Name: onepot pure cell-free system
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı Grant 723106, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibesi (182019) ve EPFL kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).</li><li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+systems:+a+proving+ground+for+rational+biodesign.">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).</li><li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalizing+cell-free+systems:+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond.">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li><li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells.">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system.">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).</li><li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system.">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+(PURE)+system.">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), 1327006 (2017).</li><li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system.">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li><li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins.">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PURE+technology.">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).</li><li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display.">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li><li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery.">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li><li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis.">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li><li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module.">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li><li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli.">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).</li><li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system.">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).</li><li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes.">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).</li><li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state.">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li><li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+partially+self-regenerating+synthetic+cell.">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).</li></ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada sunulan protokol, standart bileşime dayalı çok yönlü bir PURE ifade sistemi20 hazırlamak için basit, zaman ve uygun maliyetli bir yöntemi açıklar15. Protokolün sağlanan günlük programlarla birlikte kullanılmasıyla (Tablo 1), tüm bileşenler 1 hafta içinde hazırlanabilir ve beş yüz 10 μL PURE reaksiyona kadar yeterli verim miktarları. Bu protokolde kullanılan proteinler yüksek kopya plazmidlerden fazla ifade edildiğinden ve E. coli'yedüşük toksisiteye sahip olduğundan, gerekli tüm proteinler için iyi ifade seviyeleri gözlenir (Şekil 1). Bu, suşların kolay ayarlanmasına ve dolayısıyla sadece aşılama suşlarının oranlarını değiştirerek kokültürlerde protein bileşimine izin verir20. Ribozomal proteinlerin yanı sıra, EF-Tu konsantrasyonunun ifade için temel öneme sahip olduğu göstermiştir6. Buna karşılık, diğer protein bileşenlerinin konsantrasyonundaki değişiklikler PURE sisteminin sağlamlığı üzerinde nispeten düşük bir etkiye sahipti7,24. Bu nedenle, EF-Tu'nun diğer tüm bileşenlerle ilgili aşılama oranını ayarlayarak, standart PURE bileşimi ile karşılaştırılabilir bir bileşim elde edilebilir ve benzer verim20'ye sahip bir PURE sistemi elde edilebilir. Protein çözeltisinin hazırlanmasında, tüm suşların iyi büyümesini sağlamak ve indüksiyondan sonra kodlanmış proteini aşırı ifade etmek çok önemlidir (Şekil 1).
Ribozom fonksiyonu PURE sisteminin genel performansı için anahtardır24. Bu protokolde ribozom çözeltisini hazırlamak için etiketsiz ve His etiketli ribozom saflaştırma olmak üzere iki farklı yöntem gösterilmiştir. Etiketsiz ribozom saflaştırma, hidrofobik etkileşim kromatografisine ve ardından bir FPLC arıtma sistemine ve ultracentrifuge15'eerişim gerektiren sakkaroz yastığı ile santrifüjlemeye dayanır. Buna karşılık, His etiketli ribozomlar18 ve yerçekimi akış benzeşimi kromatografisi saflaştırmasını kullanan yöntem özel ekipman gerektirmez ve çoğu laboratuvarda yapılabilir. Bu nedenle, ikinci yöntem basitlik ve erişilebilirlik gibi avantajlar getirir. Bununla birlikte, OnePot PURE'daki His etiketli ribozomları etiketsiz varyanta kıyasla kullanırken önemli ölçüde daha düşük bir sentez verimi gözlemledik (Şekil 3). Uygulama türüne bağlı olarak, bu düşük verim kabul edilebilir olabilir.
Enerji çözümü, in vitro TX-TL reaksiyonlarını körüklemek için gereken düşük moleküler ağırlıklı bileşenleri ve tRNA'ları sağlar. Bu protokol, kullanıcı ihtiyaçlarına göre kolayca ayarlanabilen tipik bir enerji çözümü için bir reçete sağlar. tRNA, NTP ve kreatin fosfat ile birlikte, Mg2+ iyonlarının bolluğu ve konsantrasyonu PURE sisteminin genel performansı için çok önemli olmuştur8, transkripsiyon ve çeviri için kritik kofaktörler oldukları için. Bazı durumlarda, iyonların titrasyonu, bu nedenle genel PURE performansını büyük ölçüde artırabilir. DNA bütünlüğü PURE performansı için çok önemlidir. Bu nedenle, promotör bölgesini, ribozom bağlama bölgesini ve hedef geni doğrulamak ve yeterli bir DNA konsantrasyonu (<2 nM) sağlamak, PURE reaksiyonu kurarken ortaya çıkabilecek sorunları gidermeye yardımcı olacaktır.
