Name: preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity at JoVE.co

تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية المقدمة من مشروع بناء القدرات الابتكارية لمقاطعة جيانغسو (BM2020019) ، ومشروع شنتشن العلمي والتكنولوجي (No. JSGG20200225150702770) ، وبرنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB29030103) ، ومشروع قوانغدونغ العلمي والتكنولوجي (رقم 2020B1111340076) وبرنامج البحوث المفتوحة لمختبر خليج شنتشن (رقم. SZBL202002271003).

تم إجراء جميع العمليات التجريبية المتعلقة بالفيروس الكاذب تحت حالة ABSL2 في معهد باستور التابع لأكاديمية شنغهاي الصينية للعلوم (IPS ، CAS). تم إجراء التجارب على الحيوانات بناء على بروتوكولات الحيوانات المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية من IPS ، CAS.
1. تغليف الفيرو?...

<ol>
	<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin.">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li><li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies.">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).</li><li>Duverg&#233;, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+lentiviral+vectors:+When+the+clothes+make+the+virus.">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311 (2020).</li><li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza:+A+systematic+analysis.">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li><li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation:+Past,+present+and+future.">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+influenza+vaccines:+opportunities+and+challenges.">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza.">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination.">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li><li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents.">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li><li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates.">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection.">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells.">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li><li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures.">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).</li><li>. Luciferase assay system Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021)</li><li>. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021)</li></ol>

عادة ما تستخدم الخلايا HEK293FT كخلايا تغليف لإنتاج فيروسات كاذبة. الكشف المنتظم عن الميكوبلازما ضروري أثناء زراعة الخلايا. يمكن أن يقلل تلوث الميكوبلازما بشكل كبير من غلة الفيروس الكاذب وأحيانا يقترب من الصفر. بالمقارنة مع الملوثات الأخرى ، لا تؤدي ملوثات الميكوبلازما إلى تغيرات في قيمة ال?...

