Name: preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity at JoVE.co

Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Innovation Capacity Building Project of Jiangsu-provinsen (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (nr. JSGG20200225150702770), strategisk prioriteret forskningsprogram fra det kinesiske videnskabsakademi (XDB29030103), Guangdong videnskabelige og teknologiske projekt (nr. 2020B1111340076) og Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).

Alle pseudovirusrelaterede eksperimentelle operationer blev udført under ABSL2-tilstand i Institut Pasteur of Shanghai Chinese Academy of Sciences (IPS, CAS). Dyreforsøg blev udført baseret på Institutional Animal Care and Use Committee-godkendte dyreprotokoller for IPS, CAS.
1. Pseudovirusemballage med calciumphosphattransfektion
<ol><li>Der fremstilles enkeltcellesuspensioner af HEK293FT celler (9 x 105 pr. ml) i komplet DMEM-medium (tabel 1...

<ol>
	<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin.">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li><li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies.">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).</li><li>Duverg&#233;, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+lentiviral+vectors:+When+the+clothes+make+the+virus.">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311 (2020).</li><li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza:+A+systematic+analysis.">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li><li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation:+Past,+present+and+future.">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+influenza+vaccines:+opportunities+and+challenges.">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza.">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination.">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li><li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents.">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li><li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates.">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection.">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells.">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li><li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures.">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).</li><li>. Luciferase assay system Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021)</li><li>. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021)</li></ol>

HEK293FT celler bruges normalt som emballageceller til fremstilling af pseudovirus. Regelmæssig mycoplasma-detektion er afgørende under cellekulturen. Mycoplasma-kontaminering kan drastisk reducere pseudovirusudbyttet og nogle gange tæt på nul. Sammenlignet med andre kontamineringer fører mycoplasmakontamineringer ikke til ændringer i pH-værdien eller turbiditet af cellekulturmediet. Selv en høj koncentration af mycoplasma er ikke synlig med blotte øjne eller under et mikroskop. Tre populære metoder til mycopla...

Siden 1996 har A/gås/Guangdong/1/96-afstamning højpatogen aviær influenza (HPAI) H5-vira forårsaget kontinuerlige influenzaudbrud hos fjerkræ og vilde fugle, hvilket tegner sig for enorme socioøkonomiske tab i den globale fjerkræindustri. Nogle gange bliver mennesker også smittet med det, der står over for en høj dødelighed 1,2. HPAI-virusforskning hindres imidlertid ofte, da den ikke kan håndteres uden for laboratorier med biosikkerhedsniveau 3. For at løse dette problem vedtages pseudovirus som et alternativ til vildtypevirus i nogle eksperimenter med H5 HPAI-undersøgelser. Pseudovirus er sikre nok til at praktisere i laboratorier med biosikkerhedsniveau 2.
H5 HPAI-pseudovira tilhører kimære vira, der består af surrogatviruskerner, lipidhylstre med overfladeglycoproteiner fra influenzavirus og reportergener. Pseudoviruskerner er normalt afledt af lentiviral human immundefektvirus (HIV), retrovirus såsom murine leukæmivirus (MLV) og vesikulær stomatitisvirus (VSV)3. Specifikt anvendes HIV-1-emballagesystemet i vid udstrækning til at producere influenzapseudovirus, hvor de primære gener, der leveres, er gag og pol. HIV gag genet udtrykker kerneproteiner. Pol-genet udtrykker integrasen og revers transkriptase, som begge er nødvendige for ekspressionen af reportergenet i transducerede celler. Ved at efterligne surrogatvirusets genom omfavnes reportergenet i pseudoviruskernen i RNA-form. Reportergenet vil udtrykke proteinet i værtsceller. Genekspressionsniveauerne for reportergener kan bruges til at måle pseudovirusinfektionseffektivitet 3,4. Den primære reporter er firefly luciferase til måling af de relative luminescensenheder (RLU) eller relativ luciferase aktivitet (RLA) i transducerede celler. Andre journalister som lacZ, Gaussia og Renilla luciferase bruges også, kun i mindre grad5.
Pseudovirus er ideelle værktøjer til at studere neutraliserende antistoffer mod H5 HAPI-vira. For at måle den neutraliserende antistofstyrke anvendes pseudovirusneutraliseringsassays (PN) 6. Hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) er glycoproteiner på overfladen af influenza A-virus 7,8. HA består af et kugleformet hoveddomæne til receptorbinding og et stamdomæne til membranfusion. NA-proteinet har sialidaseaktiviteten til at lette virusfrigivelsen 7,8. Et PN-assay kan måle neutraliserende antistoffer rettet mod HA-proteiner. Neutraliserende antistoffer rettet mod hoved- og stammeregionen af HA kan også påvises ved viral vedhæftning og indgangsassays. Sammenlignet med vildtypevirus har pseudovirusneutraliseringseksperimenter mere følsomme detektionsværdier, kan håndteres sikkert i et niveau 2-biosikkerhedslaboratorium og er generelt lettere at betjene i praksis.
Denne protokol præsenterer detaljeret procedurerne og de kritiske trin i H5 HPAI-pseudoviruspræparater og PN-assays. Det diskuterer også fejlfinding, begrænsning og ændringer af disse assays. I denne undersøgelse blev A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)-stammen fra H5N1 HPAI-vira anvendt som eksempel. For at opnå immunsera, der anvendes i assays, valgte denne protokol HA-proteinet, der stammer fra TH-stammen, som immunogen til immunisering af mus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Chiken Erythrocyte</td>
			<td>Bio-channel</td>
			<td>BC-RBC-C001</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (flat-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (round-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>324910</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>1B1110-500G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroquine diphosphate</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S4157</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R700-07</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES FREE ACID</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0511-250G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 p24 Antigen ELISA</td>
			<td>ZeptoMetrix</td>
			<td>801111</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System Freezer Pack</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4530</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2935</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>509-GRD-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF102-10-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (100 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170355N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (10 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacket Incubator</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment/Cell incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity

Siden 1996 har A/gås/Guangdong/1/96-afstamning højpatogen aviær influenza (HPAI) H5-vira forårsaget influenzaudbrud hos fjerkræ og vilde fugle. Lejlighedsvis bliver mennesker også ofre for det, hvilket resulterer i høj dødelighed. Ikke desto mindre hindres HPAI-virusforskning ofte, da den skal håndteres inden for laboratorier med biosikkerhedsniveau 3. For at løse dette problem vedtages pseudovirus som et alternativ til vildtypevirus i nogle eksperimenter med H5 HPAI-undersøgelser. Pseudovirus viser sig at være de ideelle værktøjer til at studere neutraliserende antistoffer mod H5 HPAI-vira. Denne protokol beskriver procedurer og kritiske trin i H5 HPAI-pseudoviruspræparater og pseudovirusneutraliseringsassays. Det diskuterer også fejlfinding, begrænsning og ændringer af disse assays.

HA, NA og HIV-1 p24 proteinekspression af influenza pseudovirus For at identificere virusemballagens effektivitet blev influenzapseudovirusbestandene først påvist ved HA-assay (figur 2A). HA-enheder pr. milliliter influenzapseudovirus er 643 (tabel 3). Western-blot-assay og sandwich-ELISA-assays blev brugt til at teste HA-, NA- og HIV-1 p24-proteinekspression. Derefter blev forholdet mellem HA-enhed og mængden af gag p24 for pseudovirus beregnet. Resul...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity at JoVE.co

Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

Her beskriver vi en protokol for pseudovirusemballage og måling af antistofneutraliserende aktivitet.

Fremstilling af pseudotypede H5 aviær influenzavirus med calciumphosphattransfektionsmetode og måling af antistofneutraliserende aktivitet