PURE sistemi minimum bir TX-TL sistemidir ve bu nedenle belirli uygulamalar ek ayarlamalar gerektirebilir25. Bunlar farklı RNA polimerazları9,26,refakatçiler13ve EF-P veya ArfA8gibi protein faktörlerini dahil etmeyi içerebilir. Bu proteinler için ifade suşları kokültürlere dahil edilebilse de, bunları hazırlanan sisteme ayrı ayrı eklemek gerekli protein seviyelerinin daha iyi kontrol etmesini sağlayabilir. Ayrıca, veziklinlerin dahil edilmesi membran proteinlerinin üretimi için gereklidir10,11. Ortamları azaltmak yerine oksitleyici ve disülfid bir bağ isomerase, örneğin salgı proteinleri için gerekli olan uygun disülfid bağ oluşumunu kolaylaştırır12.
Herhangi bir ek bileşenin reaksiyona müdahale etmemesini sağlamak önemlidir. Reaksiyon kurarken veya başka bileşenler eklerken dikkat etmesi gereken en önemli faktörler aşağıda listelenmiştir. Uyumsuz tamponların kullanılmadığından veya iyon konsantrasyonlarının bozulmadığından emin olun. Gliserol, yüksek potasyum, magnezyum, kalsiyum iyonları, ozmolitler, pirofosfat, antibiyotikler veya EDTA içeren çözeltilerden mümkün olduğunca kaçının. Örneğin, DNA saflaştırması sırasında bir elüasyon tamponu su ile değiştirmek, EDTA bu tamponda yaygın bir katkı maddesi olduğu için faydalı olabilir. Çözeltilere NTP veya dNTP gibi ek negatif yüklü moleküller sağlamak, magnezyum konsantrasyonunu ayarlamayı gerektirir8Negatif yüklü moleküller şelatlama ajanları gibi davrandığından ve pozitif yüklü molekülleri bağladıklarından. Nötr bir pH reaksiyon için idealdir. Buna göre, tüm bileşenler ilgili pH'a tamponlanmalıdır; Bu özellikle NTP'ler gibi yüksek asidik veya temel moleküller için önemlidir. İyi bir verim elde etmek için, 34 ° C'nin altındaki sıcaklıklar verimi önemli ölçüde azaltacağından,37° C civarında bir sıcaklık uygulanmalıdır.
OnePot PURE'ı hazırlamadan önce, hedef uygulamayı ve hacim, saflık, değişiklik kolaylığı ve bileşenlerin dahil edilmesi veya ihmal edilmesi gibi ilgili gereksinimleri göz önünde bulundurmak gerekir. Birçok uygulama için sistem mükemmel bir seçim olacaktır, ancak diğerleri OnePot sisteminin sağlayamadığı verim, ayarlanabilirlik ve diğer faktörleri gerektirebilir. Ne olursa olsun, tanıtılan protokol herhangi bir ev yapımı sistemin hazırlanması için faydalı olacaktır, çünkü bu tür bir hazırlık için tüm kritik adımlar burada özetlenmiştir.
OnePot sisteminin ana avantajlarından biri, her PURExpress bileşenini OnePot eşdeğeriyle sırayla değiştirerek tüm bileşenlerin işlevselliğini ve bütünlüğünü ayrı ayrı test etme imkanı sağlayan ticari olarak kullanılabilen PURExpress sistemiyle uyumluluğudur. OnePot PURE sisteminin kolay, hızlı ve uygun maliyetli hazırlık gibi avantajları, hücresiz TX-TL'yi dünya çapında daha fazla laboratuvar için erişilebilir hale getirecek ve bu güçlü platformun hücresiz sentetik biyolojide uygulanmasının genişletilmesine katkıda bulunacaktır.

