rening och tillsätt TCEP till dem alla enligt texten. Förvara de återstående buffertarna utan TCEP vid fyra grader Celsius för framtida reningar. Balansera den laddade kolonnen med 30 milliliter buffert A.När 25 milliliter buffert A har passerat stänger du kolonnen nedifrån.Tina cellerna och använd en serologisk pipett för att återanvända cellpelleten i 7,5 milliliter buffert A.Lyse cellerna med hjälp av en 130 watt sond. Om ultraljudsbehandlingen lyckas blir lösningen mörkare. Se till att hålla cellerna på is och placera sonden tillräckligt djupt utan att röra röret.Ta bort cellskrotet genom centrifugering vid 21, 130 gånger G i 20 minuter vid fyra grader Celsius och håll lysat på is. Lägg till supernatanten i den ekvilibrerade kolumnen. Stäng kolonnen uppifrån och se till att det inte finns något läckage.Inkubera kolonnen i tre timmar vid fyra grader Celsius under rotation med hjälp av en rörrotator. Elute obundna komponenter från kolonnen och tvätta med 25 milliliter buffert A.Tvätta kolonnen med 25 milliliter 25 millimolar imidazolbuffert. Elute proteinerna med fem milliliter av 450 millimolar imidazol buffert och håll de eluterade proteinerna på is hela tiden.Späd eluatet med 25 ml HT-buffert och håll blandningen på is. Tillsätt 15 milliliter till ett 15 ml centrifugalfilter och koncentrera till en volym av 1,5 milliliter. Tillsätt de återstående 15 milliliterna till filtret med den koncentrerade lösningen och koncentrera dig till 1,5 ml igen.Tillsätt 10 ml HT-buffert till det koncentrerade provet och koncentrera till en milliliter. Återvinn det koncentrerade provet och tillsätt en lika stor mängd lagerbuffert B och förvara vid minus 80 grader Celsius tills vidare. Återställ kolumnen enligt texten under buffertutbytet.På dag fyra, mät proteinkoncentrationen med Bradford-analysen. Koncentrera provet med 0,5 milliliter tre kilodalton cutoff centrifugalfilter till 20 milligram per milliliter. Verifiera OnePot PURE-proteinkompositionen med SDS-sidan.Späd 2,5 mikroliter av provet med 7,5 mikroliter vatten blandat med 10 mikroliter av två X Laemmli-buffert och ladda sedan fem mikroliter och 2,5 mikroliter av proverna på gelén. Kör SDS-sidan enligt texten. Fyll i koncentrationen och längden på DNA i motsvarande gula celler i kalkylbladet med hjälp av två till tio nanomolar DNA för reaktionen.Fyll i önskad total reaktionsvolym i mikroliter. Ta ut de reagenser som krävs från frysen och tina dem på is. Pipettera sedan de beräknade mängderna vatten, DNA och energilösning på ena sidan av PCR-röret eller ett hörn av en brunn på 384-brunnsplattan.Pipettera de beräknade mängderna protein och ribosomlösning på andra sidan av ett PCR-rör eller det motsatta hörnet av 384-brunnsplattan. Snurra i ca 30 sekunder för att slå samman reaktionskomponenterna. För att förhindra avdunstning under plattläsarexperiment, tillsätt 35 mikroliter flytande vax och försegla plattan med ett genomskinligt tätningsmedel.Inkubera i minst tre timmar vid 37 grader Celsius. För avläsning på en plattläsare, mät florescenceintensiteten vid önskad våglängd varannan minut. Framgångsrik överuttryck i alla enskilda stammar som därefter används för OnePot proteinpreparat visas här.Den totala sammansättningen av den slutliga OnePot PURE-proteinlösningen analyserades av SDS-sidan. Det märks att EFTU finns i en högre koncentration jämfört med de andra proteinerna, som förväntat. Syntesutbytena av OnePot proteinlösningen i kombination med his-märkta eller icke-taggade ribosomer analyserades genom övervakning av eGFP fluorescens över tid.Uttrycksnivåerna för tre olika proteiner märkta med hjälp av den gröna listan tRNA in vitro märkningssystem, eller Kumasi färgning, analyserades på en SDS sida gel. För ett funktionellt PURE-system är det helt avgörande att alla stammar uttrycker sina respektive proteiner väl. Denna teknik underlättar implementeringen av PURE-systemet till biologisk systemteknik, vilket möjliggör utveckling av nya genetiska nätverk, molekylär diagnostik, terapier och utbildningssatser.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; identifiering med elektrokemiska sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Inkapsling av Cellfritt Transkription och översättning Maskiner i vesiklar för uppförande av Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Förslutningsbar Femtoliter Chamber arrayer för Cellfri biologi

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntesen av infektiös bakteriofager i en E. coli -baserade Cell-free uttryck systemet

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital skakar kultur av däggdjursceller i O-formade fartyg att producera enhetliga aggregat

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellfria Protein uttryck med den snabbt växande bakterien Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Förbereda proteinproducerande syntetiska celler med cellfria bakterieextrakt, liposomer och emulsion överföring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Mätning av 3D In-vivo Shoulder Kinemas med biplanar videoradiografi

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Snabba, enzymatiska metoder för förstärkning av minimala, linjära mallar för proteinprototyper med cellfria system

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...