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

Denne protokol beskriver procedurerne og de kritiske trin i H5-højpatogene aviær influenza-pseudoviruspræparater og pseudovirusneutraliseringsassays. Det diskuterer også fejlfindingsbegrænsningen og ændringerne af disse analyser. Højpatogene patogener skal udføres i niveau tre biosikkerhedslaboratorium, mens pseudovira kan håndteres sikkert i et niveau to biosikkerhedslaboratorium.Til at begynde med skal du lave en enkeltcellesuspension af HEK293 FT-celler i et komplet DMEM-medium. Der tilsættes 10 ml enkeltcellesuspension til en T75-kolbe efterfulgt af inkubation ved 37 grader Celsius. To timer før transfektion udskiftes det gamle medium med 10 ml frisk komplet medium med chloroquin.Bland reagenserne og plasmid-DNA'et som beskrevet i manuskriptet, overfør derefter denne blanding til mediet over cellerne og rock forsigtigt. Efter inkubation udskiftes mediet med 15 ml frisk komplet DMEM-medium. Efter 65 timer høstes supernatanten ved centrifugering.Supernatanten opsamles og prøves på den. For at detektere hæmagglutininproteinekspression tilsættes 50 mikroliter PBS i kolonner to til 12 af en 96 godt rund bundplade. Tilsæt 100 mikroliter pseudovirus i brøndene i kolonne et.Overfør derefter 50 mikroliter pseudovirus fra kolonne et til brøndene i kolonne to. Denne dobbelte fortynding udføres indtil kolonne 11 efterfulgt af forsigtig blanding. Kassér derefter de ekstra 50 mikroliter fra kolonne 11.Tilsæt 50 mikroliter 0,5% erytrocyt i hver brønd efterfulgt af forsigtig blanding. Efter 30 til 60 minutters inkubation ved stuetemperatur observeres og registreres hæmagglutinintintitere af pseudoviruset. Til pseudovirustitrering fremstilles en enkeltcellesuspension på fem gange 10 til de fjerde celler pr. milliliter MDCK-celler i et komplet DMEM-medium.Tilsæt 1.250, 2.500, 5.000, 10.000, 20.000 og 40.000 celler til forskellige brønde af en fladbundet 96 brøndplade. Efter inkubation optøes og hvirvel pseudoviruset. Tilsæt seks HAU pseudovirus til hver brønd i en 96 godt rund bundplade og genopfyld hver brønd med komplet DMEM op til 120 mikroliter.Overfør 100 mikroliter af blandingen til cellerne i 96 brøndpladen. Inkuber kulturpladen i 48, 60 og 72 timer for virusinfektion og udfør et luciferase-assay. For at udføre luciferaseanalysen vaskes cellerne ved at fjerne mediet forsigtigt og skylle det med 200 mikroliter PBS.Fjern så meget af PBS som muligt, og tilsæt derefter 50 ml lysisbuffer til hver brønd. Den næste dag afbalanceres pladerne ved stuetemperatur i to timer, derefter klippes kulturpladerne flere gange og overføres alle cellelysaterne til uigennemsigtige 96 brøndplader. Tilsæt 50 mikroliter substrat til hver plade og bland det godt.Optag luciferase-titerne af pseudoviruset ved hjælp af luminometeret. Tilsæt 100 mikroliter af enkeltcellesuspensionen af MDCK-celler til hver brønd i en fladbundet 96 brøndplade og inkuber den i 20 timer ved 37 grader Celsius. Efter inkubationen optøes og hvirvel pseudoviruset og sera opbevares ved minus 80 grader Celsius.Fortynd sera 20 gange i et komplet medium. Tilsæt 100 mikroliter DMEM-medium til kolonne tre til 10. Tilsæt 200 mikroliter af den fortyndede sera i brøndene i den anden kolonne og udfør seriel fortynding.Derefter tilsættes 100 mikroliter DMEM-medium til den 11. kolonne som den negative kontrol. Tilsæt 100 mikroliter pseudovirus til hver brønd og bland den. Overfør 100 mikroliter af blandingen fra 96 godt rund bundplade til den tilsvarende brønd på 96 brøndcellekulturpladen.Efter 60 timers inkubation ved 37 grader Celsius udføres luciferase-assayet. Hæmagglutininanalysen viste, at 643 HA-enheder pr. milliliter influenzapseudovirus er til stede i influenzapseudovirusbestande. Forholdet mellem HA og Gag P24 lå inden for et normalt interval.Western blot-analysen viste tilstedeværelsen af fire proteintyper, herunder HA0-, HA1-, HA2- og NA-proteiner, hvilket indikerer ligheden mellem influenzapseudovirus og vildtypevirus. Pseudovirustitreringsresultater indikerer, at de egnede betingelser for den højeste relative luciferaseaktivitet omfatter fodring af 5.000 celler i en brønd på en 96 brøndplade og detektering af relative luciferaseaktivitetsaflæsninger efter 60 timers virusinfektion. Immunsera fra DDV-gruppen udviste høje neutraliseringstitere mod pseudovirus A Thailand 1 Can 104-stamme, mens sera fra kontrolgruppen ikke udviste nogen neutraliseringsaktivitet.Neutraliserende aktivitet af immunsera var potent sammenlignet med kontrolsera, hvilket indikerer, at mange antistoffer blev rettet mod HA-hovedet i immunseraen. De signifikante forskelle mellem immunsera og kontrollerne under vurderingen af viral indgang indikerer, at antistoffer er rettet mod HA-stamområdet i immunseraen. Når du udfører denne procedure, skal du huske at holde pH-værdien i transfektionsopløsningen og kulturmediet stabilt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Bestemmelse af fagocyterende Aktivitet of Clinical Antibody prøver

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Måling af antistof Virkninger på cellulær funktion af isolerede cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration af rekombinant influenzavacciner i kimære musemodeller at studere slimhindeimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Hurtig Molekylær Detection og Differentiering af Influenza Virus A og B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling Influenza neuraminidase Inhibering Antistoftitere af Enzyme-linked lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

måling af<em&gt; In vitro</em&gt; Integration aktivitet af HIV-1 Preintegration komplekser

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescensbaseret neuraminidase-inhiberingsassay i vurdering af den følsomhed over influenzavira til neuraminidaseinhibitoren Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...