Hücresiz transkripsiyon-çeviri (TX-TL) sistemleri biyolojik sistemlerin araştırılması ve mühendisliği için umut verici bir platform oluşturmaktadır. Artık büyüme, homeostaz veya düzenleyici mekanizmalar da dahil olmak üzere yaşamı sürdüren süreçlere güvenmedikleri için basitleştirilmiş ve ayarlanabilir reaksiyon koşulları sağlarlar1. Bu nedenle, hücresiz sistemlerin biyomoleküler sistemlerin araştırılmasına katkıda bulunacağı, rasyonel biyodesarma stratejilerini test etmek için bir çerçeve sunacağı2ve gelecekteki bir sentetik hücre için bir şasi sağlayacağı öngörülmektedir3,4. Tamamen rekombinant PURE sistemi, tanımlanmış ve minimum bileşiminin yanı sıra ayarlanabilirliği ve ayarlanabilirliği nedeniyle özellikle çekici bir şasi sunar5.
İlk işlevsel, tamamen rekombinant PURE sistemi kurulduğundan beri 20015, sistem sınırlarını genişletmek ve sistem verimini iyileştirmek için sistemin bileşimini optimize etmek için çaba sarf edilmiştir6,7,8,transkripsiyonel düzenleme9için izin 9 , membran10,11 ve salgı protein sentezi12, ve protein katlama kolaylaştırmak için13,14 . Günümüzde piyasada bulunan üç sistem vardır: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) ve Magic PURE (Creative Biolabs). Bununla birlikte, bu sistemler maliyetlidir, tam bileşimleri tescillidir ve bu nedenle bilinmemektedir ve uyarlanabilirlik sınırlıdır.
Şirket içinde hazırlanan PURE sistemlerin en uygun maliyetli ve ayarlanabilir seçenek olduğu kanıtlanmıştır15,16. Bununla birlikte, protein ve ribozom fraksiyonları için gerekli 37 saflaştırma adımı zaman alıcı ve sıkıcıdır. PURE sistem hazırlığının verimliliğini artırmak için çeşitli girişimlerde bulunulmuş17,18,19. Yakın zamanda PURE sisteminde bulunan gerekli tüm ribozomal olmayan proteinleri birlikte şekillendirmenin ve birlikte saflaştırmanın mümkün olduğunu gösterdik. Bu OnePot yöntemi, uygun maliyetli ve zaman verimli olduğunu kanıtlamıştır ve hazırlık süresini birkaç haftadan 3 iş gününe düşürüp azaltmıştır. Yaklaşım, piyasada bulunan PURExpress sistemi20ile karşılaştırılabilir bir protein üretim kapasitesine sahip bir PURE sistemi oluşturur. PURE preparatını basitleştirmek için önceki yaklaşımların aksine17,18,19, OnePot yaklaşımında tüm proteinler hala ayrı suşlarla ifade edilir. Bu, kullanıcının OnePot PURE sisteminin bileşimini yalnızca belirli suşları atlayarak veya ekleyerek veya aşı hacimlerini ayarlayarak, böylece sırasıyla terk PURE sistemleri oluşturarak veya nihai protein oranlarını değiştirerek ayarlamasını sağlar.
Burada sunulan protokol, onepot PURE sistemini oluşturmak için daha önce açıklandığı gibi ayrıntılı bir yöntem sağlar20β-mercaptoethanol tris (2-karboksitil)fosfin (TCEP) ile değiştirildi. Ayrıca, ribozom saflaştırma için iki yöntem tanımlanmıştır: hidrofobik etkileşim ve sakkaroz yastığı kullanılarak geleneksel etiketsiz ribozom saflaştırma, Shimizu ve ark.15'tenuyarlanmış ve Wang ve ark. 18 ve Ederth ve ark.21'e dayananNi-NTA ribozom saflaştırması, ancak önemli ölçüde değiştirilmiştir. İkinci yöntem, PURE sisteminin hazırlanmasını daha da kolaylaştırır ve sadece standart laboratuvar ekipmanı gerektiğinden daha fazla laboratuvar için erişilebilir hale getirir.