ومنذ عام 1996، تتسبب فيروسات أنفلونزا الطيور H5 الشديدة الإمراض A/goose/Guangdong/1/96 في تفشي الأنفلونزا بشكل مستمر بين الدواجن والطيور البرية، مما يتسبب في خسائر اجتماعية واقتصادية هائلة في صناعة الدواجن العالمية. في بعض الأحيان ، يصاب البشر أيضا به ، ويواجهون معدل وفيات مرتفع 1,2. ومع ذلك، غالبا ما يتم إعاقة أبحاث فيروس أنفلونزا الطيور شديدة الانفلونزا، نظرا لأنه لا يمكن معالجتها خارج مختبرات مستوى السلامة الأحيائية 3. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اعتماد الفيروسات الكاذبة كبديل للفيروسات البرية في بعض تجارب دراسات H5 HPAI. الفيروسات الزائفة آمنة بما يكفي للممارسة في مختبرات السلامة الأحيائية من المستوى 2.
تنتمي الفيروسات الكاذبة H5 HPAI إلى فيروسات وهمية تتكون من نوى فيروسات بديلة ، ومغلفات دهنية مع البروتينات السكرية السطحية من فيروسات الأنفلونزا ، وجينات المراسل. عادة ما يتم اشتقاق نوى الفيروسات الكاذبة من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ، والفيروسات القهقرية مثل فيروس سرطان الدم الفئران (MLV) ، وفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) 3. على وجه التحديد ، يستخدم نظام التعبئة والتغليف HIV-1 على نطاق واسع لإنتاج فيروس الأنفلونزا الكاذب ، حيث الجينات الأساسية المقدمة هي gag و pol. يعبر جين هفوة فيروس نقص المناعة البشرية عن البروتينات الأساسية. يعبر جين بول عن إنزيم الانتراز وإنزيم النسخ العكسي، وكلاهما ضروري للتعبير عن جين المراسل في الخلايا المحولة. محاكاة جينوم الفيروس البديل ، يتم احتضان جين المراسل في قلب الفيروس الكاذب في شكل الحمض النووي الريبي. سيعبر جين المراسل عن البروتين في الخلايا المضيفة. يمكن استخدام مستويات التعبير الجيني لجينات المراسل لقياس كفاءة عدوى الفيروس الكاذب 3,4. المراسل الأساسي هو لوسيفيراز اليراع لقياس وحدات التلألؤ النسبية (RLU) أو نشاط اللوسيفيراز النسبي (RLA) في الخلايا المحولة. كما يتم استخدام مراسلين آخرين مثل lacZ و Gaussia و Renilla luciferase ، فقط بدرجة أقل5.
الفيروسات الزائفة هي أدوات مثالية لدراسة الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروسات H5 HAPI. لقياس قوة تحييد الأجسام المضادة ، يتم استخدام مقايسات تحييد الفيروس الكاذب (PN)6. الهيماجلوتينين (HA) والنورامينيداز (NA) هي بروتينات سكرية على سطح فيروس الأنفلونزاA 7,8. يتكون HA من مجال رأس كروي لربط المستقبلات ومجال جذعي للاندماج الغشائي. يحتوي بروتين NA على نشاط sialidase لتسهيل إطلاق الفيروس 7,8. يمكن لفحص PN قياس الأجسام المضادة المعادلة الموجهة إلى بروتينات HA. يمكن أيضا اكتشاف الأجسام المضادة المعادلة الموجهة إلى الرأس ومنطقة الجذع من HA عن طريق فحوصات الارتباط الفيروسي والدخول. بالمقارنة مع الفيروسات البرية ، فإن تجارب تحييد الفيروس الكاذب لها قيم كشف أكثر حساسية ، ويمكن التعامل معها بأمان في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 2 ، وهي عموما أسهل في العمل في الممارسة العملية.
يعرض هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراءات والخطوات الحاسمة لمستحضرات الفيروس الكاذب H5 HPAI وفحوصات PN. كما يناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييدها وتعديلها لهذه المقايسات. وفي هذه الدراسة، استخدمت كمثال على ذلك السلالة A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) من فيروسات H5N1 HPAI. للحصول على الأمصال المناعية المستخدمة في المقايسات ، اختار هذا البروتوكول بروتين HA الناشئ من سلالة TH كمناعي لتحصين الفئران.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Chiken Erythrocyte</td>
			<td>Bio-channel</td>
			<td>BC-RBC-C001</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (flat-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (round-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>324910</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>1B1110-500G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroquine diphosphate</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S4157</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R700-07</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES FREE ACID</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0511-250G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 p24 Antigen ELISA</td>
			<td>ZeptoMetrix</td>
			<td>801111</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System Freezer Pack</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4530</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2935</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>509-GRD-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF102-10-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (100 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170355N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (10 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacket Incubator</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment/Cell incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity

ومنذ عام 1996، تتسبب فيروسات أنفلونزا الطيور H5 الشديدة الإمراض A/goose/Guangdong/1/96 في تفشي الأنفلونزا بين الدواجن والطيور البرية. في بعض الأحيان ، يقع البشر أيضا ضحية لها ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات. ومع ذلك، غالبا ما يتم إعاقة أبحاث فيروس أنفلونزا الطيور شديدة الانفلونزا، بالنظر إلى أنه يجب التعامل معها داخل مختبرات مستوى السلامة الأحيائية 3. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اعتماد الفيروسات الكاذبة كبديل للفيروسات البرية في بعض تجارب دراسات H5 HPAI. تثبت الفيروسات الزائفة أنها الأدوات المثالية لدراسة الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروسات H5 HPAI. يصف هذا البروتوكول الإجراءات والخطوات الحاسمة لاستعدادات الفيروس الكاذب H5 HPAI ومقايسات تحييد الفيروس الكاذب. كما يناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييدها وتعديلها لهذه المقايسات.

