Name: preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalle borse di ricerca dell'Innovation Capacity Building Project della provincia di Jiangsu (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (No. JSGG20200225150702770), Programma di ricerca prioritaria strategica dell'Accademia cinese delle scienze (XDB29030103), Progetto scientifico e tecnologico del Guangdong (n. 2020B1111340076) e Programma di ricerca aperta del laboratorio della baia di Shenzhen (n. SZBL202002271003).

Tutte le operazioni sperimentali correlate allo pseudovirus sono state eseguite in condizioni ABSL2 presso l'Institut Pasteur dell'Accademia cinese delle scienze di Shanghai (IPS, CAS). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti sulla base dei protocolli sugli animali approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di IPS, CAS.
1. Confezionamento di pseudovirus con trasfezione calcio-fosfato
<ol><li>Effettuare sospensioni monocellulari di cellul...

<ol>
	<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin.">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li><li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies.">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).</li><li>Duverg&#233;, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+lentiviral+vectors:+When+the+clothes+make+the+virus.">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311 (2020).</li><li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza:+A+systematic+analysis.">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li><li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation:+Past,+present+and+future.">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+influenza+vaccines:+opportunities+and+challenges.">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza.">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination.">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li><li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents.">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li><li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates.">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection.">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells.">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li><li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures.">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).</li><li>. Luciferase assay system Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021)</li><li>. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021)</li></ol>

HEK293FT cellule sono solitamente utilizzate come cellule di imballaggio per produrre pseudovirus. Il rilevamento regolare del micoplasma è essenziale durante la coltura cellulare. La contaminazione da micoplasma può ridurre drasticamente i raccolti di pseudovirus e talvolta vicino allo zero. Rispetto ad altre contaminazioni, le contaminazioni da micoplasma non portano a variazioni del valore del pH o torbidità del terreno di coltura cellulare. Anche un'alta concentrazione di micoplasma non è visibile ad occhio nudo ...

Dal 1996, i virus H5 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato continue epidemie di influenza nel pollame e negli uccelli selvatici, causando enormi perdite socio-economiche nell'industria avicola globale. A volte, anche gli esseri umani vengono infettati da esso, di fronte ad un alto tasso di mortalità 1,2. Tuttavia, la ricerca sul virus HPAI è spesso ostacolata, dato che non può essere gestita al di fuori dei laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus sono abbastanza sicuri da essere praticati nei laboratori di livello 2 di biosicurezza.
Gli pseudovirus H5 HPAI appartengono a virus chimerici costituiti da nuclei di virus surrogati, involucri lipidici con glicoproteine superficiali da virus influenzali e geni reporter. I nuclei di pseudovirus sono solitamente derivati dal virus dell'immunodeficienza umana lentivirale (HIV), dai retrovirus come il virus della leucemia murina (MLV) e dal virus della stomatite vescicolare (VSV)3. In particolare, il sistema di confezionamento dell'HIV-1 è ampiamente utilizzato per produrre pseudovirus influenzale, dove i geni primari forniti sono gag e pol. Il gene del bavaglio dell'HIV esprime le proteine di base. Il gene pol esprime l'integrasi e la trascrittasi inversa, entrambe necessarie per l'espressione del gene reporter nelle cellule trasdotte. Imitando il genoma del virus surrogato, il gene reporter è abbracciato nel nucleo dello pseudovirus in forma di RNA. Il gene reporter esprimerà la proteina nelle cellule ospiti. I livelli di espressione genica dei geni reporter possono essere utilizzati per misurare l'efficienza dell'infezione da pseudovirus 3,4. Il reporter principale è la lucciola luciferasi per misurare le unità di luminescenza relativa (RLU) o l'attività relativa della luciferasi (RLA) nelle cellule trasdotte. Vengono utilizzati anche altri reporter come lacZ, Gaussia e Renilla luciferasi, solo in misura minore5.
Gli pseudovirus sono strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus HAPI H5. Per misurare la potenza degli anticorpi neutralizzanti, vengono utilizzati i saggi di neutralizzazione dello pseudovirus (PN)6. L'emoagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA) sono glicoproteine sulla superficie del virus dell'influenza A 7,8. L'HA è composto da un dominio globulare per il legame del recettore e un dominio dello stelo per la fusione della membrana. La proteina NA ha l'attività sialidasi per facilitare il rilascio del virus 7,8. Un test PN può misurare gli anticorpi neutralizzanti diretti alle proteine HA. Gli anticorpi neutralizzanti diretti alla testa e alla regione dello stelo dell'HA possono anche essere rilevati mediante test di attaccamento virale e di ingresso. Rispetto ai virus wild-type, gli esperimenti di neutralizzazione degli pseudovirus hanno valori di rilevamento più sensibili, possono essere gestiti in modo sicuro in un laboratorio di biosicurezza di livello 2 e sono generalmente più facili da utilizzare nella pratica.
Questo protocollo presenta in dettaglio le procedure e le fasi critiche dei preparati di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi PN. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test. In questo studio, il ceppo A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) dei virus HPAI H5N1 è stato utilizzato come esempio. Per ottenere i sieri immunitari utilizzati nei saggi, questo protocollo ha selezionato la proteina HA proveniente dal ceppo TH come immunogeno per immunizzare i topi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Chiken Erythrocyte</td>
			<td>Bio-channel</td>
			<td>BC-RBC-C001</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (flat-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (round-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>324910</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>1B1110-500G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroquine diphosphate</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S4157</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R700-07</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES FREE ACID</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0511-250G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 p24 Antigen ELISA</td>
			<td>ZeptoMetrix</td>
			<td>801111</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System Freezer Pack</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4530</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2935</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>509-GRD-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF102-10-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (100 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170355N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (10 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacket Incubator</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment/Cell incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity

Dal 1996, i virus H5 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato epidemie influenzali nel pollame e negli uccelli selvatici. Occasionalmente, anche gli esseri umani ne sono vittime, il che si traduce in un'alta mortalità. Tuttavia, la ricerca sui virus HPAI è spesso ostacolata, considerando che deve essere gestita all'interno di laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus si dimostrano gli strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus H5 HPAI. Questo protocollo descrive le procedure e le fasi critiche dei preparativi di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi di neutralizzazione degli pseudovirus. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test.

Espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale Per identificare l'efficienza del confezionamento virale, le scorte di pseudovirus influenzali sono state rilevate per la prima volta mediante saggio HA (Figura 2A). Le unità HA per millilitro di pseudovirus influenzali sono 643 (Tabella 3). Il saggio western-blot e i saggi ELISA sandwich sono stati utilizzati per testare l'espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1. Qui...

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Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

Qui descriviamo un protocollo per il confezionamento di pseudovirus e la misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi.

Preparazione di virus dell'influenza aviaria H5 pseudo-tipizzati con metodo di trasfezione del fosfato di calcio e misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

Questo protocollo descrive le procedure e le fasi critiche dei preparativi di pseudovirus dell'influenza aviaria ad alta patogenicità H5 e dei saggi di neutralizzazione degli pseudo virus. Inoltre, discute la limitazione della risoluzione dei problemi e le modifiche di questi test. Gli agenti patogeni altamente patogeni devono essere effettuati nel laboratorio di biosicurezza di livello tre, mentre gli pseudo virus possono essere gestiti in modo sicuro in un laboratorio di biosicurezza di livello due.Per iniziare, effettuare una sospensione a cella singola di celle HEK293 FT in un mezzo DMEM completo. Aggiungere 10 millilitri della sospensione a cella singola in un pallone T75, seguito dall'incubazione a 37 gradi Celsius. Due ore prima della trasfezione, sostituire il vecchio mezzo con 10 millilitri di mezzo completo fresco con clorochina.Mescolare i reagenti e il DNA plasmidico come descritto nel manoscritto, quindi trasferire questa miscela nel mezzo sopra le cellule e oscillare delicatamente. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo con 15 millilitri di mezzo DMEM completo fresco. Dopo 65 ore, raccogliere il surnatante mediante centrifugazione.Raccogli il surnatante e aliquotalo. Per rilevare l'espressione proteica dell'emoagglutinina, aggiungere 50 microlitri di PBS nelle colonne da due a 12 di una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri di pseudo virus nei pozzetti della colonna uno.Quindi trasferire 50 microlitri di pseudo virus dalla colonna uno nei pozzetti della colonna due. Eseguire questa doppia diluizione fino alla colonna 11 seguita da una miscelazione delicata. Quindi scartare i 50 microlitri in più dalla colonna 11.Aggiungere 50 microlitri di eritrociti allo 0,5% in ciascun pozzetto seguito da una miscelazione delicata. Dopo 30-60 minuti di incubazione a temperatura ambiente, osservare e registrare i titoli di emoagglutinina dello pseudo virus. Per la titolazione pseudo del virus, effettuare una sospensione singola cellulare di cinque volte 10 alla quarta cellula per millilitro di cellule MDCK in un mezzo DMEM completo.Aggiungi 