Deneysel protokol, bir hafta içinde standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak hazırlanabilen basit, ayarlanabilir, uygun maliyetli bir hücresiz platform sağlamak için çok yönlü bir PURE hücresiz TX-TL sisteminin hazırlanmasını özetliyor. Standart PURE bileşimini tanıtmanın yanı sıra, sistemin işlevselliğini sağlamak için protokoldeki kritik adımlara odaklanarak nasıl ve nerede ayarlanabileceğini belirtiyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>525-0304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene DeepWell plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>260252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>222140010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09718-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC5928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy&#160;sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes polycarbonate</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill-out Liquid Wax</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>CHO1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-25 (Capped)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>ZYM-D4034-200TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>SantaCruz Biotech</td>
			<td>sc-29089B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03609-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International / Eppendorf</td>
			<td>525-0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass</td>
			<td>Scilabware</td>
			<td>9141173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L5001</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Butyl HP Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28411005</td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0921-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21149.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer (2x), sample buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) media</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>63020-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>15414469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress&#160;&#916;&#160;Ribosome Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E3313S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseA solution</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SealPlate&#160;film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>Z369659-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547-10X1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Optima L-80</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>purification of tag free ribosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman GD/X syringe filters</td>
			<td>GE Whatman</td>
			<td>WHA68722504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

onepot pure cell-free system

Tanımlanan PURE (rekombinant elementler kullanılarak protein sentezi) transkripsiyon-çeviri sistemi, hücresiz sentetik biyoloji için çekici bir şasi sağlar. Ne yazık ki, ticari olarak mevcut sistemler maliyetlidir ve bunların ayarlanabilirliği sınırlıdır. Buna karşılık, ev yapımı bir yaklaşım kullanıcı ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilir. Bununla birlikte, ev yapımı sistemlerin hazırlanması, ribozom ihtiyacının yanı sıra 36 orta ölçekli protein saflaştırması nedeniyle zaman alıcı ve meşakkatlidir. Protein saflaştırmayı birlikte kültüre ederek ve birlikte saflaştırma ile düzene sokmak, zaman ve işçilik gereksinimlerini en aza indirmeyi sağlar. Burada, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanarak tüm PURE sistem bileşenlerini 1 hafta içinde üretmek için kolay, ayarlanabilir, zaman ve uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, OnePot PURE'un performansı ticari olarak kullanılabilen sistemlerle karşılaştırılabilir. OnePot PURE hazırlama yöntemi, basitliği ve maliyet etkinliği nedeniyle PURE sisteminin erişilebilirliğini daha fazla laboratuvara genişletir.

Yukarıdaki protokol, PURE hücresiz TX-TL sisteminin herhangi bir laboratuvarda kurulmasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Protokol, PURE sisteminin üç farklı parçasının hazırlanmasının ayrıntılı bir açıklamasını içerir: OnePot proteini, ribozom ve enerji çözeltisi. İş akışını optimize eden ayrıntılı bir günlük zamanlama Tablo 1'de gösterilir. İş akışı, Etiketli ribozomların saflaştırılması için optimize edilmiştir ve etiketsiz ribozom saflaştırması yapılırsa zaman dilimleri biraz farklılık gösterebilir. Bir preparat, en az beş yüz 10 μL reaksiyon için yeterli miktarda SAF sağlar. Ayrıca, hazırlanan çözeltiler -80 ° C'de bir yıldan fazla bir süre stabildir ve birden fazla donma-çözülme döngüsüne dayanabilir.