HA و NA و HIV-1 p24 تعبير البروتين عن الفيروس الكاذب للأنفلونزا لتحديد كفاءة التعبئة الفيروسية ، تم اكتشاف مخزونات الفيروس الكاذب للأنفلونزا لأول مرة بواسطة اختبار HA (الشكل 2 أ). وحدات HA لكل ملليلتر من فيروسات الأنفلونزا الكاذبة هي 643 (الجدول 3). تم استخدام مقاي?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity at JoVE.co

Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

هنا نصف بروتوكولا لتغليف الفيروسات الكاذبة وقياس نشاط تحييد الأجسام المضادة.

تحضير فيروسات أنفلونزا الطيور H5 من النوع الزائف بطريقة نقل فوسفات الكالسيوم وقياس نشاط تحييد الأجسام المضادة

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

يصف هذا البروتوكول الإجراءات والخطوات الحاسمة للمستحضرات الزائفة لفيروس أنفلونزا الطيور H5 عالي مسببات الأمراض ومقايسات تحييد الفيروس الزائف. كما يناقش قيود استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتعديلات هذه المقايسات. يجب إجراء مسببات الأمراض شديدة الإمراض في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى الثالث ، في حين يمكن التعامل مع الفيروسات الزائفة بأمان في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى الثاني.للبدء ، قم بعمل تعليق خلية واحدة لخلايا HEK293 FT في وسط DMEM كامل. أضف 10 ملليلتر من معلق الخلية الواحدة إلى دورق T75 ، متبوعا بالحضانة عند 37 درجة مئوية. قبل ساعتين من النقل ، استبدل الوسط القديم ب 10 ملليلتر من الوسط الكامل الطازج بالكلوروكين.امزج الكواشف والحمض النووي البلازميد كما هو موضح في المخطوطة ثم انقل هذا الخليط إلى الوسط فوق الخلايا واصخره برفق. بعد الحضانة ، استبدل الوسط ب 15 مل من وسط DMEM الكامل الجديد. بعد 65 ساعة ، حصاد الطافد عن طريق الطرد المركزي.جمع طافي وقسمة عليه. للكشف عن تعبير بروتين الهيماجلوتينين ، أضف 50 ميكرولترا من PBS إلى الأعمدة من الثاني إلى 12 من صفيحة سفلية مستديرة جيدا 96. أضف 100 ميكرولتر من الفيروس الزائف إلى آبار العمود الأول.ثم انقل 50 ميكرولترا من الفيروس الزائف من العمود الأول إلى آبار العمود الثاني. قم بإجراء هذا التخفيف المزدوج حتى العمود 11 متبوعا بالخلط اللطيف. ثم تخلص من 50 ميكرولترا إضافيا من العمود 11.أضف 50 ميكرولتر من 0.5٪ كريات الدم الحمراء في كل بئر متبوعا بخلط لطيف. بعد 30 إلى 60 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، راقب وسجل عيار هيماجلوتينين للفيروس الزائف. لمعايرة الفيروس الزائف ، قم بعمل تعليق خلية واحدة من خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر من خلايا MDCK في وسط DMEM كامل.أضف 1،250 و 2 و 500 و 5،000 و 10،000 و 20،000 و 40،000 خلية إلى آبار مختلفة من صفيحة بئر مسطحة القاع 96. بعد الحضانة ، ذوبان الجليد ودوامة الفيروس الزائف. أضف ستة HAU من الفيروسات الزائفة إلى كل بئر من صفيحة سفلية مستديرة 96 جيدا وقم بتجديد كل بئر ب DMEM الكامل حتى 120 ميكرولتر.نقل 100 ميكرولتر من الخليط إلى الخلايا في لوحة البئر 96. احتضان لوحة الثقافة لمدة 48 و 60 و 72 ساعة للعدوى الفيروسية وإجراء فحص لوسيفيراز. لإجراء فحص luciferase ، اغسل الخلايا عن طريق إزالة الوسط بعناية وشطفه ب 200 ميكرولتر من PBS.قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS ، ثم أضف 50 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى كل بئر. في اليوم التالي ، قم بموازنة الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، ثم هز ألواح الاستزراع عدة مرات وانقل جميع الخلايا المحللة إلى 96 لوحة بئر غير شفافة. أضف 50 ميكرولترا من الركيزة إلى كل لوحة واخلطها جيدا.سجل عيار لوسيفيراز للفيروس الزائف باستخدام مقياس الإضاءة. أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلية الواحدة لخلايا MDCK إلى كل بئر من صفيحة بئر مسطحة القاع 96 واحتضانها لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، ذوبان الجليد ودوامة الفيروس الزائف والأمصال المخزنة في ناقص 80 درجة مئوية.تمييع الأمصال 20 مرة في وسط كامل. أضف 100 ميكرولتر من وسط DMEM إلى الأعمدة من الثالث إلى 10. أضف 200 ميكرولتر من الأمصال المخففة إلى آبار العمود الثاني وقم بإجراء التخفيف التسلسلي.ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط DMEM إلى العمود 11 كعنصر تحكم سلبي. أضف 100 ميكرولتر من الفيروسات الزائفة إلى كل بئر واخلطها. انقل 100 ميكرولتر من الخليط من الصفيحة السفلية المستديرة 96 جيدا إلى البئر المقابلة للوحة زراعة خلايا البئر 96.بعد 60 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بإجراء فحص لوسيفيراز. أظهر فحص الهيماجلوتينين أن 643 وحدة HA لكل ملليلتر من فيروسات الأنفلونزا الزائفة موجودة في مخزونات فيروسات الأنفلونزا الزائفة. كانت نسب HA و Gag P24 ضمن النطاق الطبيعي.أظهر فحص اللطخة الغربية وجود أربعة أنواع من البروتين ، بما في ذلك بروتينات HA0 و HA1 و HA2 و NA ، مما يشير إلى تشابه فيروسات الأنفلونزا الزائفة مع فيروسات النوع البري. تشير نتائج معايرة الفيروس الزائف إلى أن الظروف المناسبة لأعلى نشاط نسبي لوسيفيراز تشمل تغذية 5000 خلية في بئر من 96 صفيحة بئر واكتشاف قراءات نشاط لوسيفيراز النسبية بعد 60 ساعة من الإصابة بالفيروس. أظهرت الأمصال المناعية من مجموعة DDV عيارات تحييد عالية ضد سلالة الفيروس الزائف A Thailand 1 Can 104 ، في حين لم تظهر الأمصال من المجموعة الضابطة أي نشاط تحييد.كان النشاط المعادل للأمصال المناعية قويا مقارنة بأمصال التحكم ، مما يشير إلى أن الكثير من الأجسام المضادة تم توجيهها إلى رأس HA في الأمصال المناعية. تشير الاختلافات الكبيرة بين الأمصال المناعية والضوابط أثناء تقييم الدخول الفيروسي إلى أن الأجسام المضادة موجهة إلى منطقة جذع HA في الأمصال المناعية. عند تنفيذ هذا الإجراء ، تذكر الحفاظ على درجة الحموضة في محلول النقل ووسط الثقافة مستقرة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

التشخيص السريع لفيروس انفلونزا الطيور في الطيور البرية : استخدام لPCR - RRT المحمولة والكواشف تجميد المجفف في الميدان

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

الطيور ترصد الأنفلونزا اتفاقية التجارة الحرة مع بطاقات : أساليب الميدانية ، الأحيائية ، وقضايا النقل محلولة

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

تحديد نشاط أكلة العينات السريرية جسم

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

قياس تأثيرات على الأجسام المضادة من وظيفة الخلوية Cardiomyocytes متفرقة

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

سرعة الكشف الجزيئي والتمايز من فيروسات الأنفلونزا A و B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

قياس ل<em&gt; في المختبر</em&gt; التكامل آخر من HIV-1 Preintegration مجمعات

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...