Name: preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00
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이 작업은 장쑤성 혁신 역량 강화 프로젝트(BM2020019), 선전 과학 기술 프로젝트(No. JSGG20200225150702770), 중국과학원(XDB29030103)의 전략적 우선 연구 프로그램, 광동 과학 기술 프로젝트(No. 2020B1111340076) 및 Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program(No. SZBL202002271003).

모든 슈도바이러스 관련 실험 작업은 상하이 중국과학원 파스퇴르 연구소(IPS, CAS)에서 ABSL2 조건 하에서 수행되었습니다. 동물 실험은 IPS, CAS의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 동물 프로토콜을 기반으로 수행되었습니다.
1. Calcium-phosphate transfection을 사용한 유사바이러스 패키징
<ol><li>완전한 DMEM 배지에서 HEK293FT 세포(mL당 9 x 105)의 단일 세포 현?...

<ol>
	<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin.">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li><li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies.">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).</li><li>Duverg&#233;, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+lentiviral+vectors:+When+the+clothes+make+the+virus.">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311 (2020).</li><li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza:+A+systematic+analysis.">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li><li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation:+Past,+present+and+future.">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+influenza+vaccines:+opportunities+and+challenges.">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza.">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination.">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li><li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents.">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li><li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates.">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection.">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells.">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li><li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures.">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).</li><li>. Luciferase assay system Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021)</li><li>. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021)</li></ol>

HEK293FT 세포는 일반적으로 슈도바이러스를 생산하기 위한 포장 세포로 사용됩니다. 정기적인 마이코플라스마 검출은 세포 배양 중에 필수적입니다. 마이코플라스마 오염은 슈도바이러스 수율을 급격히 감소시킬 수 있으며 때로는 0에 가까울 수 있습니다. 다른 오염과 비교할 때, 마이코플라스마 오염은 세포 배양 배지의 pH 값 변화 또는 탁도를 유발하지 않습니다. 고농도의 마이코 플라스마조차?...

1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 지속적인 독감 발병을 일으켜 전 세계 가금류 산업에서 막대한 사회경제적 손실을 초래했습니다. 때로는 인간도 감염되어 높은 치사율 1,2에 직면합니다. 그러나 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실 밖에서 처리 할 수 없기 때문에 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 생물안전성 레벨 2 실험실에서 실습할 수 있을 만큼 안전합니다.
H5 HPAI 슈도바이러스는 대리 바이러스 코어, 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질이 있는 지질 외피 및 리포터 유전자로 구성된 키메라 바이러스에 속합니다. 슈도바이러스 코어는 일반적으로 렌티바이러스 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)와 같은 레트로바이러스에서 파생됩니다.3. 특히, HIV-1 패키징 시스템은 인플루엔자 슈도바이러스를 생산하기 위해 널리 사용되며, 여기서 제공되는 주요 유전자는 gag 및 pol입니다. HIV gag 유전자는 핵심 단백질을 발현합니다. pol 유전자는 인테그라제 및 역전사효소를 발현하며, 둘 다 형질도입된 세포에서 리포터 유전자의 발현에 필요합니다. 대리 바이러스의 게놈을 모방한 리포터 유전자는 RNA 형태로 유사바이러스 코어에 흡수됩니다. 리포터 유전자는 숙주 세포에서 단백질을 발현합니다. 리포터 유전자의 유전자 발현 수준은 슈도바이러스 감염 효율을 측정하는데 사용될 수 있다 3,4. 1차 리포터는 형질도입된 세포에서 상대 발광 단위(RLU) 또는 상대 루시페라아제 활성(RLA)을 측정하기 위한 반딧불이 루시페라아제입니다. lacZ, Gaussia, Renilla luciferase 와 같은 다른 리포터들도 사용되지만 그 정도는 적습니다5.
슈도바이러스는 H5 HAPI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구입니다. 중화 항체 효능을 측정하기 위해, 슈도바이러스 중화(PN)분석법(6)이 사용된다. 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)는 인플루엔자 A 바이러스 7,8의 표면에 있는 당단백질입니다. HA는 수용체 결합을 위한 구형 헤드 도메인과 막 융합을 위한 줄기 도메인으로 구성됩니다. NA 단백질은 바이러스 방출을 촉진하는 시알리다아제 활성을 가지고 있습니다 7,8. PN 분석은 HA 단백질에 대한 중화 항체를 측정할 수 있습니다. HA의 머리 및 줄기 영역으로 향하는 중화 항체는 또한 바이러스 부착 및 진입 분석에 의해 검출될 수 있다. 야생형 바이러스에 비해 유사 바이러스 중화 실험은 검출 값이 더 민감하고 레벨 2 생물 안전 실험실에서 안전하게 처리 할 수 있으며 일반적으로 실제로 작동하기가 더 쉽습니다.
이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 PN 분석의 절차와 중요한 단계를 자세히 제시합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다. 본 연구에서는 H5N1 HPAI 바이러스의 A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) 균주를 예로 들어 설명하였다. 분석에 사용되는 면역 혈청을 얻기 위해, 이 프로토콜은 마우스를 면역화하기 위한 면역원으로서 TH 균주로부터 유래된 HA 단백질을 선택하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Chiken Erythrocyte</td>
			<td>Bio-channel</td>
			<td>BC-RBC-C001</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (flat-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (round-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>324910</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>1B1110-500G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroquine diphosphate</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S4157</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R700-07</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES FREE ACID</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0511-250G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 p24 Antigen ELISA</td>
			<td>ZeptoMetrix</td>
			<td>801111</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System Freezer Pack</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4530</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2935</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>509-GRD-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF102-10-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (100 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170355N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (10 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacket Incubator</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment/Cell incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity

1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통의 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 독감 발병을 일으키고 있습니다. 때때로 인간도 희생되어 사망률이 높습니다. 그럼에도 불구하고 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실에서 처리되어야 한다는 점을 고려할 때 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 H5 HPAI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구임이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 유사바이러스 중화 분석의 절차와 중요한 단계를 설명합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다.

HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현 인플루엔자 슈도바이러스 바이러스 패키징 효율을 확인하기 위해, 인플루엔자 슈도바이러스 스톡을 먼저 HA 분석에 의해 검출하였다(도 2A). 인플루엔자 슈도바이러스의 밀리리터당 HA 단위는 643입니다(표 3). 웨스턴 블롯 분석 및 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현을 테스트했습니다. 이어서, HA...

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Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

여기에서는 유사 바이러스 패키징 및 항체 중화 활성 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

이 프로토콜은 H5 고병원체 조류 인플루엔자 유사 바이러스 제제 및 유사 바이러스 중화 분석의 절차와 중요한 단계를 설명합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결 제한 및 수정에 대해 설명합니다. 고병원성 병원체는 3급 생물안전 실험실에서 수행해야 하는 반면, 유사 바이러스는 2단계 생물안전 실험실에서 안전하게 처리할 수 있습니다.시작하려면 완전한 DMEM 배지에서 HEK293 FT 세포의 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 단세포 현탁액 10ml를 T75 플라스크에 첨가한 다음, 섭씨 37도에서 배양한다. 형질감염 2시간 전에 기존 배지를 클로로퀸이 포함된 10밀리리터의 신선한 완전 배지로 교체합니다.원고에 설명된 대로 시약과 플라스미드 DNA를 혼합한 다음 이 혼합물을 세포 위의 배지로 옮기고 부드럽게 흔들어줍니다. 인큐베이션 후, 배지를 15 밀리리터의 신선한 완전 DMEM 배지로 교체한다. 65시간 후, 원심분리에 의해 상청액을 수확한다.상청액을 수집하고 분취합니다. 헤마글루티닌 단백질 발현을 검출하기 위해, 50 마이크로리터의 PBS를 96 웰 둥근 바닥 플레이트의 컬럼 2 내지 12에 첨가한다. 100 마이크로 리터의 유사 바이러스를 1 열의 우물에 첨가하십시오.그런 다음 50 마이크로 리터의 유사 바이러스를 1 열에서 2 열의 우물로 옮깁니다. 컬럼 11까지 이 2배 희석을 수행한 후 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 컬럼 50에서 여분의 11마이크로리터를 버립니다.0.5% 적혈구 50마이크로리터를 각 웰에 넣고 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 30 내지 60 분의 배양 후, 슈도 바이러스의 헤마글루티닌 역가를 관찰하고 기록한다. 슈도바이러스 적정을 위해, 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 밀리리터당 5배 내지 4번째 세포의 단일 세포 현탁액을 만든다.1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 및 40, 000 세포를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 다른 웰에 추가합니다. 