Tüm suşlar için yeterli aşırı ekspresyon seviyeleri, nihai protein çözeltisinin işlevselliği için çok önemlidir. Şekil 1, OnePot protein hazırlanması için daha sonra kullanılan 36 bireysel suşun hepsinde başarılı bir aşırı ekspresyon göstermektedir. Aşırı eksprese proteinlerin bant yoğunluklarındaki değişim, büyük olasılıkla hacimlerin SDS-PAGE jeline yüklenmesindeki bir önyargı nedeniyle meydana geldi. Beklenen protein boyutları Tablo 2'deözetlenmiştir. GlyRS ve PheRS çeşitli moleküler ağırlıklarda iki alt bireden oluşur; kalan 34 protein tek bir alt birlikten oluşur. Bu protokolün basitliğinin ve zaman etkinliğinin anahtarı, birlikte kültürleme ve birlikte arınma adımıdır (Şekil 2). OnePot protein çözeltisi, EF-Tu suşunun diğer tüm ifade suşlarına göre oranını artırarak hazırlanmıştır. Nihai proteinlerin genel bileşimi SDS-PAGE (Şekil 3A) tarafından analiz edildi. Jellerden (şerit 2, 3), EF-Tu'nun (43.3 kDa) beklendiği gibi diğer proteinlere kıyasla daha yüksek konsantrasyonda mevcut olduğu fark edilir. Jel protein ekspresyon oranlarının iyi bir ilk göstergesini sağlarken, her bir proteinin ifade edilip edilmediğini ve hangi seviyede ifade edildiğini belirlemek zordur. Bu nedenle, yukarıda gösterildiği gibi, birlikte yaşamadan önce her bir suştaki aşırı ifadenin onaylanması şiddetle tavsiye edilir.
E. coli ribozom, 50'den fazla bireysel protein alt bireyi23'tenoluşan karmaşık bir moleküler makinedir. Etiketsiz ribozom saflaştırma için 260 nm'de temsili bir emilim spektrumu Şekil 4'tegösterilmiştir; üçüncü tepe başarılı ribozom elution karakteristiğidir. Her iki ribozom saflaştırma yönteminde de SDS-PAGE jelinde beklenen çalışma düzeni (Şekil 3A)18 gözlenmiştir. Küçük miktarlarda da olsa her iki saflaştırma için kontaminasyon gözlemledik (%<10). Özellikle, etiketsiz (şerit 5, 6) ve His etiketli (şerit 11, 12) ribozomlarda, yöntemdeki değişiklik nedeniyle farklı kirleticiler mevcuttu. Kullanıcı referansı için, birleşik sistemler için SDS-PAGE jelleri de dahildir (şerit 8, 9 ve 14, 15).
Son olarak, farklı ribozom varyantları kullanılarak hazırlanan sistemlerin performansı (Şekil 3) karşılaştırılır. in vitro eGFP ekspresyonunun zaman kursları, her iki PURE sisteminin de işlevsel olduğunu ve floresan eGFP ürettiğini göstermektedir. Bununla birlikte, OnePot protein çözeltisi, titrasyon tarafından optimize edilen ribozom konsantrasyonunu kullanarak His etiketli ribozomlarla birleştiğinde, etiketlenmemiş ribozom versiyonunun ifade seviyesinin sadece üçte birini verdi (Şekil 3B). Benzer sonuçlar, Green Lys tRNA in vitro etiketleme sistemi kullanılarak farklı boyutlarda üç protein ifade edildiğinde ve etiketlendiğinde gözlenmiştir (Şekil 3C). Floresan jelde görüldüğü gibi, tam boy ürünler her iki sistemde de başarıyla ifade edildi; ancak His-tag ribozom sistemi ile ifade seviyesinin sadece yarısına ulaşılmıştır. Floresan etiketlemeye ek olarak, her üç protein için beklenen bantlar Coomassie lekeli bir jel üzerinde ayırt edilebilir (Şekil 3D). Sonuçlar, standart ekipmanlarla bir laboratuvarda bir hafta içinde hazırlanabilen tanıtılan ifade sisteminin, doğrusal şablonlardan T7 promotörünün aşağı akışında kodlanmış proteinlerin in vitro ekspresyonu için kullanılabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> Şekil 1: PURE sisteminin tüm ifade suşları için aşırı ifade testi için temsili sonuçlar. PURE protein sayıları ve boyutları Tablo 2'deözetlenmiştir. Protein sayıları 21, 24 ve 27 daha iyi görselleştirme için bir yıldızla işaretlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> Şekil 2: OnePot protein saflaştırma. OnePot protein çözeltisinin üretiminde yer alan tüm adımların şematik tasviri ve karşılık gelen fotoğrafları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> Şekil 3: Farklı ribozom varyantları kullanılarak hazırlanan sistemlerin performansı. (A) OnePot protein çözeltisinin Coomassie mavisi lekeli SDS-PAGE jelleri (şerit 2, 3), protein çözeltisi