Name: preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00
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Ce travail a été soutenu par les subventions de recherche du Projet de renforcement des capacités d’innovation de la province du Jiangsu (BM2020019), du Projet scientifique et technologique de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), le Programme de recherche prioritaire stratégique de l’Académie chinoise des sciences (XDB29030103), le Projet scientifique et technologique du Guangdong (n° 2020B1111340076) et le Programme de recherche ouvert du Laboratoire de la baie de Shenzhen (No. SZBL202002271003).

Toutes les opérations expérimentales liées aux pseudovirus ont été réalisées sous condition ABSL2 à l’Institut Pasteur de l’Académie chinoise des sciences de Shanghai (IPS, CAS). Les expériences sur les animaux ont été réalisées sur la base des protocoles sur les animaux approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’IPS, CAS.
1. Emballage de pseudovirus avec transfection de phosphate de calcium
<ol><li>Fabriquer des ...

<ol>
	<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin.">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li><li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies.">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).</li><li>Duverg&#233;, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+lentiviral+vectors:+When+the+clothes+make+the+virus.">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311 (2020).</li><li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza:+A+systematic+analysis.">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li><li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation:+Past,+present+and+future.">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+influenza+vaccines:+opportunities+and+challenges.">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza.">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination.">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li><li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents.">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li><li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates.">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection.">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells.">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li><li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures.">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).</li><li>. Luciferase assay system Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021)</li><li>. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021)</li></ol>

HEK293FT cellules sont généralement utilisées comme cellules d’emballage pour produire des pseudovirus. Une détection régulière des mycoplasmes est essentielle lors de la culture cellulaire. La contamination par les mycoplasmes peut diminuer considérablement les rendements de pseudovirus et parfois proche de zéro. Par rapport à d’autres contaminations, les contaminations par mycoplasmes n’entraînent pas de changements de la valeur du pH ou de turbidité du milieu de culture cellulaire. Même une forte con...

Depuis 1996, les virus H5 de la grippe aviaire hautement pathogène (IAHP) de la lignée A/oie/Guangdong/1/96 sont à l’origine d’épidémies de grippe continuelles chez les volailles et les oiseaux sauvages, ce qui représente d’énormes pertes socio-économiques dans l’industrie mondiale de la volaille. Parfois, les humains sont également infectés par elle, confrontés à un taux de mortalité élevé 1,2. Cependant, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle ne peut pas être traitée en dehors des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont adoptés comme alternative aux virus de type sauvage dans certaines expériences d’études IAHP H5. Les pseudovirus sont suffisamment sûrs pour être pratiqués dans des laboratoires de niveau de biosécurité 2.
Les pseudovirus IAHP H5 appartiennent à des virus chimériques constitués de noyaux de virus de substitution, d’enveloppes lipidiques avec les glycoprotéines de surface des virus de la grippe et de gènes rapporteurs. Les carottes de pseudovirus sont généralement dérivées du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) lentivirale, des rétrovirus tels que le virus de la leucémie murine (MLV) et du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV)3. Plus précisément, le système d’emballage du VIH-1 est largement utilisé pour produire le pseudovirus de la grippe, où les principaux gènes fournis sont gag et pol. Le gène gag du VIH exprime les protéines centrales. Le gène pol exprime l’intégrase et la transcriptase inverse, toutes deux nécessaires à l’expression du gène rapporteur dans les cellules transduites. Imitant le génome du virus de substitution, le gène rapporteur est intégré dans le noyau du pseudovirus sous forme d’ARN. Le gène rapporteur exprimera la protéine dans les cellules hôtes. Les niveaux d’expression génique des gènes rapporteurs peuvent être utilisés pour mesurer l’efficacité de l’infection pseudovirale 3,4. Le rapporteur principal est la luciférase luciole pour mesurer les unités de luminescence relative (RLU) ou l’activité relative de la luciférase (RLA) dans les cellules transduites. D’autres rapporteurs tels que lacZ, Gaussia et Renilla luciferase sont également utilisés, mais dans une moindre mesure5.
Les pseudovirus sont des outils idéaux pour étudier les anticorps neutralisants contre les virus H5 HAPI. Pour mesurer le pouvoir neutralisant des anticorps, les tests de neutralisation des pseudovirus (PN)6 sont utilisés. L’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) sont des glycoprotéines présentes à la surface du virus de la grippe A 7,8. Le HA est composé d’un domaine de tête globulaire pour la liaison au récepteur et d’un domaine souche pour la fusion membranaire. La protéine NA a l’activité sialidase pour faciliter la libération du virus 7,8. Un test NP peut mesurer des anticorps neutralisants dirigés contre les protéines HA. Les anticorps neutralisants dirigés contre la tête et la région souche de l’HA peuvent également être détectés par des tests de fixation et d’entrée virales. Par rapport aux virus de type sauvage, les expériences de neutralisation des pseudovirus ont des valeurs de détection plus sensibles, peuvent être manipulées en toute sécurité dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2 et sont généralement plus faciles à utiliser dans la pratique.
Ce protocole présente en détail les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudovirus IAHP H5 et des tests PN. En outre, il traite du dépannage, de la limitation et des modifications de ces tests. Dans cette étude, la souche A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) des virus IAHP H5N1 a été utilisée comme exemple. Pour obtenir les sérums immunitaires utilisés dans les essais, ce protocole a sélectionné la protéine HA provenant de la souche TH comme immunogène pour immuniser les souris.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Chiken Erythrocyte</td>
			<td>Bio-channel</td>
			<td>BC-RBC-C001</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (flat-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (round-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>324910</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>1B1110-500G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroquine diphosphate</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S4157</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R700-07</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES FREE ACID</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0511-250G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 p24 Antigen ELISA</td>
			<td>ZeptoMetrix</td>
			<td>801111</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System Freezer Pack</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4530</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2935</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>509-GRD-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF102-10-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (100 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170355N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (10 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacket Incubator</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment/Cell incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity

Depuis 1996, les virus H5 de la lignée A/oie/Guangdong/1/96-lignée hautement pathogène (IAHP) sont à l’origine d’épidémies de grippe chez les volailles et les oiseaux sauvages. Parfois, les humains en sont également victimes, ce qui entraîne une mortalité élevée. Néanmoins, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle doit être traitée dans des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont adoptés comme alternative aux virus de type sauvage dans certaines expériences d’études IAHP H5. Les pseudovirus s’avèrent être les outils idéaux pour étudier les anticorps neutralisants contre les virus IAHP H5. Ce protocole décrit les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudovirus IAHP H5 et des tests de neutralisation des pseudovirus. En outre, il traite du dépannage, de la limitation et des modifications de ces tests.

Expression des protéines HA, NA et VIH-1 p24 du pseudovirus de la grippe Pour déterminer l’efficacité de l’emballage viral, les stocks de pseudovirus grippaux ont d’abord été détectés par le test HA (figure 2A). Les unités d’HA par millilitre de pseudovirus de la grippe sont de 643 (tableau 3). Le test Western blot et les tests ELISA sandwich ont été utilisés pour tester l’expression des protéines p24 HA, NA et VIH-1. Ensuite, les ra...

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Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

Nous décrivons ici un protocole pour l’emballage des pseudovirus et la mesure de l’activité neutralisante des anticorps.

Préparation de virus pseudo-typés H5 de la grippe aviaire avec procédé de transfection de phosphate de calcium et mesure de l’activité neutralisante des anticorps