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 e 40.000 celle a diversi pozzetti di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Dopo l'incubazione, scongelare e vortice lo pseudo virus. Aggiungi sei HAU di pseudo virus a ciascun pozzetto di una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti e riempi ogni pozzetto con DMEM completo fino a 120 microlitri.Trasferire 100 microlitri della miscela alle celle nella piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra di coltura per 48, 60 e 72 ore per l'infezione virale ed eseguire un test della luciferasi. Per eseguire il test della luciferasi, lavare le cellule rimuovendo accuratamente il mezzo e risciacquandolo con 200 microlitri di PBS.Rimuovere il più possibile il PBS, quindi aggiungere 50 millilitri di tampone di lisi a ciascun pozzetto. Il giorno successivo, equilibrare le piastre a temperatura ambiente per due ore, quindi scuotere più volte le piastre di coltura e trasferire tutti i lisati cellulari in piastre opache a 96 pozzetti. Aggiungere 50 microlitri di substrato a ciascuna piastra e mescolare bene.Registrare i titoli luciferasi dello pseudo virus utilizzando il luminometro. Aggiungere 100 microlitri della sospensione a singola cella di cellule MDCK a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto 96 pozzetti e incubarlo per 20 ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, scongelare e vortice lo pseudo virus e i sieri conservati a meno 80 gradi Celsius.Diluire i sieri 20 volte in un mezzo completo. Aggiungere 100 microlitri di mezzo DMEM alle colonne da tre a 10. Aggiungere 200 microlitri di sieri diluiti nei pozzetti della seconda colonna ed eseguire la diluizione seriale.Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo DMEM all'11a colonna come controllo negativo. Aggiungere 100 microlitri di pseudo virus a ciascun pozzetto e mescolare. Trasferire 100 microlitri della miscela dalla piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti al pozzetto corrispondente della piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti.Dopo 60 ore di incubazione a 37 gradi Celsius, eseguire il test della luciferasi. Il test dell'emoagglutinina ha mostrato che 643 unità HA per millilitro di pseudo virus influenzali sono presenti nelle scorte di pseudo virus dell'influenza. I rapporti di HA e Gag P24 erano all'interno di un intervallo normale.Il test western blot ha mostrato la presenza di quattro tipi di proteine, tra cui le proteine HA0, HA1, HA2 e NA, indicando la somiglianza degli pseudo virus influenzali con quelli dei virus wild type. I risultati della titolazione pseudo virus indicano che le condizioni adatte per la più alta attività relativa della luciferasi includono l'alimentazione di 5.000 cellule in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e il rilevamento delle letture relative dell'attività luciferasica dopo 60 ore di infezione virale. I sieri immunitari del gruppo DDV hanno mostrato titoli di neutralizzazione elevati contro lo pseudo virus A Thailand 1 Can 104 ceppo, mentre i sieri del gruppo di controllo non hanno mostrato alcuna attività di neutralizzazione.L'attività neutralizzante dei sieri immunitari era potente rispetto ai sieri di controllo, indicando che molti anticorpi erano diretti alla testa HA nei sieri immuni. Le differenze significative tra i sieri immunitari e i controlli durante la valutazione dell'ingresso virale indicano che gli anticorpi sono diretti alla regione staminale HA nei sieri immunitari. Quando si esegue questa procedura, ricordarsi di mantenere stabile il pH della soluzione di trasfezione e il terreno di coltura.

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