olmayan etiketsiz ribozomlar (şerit 5, 6) ve protein çözeltisi (şerit 8, 9), protein çözeltisi olmayan his etiketli ribozomlar (şerit 11, 12) ve protein çözeltisi (şeritler 14, 15). Numune başına iki farklı konsantrasyon yüklendi. (B) Etiketli ribozomların ve etiketsiz ribozomların eGFP ifadesinin karşılaştırılması. İn vitro eGFP ekspresyonunun floresan yoğunluğu, etiketsiz ribozomlar (1,8 μM, mavi) ve His etiketli ribozomlar (0,62 μM, kırmızı) kullanılarak PURE reaksiyonu için zaman içinde izlenir. Doğrusal şablonun ve OnePot protein çözeltisinin konsantrasyonları sırasıyla 4 nM ve 2 mg/mL'ydi. Paneller (C) ve (D) OnePot'ta sentezlenen proteinlerin SDS-PAGE jelini etiketsiz (1,8 μM, mavi, şerit 3, 4, 5) ve His-tag ribozomlar (0.62 μM, kırmızı, şeritler 6, 7, 8) sırasıyla GreenLys in vitro etiketleme kiti (C) ile etiketlenmiş ve Coomassie mavisi (D) ile boyanmıştır. Siyah oklar beklenen sentezlenmiş protein bantlarını gösterir: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Doğrusal şablon ve OnePot protein çözelti konsantrasyonları sırasıyla 4 nM ve 1.6 mg/mL'ydi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> Şekil 4: Absorbans spektrumu 260 nm'de. Etiketsiz ribozomların hidrofobik etkileşim saflaştırılması sırasında 260 nm'de emici spektrumun temsili sonuçları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Tüm OnePot PURE çözümlerinin hazırlanması <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank"></a> için günlük zaman için optimize edilmiş bir program.
Tablo 2: PURE protein listesi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Tablo 1: Reaktifler. Tablo, bu çalışma sırasında kullanılan reaktiflerin ve bileşenlerin konsantrasyonlarını, hacimlerini ve diğer özel ayrıntılarını listeler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Tablo 2: Arabellekler. Elektronik tablo, protein, etiketsiz ribozom ve His-tag ribozom saflaştırmaları için tam tampon bileşimlerini ve bunların hazırlanması için kullanılan stok çözeltilerinin konsantrasyonlarını listeler. Ayrıca, arabellek hacmine göre gerekli bileşen miktarlarını hesaplar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 3: Amino asit hesaplamaları. Elektronik tabloda amino asitler ve enerji çözeltisi için gerekli olan önerilen stok çözeltisi konsantrasyonları listelenmiştir. Her amino aside eklenecek su miktarını gerçek tartılan kütleye göre hesaplar ve ayrıca nihai amino asitlerin karışımına eklenecek amino asit çözeltisinin hacmini hesaplar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Tablo 4: Enerji çözümü için stok çözümleri. Tablo, enerji çözümü için gereken stok çözümlerinin konsantrasyonlarını ve hacimlerini listeler ve depolama koşulları da dahil olmak üzere daha fazla ayrıntıyı gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 5: Enerji çözümü. Tablo, enerji çözeltisi bileşenlerini ve önerilen konsantrasyonlarını listeler. Ek olarak, stok çözelti konsantrasyonlarına ve enerji çözeltisinin hacmine bağlı olarak nihai çözüme eklenmesi gereken hacimlerini hesaplar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Tablo 6: PCR. Tablo, PCR uzantısı için kullanılan astarların dizilerini ve konsantrasyonlarını listeler ve yüksek kaliteli bir DNA polimeraz için optimize edilmiş erime sıcaklıklarını ve termosikler adımları gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Tablo 7: PURE reaksiyonu. Elektronik tablo, PURE reaksiyonunun örnek bir kurulumunu gösterir. Etiketsiz ribozomlar veya His etiketi ribozomları kullanarak PURE reaksiyonu için bileşenlerin kullanılan konsantrasyonlarını ve hacimlerini listeler. Ayrıca, protein ve ribozom titrasyonları için hacim oranlarını hesaplar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about OnePot PURE Cell-Free System at JoVE.com

OnePot PURE Cell-Free System

Standart laboratuvar ekipmanları kullanarak rekombinant PURE hücresiz TX-TL sistemini üretmek için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz.