배양 후, 의사 바이러스를 해동하고 소용돌이. 96웰 원형 바닥판의 각 웰에 6개의 유사 바이러스 HAU를 추가하고 최대 120마이크로리터의 완전한 DMEM으로 각 웰을 보충합니다.100 마이크로리터의 혼합물을 96 웰 플레이트 내의 세포로 옮긴다. 바이러스 감염을 위해 배양 플레이트를 48, 60 및 72시간 동안 배양하고 루시페라아제 분석을 수행합니다. 루시페라아제 분석을 수행하려면 배지를 조심스럽게 제거하고 200마이크로리터의 PBS로 헹구어 세포를 세척합니다.가능한 한 많은 PBS를 제거한 다음 각 웰에 50 밀리리터의 용해 완충액을 추가합니다. 다음날, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 평형화시킨 다음, 배양 플레이트를 여러 번 흔들고 모든 세포 용해물을 불투명한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 각 플레이트에 50 마이크로 리터의 기판을 넣고 잘 섞는다.광도계를 사용하여 유사 바이러스의 루시페라아제 역가를 기록합니다. MDCK 세포의 단일 세포 현탁액 100 마이크로리터를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 섭씨 37도에서 20시간 동안 인큐베이션한다. 배양 후, 해동하고 소용돌이 치는 의사 바이러스와 혈청은 섭씨 영하 80도에서 보관됩니다.완전한 배지에서 혈청을 20 배 희석하십시오. 100마이크로리터의 DMEM 배지를 컬럼 3-10에 추가합니다. 희석 된 혈청 200 마이크로 리터를 두 번째 컬럼의 웰에 넣고 연속 희석을 수행하십시오.그런 다음 100마이크로리터의 DMEM 배지를 음성 대조군으로 11번째 열에 추가합니다. 100 마이크로 리터의 유사 바이러스를 각 웰에 넣고 혼합하십시오. 혼합물 100 마이크로리터를 96 웰 둥근 바닥 플레이트로부터 96 웰 세포 배양 플레이트의 상응하는 웰로 옮긴다.섭씨 37도에서 60시간 배양한 후 루시페라아제 분석을 수행합니다. 헤마글루티닌 분석은 인플루엔자 유사 바이러스의 밀리리터당 643 HA 단위가 인플루엔자 유사 바이러스 스톡에 존재한다는 것을 보여주었다. HA와 Gag P24의 비율은 정상 범위 내에 있었다.웨스턴 블롯 분석은 HA0, HA1, HA2 및 NA 단백질을 포함한 4가지 단백질 유형의 존재를 보여주었으며, 이는 인플루엔자 유사 바이러스와 야생형 바이러스의 유사성을 나타냅니다. 유사 바이러스 적정 결과는 가장 높은 상대적 루시페라아제 활성에 적합한 조건이 96 웰 플레이트의 웰에 5, 000개의 세포를 공급하고 바이러스 감염 60시간 후 상대적 루시페라아제 활성 판독값을 검출하는 것을 포함한다는 것을 나타냅니다. DDV 그룹의 면역 혈청은 슈도 바이러스 A 타이캔 104 균주에 대해 높은 중화 역가를 보인 반면, 대조군의 혈청은 중화 활성을 나타내지 않았습니다.면역 혈청의 중화 활성은 대조군 혈청에 비해 강력했으며, 이는 많은 항체가 면역 혈청에서 HA 헤드로 향했음을 나타냅니다. 바이러스 진입 평가 동안 면역 혈청과 대조군 사이의 유의한 차이는 항체가 면역 혈청의 HA 줄기 영역으로 향한다는 것을 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때 형질주입 용액과 배양 배지의 pH를 안정적으로 유지하는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

연구

면역학 및 감염병학

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

임상 항체 샘플 Phagocytic 활동 결정

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

측정<em&gt; 체외</em&gt; HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...