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

Ce protocole décrit les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudo-virus de la grippe aviaire H5 hautement pathogène et des tests de neutralisation des pseudovirus. En outre, il traite de la limitation du dépannage et des modifications de ces tests. Les agents pathogènes hautement pathogènes doivent être effectués dans le laboratoire de biosécurité de niveau trois, tandis que les pseudo-virus peuvent être manipulés en toute sécurité dans un laboratoire de biosécurité de niveau deux.Pour commencer, fabriquez une suspension unicellulaire de cellules HEK293 FT dans un milieu DMEM complet. Ajouter 10 millilitres de suspension unicellulaire dans une fiole T75, puis procéder à une incubation à 37 degrés Celsius. Deux heures avant la transfection, remplacez l’ancien milieu par 10 millilitres de milieu complet frais avec de la chloroquine.Mélanger les réactifs et l’ADN plasmidique comme décrit dans le manuscrit puis transférer ce mélange dans le milieu au-dessus des cellules et rocher doucement. Après l’incubation, remplacez le milieu par 15 millilitres de milieu DMEM complet frais. Après 65 heures, récolter le surnageant par centrifugation.Recueillez le surnageant et aliquote-le. Pour détecter l’expression de la protéine hémagglutinine, ajoutez 50 microlitres de PBS dans les colonnes deux à 12 d’une plaque inférieure ronde de 96 puits. Ajouter 100 microlitres de pseudo-virus dans les puits de la première colonne.Ensuite, transférez 50 microlitres de pseudo-virus de la première colonne dans les puits de la deuxième colonne. Effectuer cette double dilution jusqu’à la colonne 11, suivie d’un mélange doux. Jetez ensuite les 50 microlitres supplémentaires de la colonne 11.Ajouter 50 microlitres d’érythrocyte à 0,5% dans chaque puits, puis mélanger doucement. Après 30 à 60 minutes d’incubation à température ambiante, observer et enregistrer les titres d’hémagglutinine du pseudovirus. Pour le titrage pseudo-virus, fabriquer une suspension unicellulaire de cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre de cellules MDCK dans un milieu DMEM complet.Ajoutez 1, 250, 2, 500, 5 000, 10, 000, 20, 000 et 40 000 cellules à différents puits d’une plaque de 96 puits à fond plat. Après incubation, décongeler et vortex le pseudo-virus. Ajouter six UAH de pseudo-virus à chaque puits d’une plaque de fond ronde de 96 puits et reconstituer chaque puits avec du DMEM complet jusqu’à 120 microlitres.Transférer 100 microlitres du mélange dans les cellules de la plaque de 96 puits. Incuber la plaque de culture pendant 48, 60 et 72 heures pour l’infection virale et effectuer un test de luciférase. Pour effectuer le dosage de la luciférase, lavez les cellules en retirant soigneusement le milieu et en le rinçant avec 200 microlitres de PBS.Retirez autant de PBS que possible, puis ajoutez 50 millilitres de tampon de lyse à chaque puits. Le lendemain, équilibrer les plaques à température ambiante pendant deux heures, puis secouer les plaques de culture plusieurs fois et transférer tous les lysats cellulaires sur des plaques opaques de 96 puits. Ajoutez 50 microlitres de substrat à chaque assiette et mélangez bien.Enregistrez les titres de luciférase du pseudo-virus à l’aide du luminomètre. Ajouter 100 microlitres de la suspension unicellulaire de cellules MDCK à chaque puits d’une plaque de fond plat de 96 puits et incuber pendant 20 heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, décongeler et vortex le pseudo-virus et les sérums stockés à moins 80 degrés Celsius.Diluer les sérums 20 fois dans un milieu complet. Ajouter 100 microlitres de milieu DMEM aux colonnes trois à 10. Ajouter 200 microlitres de sérum dilué dans les puits de la deuxième colonne et effectuer une dilution en série.Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu DMEM à la 11ème colonne comme témoin négatif. Ajoutez 100 microlitres de pseudo-virus à chaque puits et mélangez-le. Transférer 100 microlitres du mélange de la plaque de fond ronde à 96 puits vers le puits correspondant de la plaque de culture cellulaire de 96 puits.Après 60 heures d’incubation à 37 degrés Celsius, effectuez le test de luciférase. Le test d’hémagglutinine a montré que 643 unités d’HA par millilitre de pseudo-virus de la grippe sont présentes dans les stocks de pseudo-virus de la grippe. Les rapports HA et Gag P24 se situaient dans une fourchette normale.Le test Western blot a montré la présence de quatre types de protéines, y compris les protéines HA0, HA1, HA2 et NA, ce qui indique la similitude des pseudo-virus grippaux avec ceux des virus de type sauvage. Les résultats du titrage pseudo-viral indiquent que les conditions appropriées pour l’activité relative la luciférase la plus élevée comprennent l’alimentation de 5 000 cellules dans un puits d’une plaque de 96 puits et la détection des lectures de l’activité relative de la luciférase après 60 heures d’infection virale. Les sérums immuns du groupe DDV présentaient des titres de neutralisation élevés contre la souche pseudo-virale A Thailand 1 Can 104, tandis que les sérums du groupe témoin ne présentaient aucune activité de neutralisation.L’activité neutralisante des sérums immunitaires était puissante par rapport aux sérums témoins, ce qui indique que beaucoup d’anticorps étaient dirigés vers la tête de l’HA dans les sérums immunitaires. Les différences significatives entre les sérums immunitaires et les témoins lors de l’évaluation de l’entrée virale indiquent que les anticorps sont dirigés vers la région souche HA dans les sérums immuns. Lors de l’exécution de cette procédure, n’oubliez pas de maintenir le pH de la solution de transfection et du milieu de culture stable.

Research

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