OnePot PURE Hücresiz Sistem

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Genellikle PURE sistemi olarak bilinen rekombinant hücre içermeyen protein ekspresyon sistemi için bu protokol, gerekli protein saflaştırmalarını kolaylaştırmak için hücre kültleme ve hücre saflaştırmasını kullanır. Bu, zaman ve işçilik gereksinimlerini önemli ölçüde en aza indirir. OnePot yöntemi sadece uygun maliyetli değil, aynı zamanda zaman verimli olduğunu da kanıtlamıştır.Hazırlık sürelerini birkaç haftadan üç iş gününe düşürır. Bu, PURE hücresiz platformu dünya çapında daha fazla laboratuvar için erişilebilir hale getirir ve sentetik hücresiz biyoloji için bu gerçekten güçlü platformun uygulanmasına yardımcı olur. Başlamadan önce, tüm suşların kendi proteinlerini iyi ifade ettiğinden emin olun.Başlamak için, iki mililitre Sepharose reçinesi kullanarak metin elyazmasında açıklandığı gibi OnePot protein saflaştırması için sütunu hazırlayın ve ardından sütunu nikel sülfatla şarj edin. 20 mililitre LB medyayı 20 mikrolitre ampisilinle birleştirerek başlangıç kültürlerini hazırlayın. Steril 96 derin kuyu plakasının 35 kuyusuna 300 mikrolitre medya ekleyin.Uzama faktörü termo kararsız veya EFTU hariç her birini kendi suşuyla aşılayın ve plakayı nefes alabilir bir zarla kapatın. EFTU kültürü için, 14 mililitrelik bir kültür tüpünde LB ortamı içeren üç mililitre ampisilin aşılayın. Bir OnePot ifade kültürü için yaklaşık üç mililitre EFTU kültürü yeterlidir.Bir gecede dakikada 260 dönüşte sallanırken 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, steril şaşkın şişeye 500 mililitre LB ortamı ve 500 mikrolitre ampisilin aktarın. OnePot PURE kültürünü EFTU kültürünün 1,675 mikrolitresi ve derin kuyu plakasından her bir kültürün 55 mikrolitresi ile aşıla.Kültürü dakikada 260 dönüş sallayarak veya kültürün optik yoğunluğu 0,2 ila 0,3'e ulaşana kadar 37 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın. 500 mikrolitre 0,1 milimolar IPTG ile kültürü teşvik edin ve üç saat daha büyüyün. Hücreleri 10 dakika boyunca dört santigrat derece ve 3, 220 kez G santrifüjleme ile hasat edin ve hücre peletini daha fazla kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Üçüncü gün, saflaştırmaları için gereken arabellek miktarlarını ölçün ve metinde belirtildiği gibi hepsine TCEP ekleyin. Kalan tamponları TCEP olmadan dört santigrat derecede saklayın. Yüklü sütunu 30 mililitre arabellek A ile dengele.25 mililitrelik A arabelleği geçtikten sonra sütunu alttan kapatın.Hücreleri çözün ve hücre peletini 7,5 mililitre tampon A.Lyse hücrelerinde 130 watt'lık bir prob kullanarak yeniden kullanmak için serolojik bir pipet kullanın. Sonication başarılı olursa, çözüm koyu olacaktır. Hücreleri buzda tuttuğunuzdan emin olun ve probu tüpe dokunmadan yeterince derine yerleştirin.Hücre kalıntılarını 21, 130 kez G'de 20 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleme ile çıkarın ve lisatı buzda tutun. Üst katmanı eşdeğer sütuna ekleyin. Sütunu üstten kapatın ve sızıntı olmadığından emin olun.Bir tüp rotator kullanarak sütuna dört santigrat derecede üç saat kuluçkaya yatırın. İlişkisiz bileşenleri kolondan alın ve 25 mililitre tamponla yıkayın A.Sütunu 25 mililitre 25 milimoler imidazol tamponu ile yıkayın. Proteinleri beş mililitre 450 milimoler imidazol tamponu ile yağlayın ve eluted proteinleri her zaman buzda tutun.Eluat'ı 25 mililitre HT tampon ile seyreltin ve karışımı buzda tutun. 15 mililitrelik santrifüj filtreye 15 mililitre ekleyin ve 1,5 mililitrelik bir hacme konsantre edin. Kalan 15 mililitreyi konsantre çözelti ile filtreye ekleyin ve bir kez daha 1,5 mililitreye konsantre edin.Konsantre numuneye 10 mililitre HT tampon ekleyin ve bir mililitreye konsantre edin. Konsantre numuneyi kurtarın ve eşit miktarda stok tamponU B ekleyin ve daha fazla kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede depolayın. Arabellek değişimi sırasında, metinde belirtildiği gibi sütunu geri yükleyin.Dördüncü gün, Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonu ölçün. Numuneyi 0,5 mililitre üç kilodalton kesme santrifüj filtresi ile mililitre başına 20 miligrama yoğunlaştırın. SDS sayfasını kullanarak OnePot PURE protein bileşimini doğrulayın.Numunenin 2,5 mikrolitresini iki X Laemmli tamponunun 10 mikrolitresi ile karıştırılmış 7,5 mikrolitre su ile seyreltin ve ardından jel üzerine beş mikrolitre ve 2,5 mikrolitre yük yükleyin. SDS sayfasını metinde belirtildiği gibi çalıştırın. Reaksiyon için iki ila 10 nanomolar DNA kullanarak elektronik tablodaki ilgili sarı hücrelerdeki DNA konsantrasyonu ve uzunluğunu doldurun.İstediğiniz toplam reaksiyon hacmini mikrolitrelerde doldurun. Gerekli reaktifleri dondurucudan çıkarın ve buzda çözün. Daha sonra, hesaplanan miktarda su, DNA ve enerji çözeltisini PCR tüpünün bir tarafına veya 384 kuyu plakasındaki bir kuyunun bir köşesine pipetlayın.Pipet, hesaplanan protein ve ribozom çözeltisini bir PCR tüpünün diğer tarafına veya 384 kuyu plakasının karşı köşesine koyun. Reaksiyon bileşenlerini birleştirmek için yaklaşık 30 saniye döndürün. Plaka okuyucu deneyleri sırasında buharlaşmayı önlemek için 35 mikrolitre sıvı balmumu ekleyin ve plakayı şeffaf bir dolgu macunu ile kapatın.37 santigrat derecede en az üç saat kuluçkaya yatır. Bir plaka okuyucuda okuma için, floresan yoğunluğunu her iki dakikada bir gerekli dalga boyunda ölçün. OnePot protein preparatı için daha sonra kullanılan tüm bireysel suşlarda dışavurum üzerinde başarılı burada gösterilmiştir.Son OnePot PURE protein çözeltisinin genel bileşimi SDS sayfası tarafından analiz edildi. EFTU'nun beklendiği gibi diğer proteinlere kıyasla daha yüksek konsantrasyonda mevcut olduğu fark edilir. OnePot protein çözeltisinin sentez verimi, His etiketli veya etiketlenmemiş ribozomlarla birlikte zaman içinde eGFP floresan izlenerek analiz edildi.Yeşil liste tRNA in vitro etiketleme sistemi veya Kumasi boyama kullanılarak etiketlenen üç farklı proteinin ekspresyon düzeyleri bir SDS sayfa jelinde analiz edildi. Fonksiyonel bir PURE sistemi için, tüm suşların ilgili proteinlerini iyi ifade etmeleri kesinlikle kritiktir. Bu teknik, PURE sisteminin biyolojik sistem mühendisliğine uygulanmasını kolaylaştırarak yeni genetik ağların, moleküler tanıların, terapötiklerin ve eğitim kitlerinin geliştirilmesini sağlar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Hücre-serbest Biyoloji yapışmalı femtoliter Odası Diziler

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Memeli hücre kültür Tekdüzen toplamları üretmek için O şeklindeki damarlarının sallayarak bir Orbital

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Boş hücre Protein ifade kullanarak hızla büyüyen bakteri Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Biplanar Videoradyografi kullanarak 3D In-vivo Omuz Kinematik ölçümü

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Hücresiz Sistemler Kullanarak Protein Prototipleme için Minimal, Doğrusal Şablonların Amplifikasyonu için Hızlı, Enzymatik Yöntemler

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...