Name: preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado por las becas de investigación del Proyecto de Desarrollo de Capacidades de Innovación de la provincia de Jiangsu (BM2020019), el Proyecto Científico y Tecnológico de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), el Programa de Investigación Estratégica Prioritaria de la Academia China de Ciencias (XDB29030103), el Proyecto Científico y Tecnológico de Guangdong (No. 2020B1111340076) y el Programa de Investigación Abierta del Laboratorio de la Bahía de Shenzhen (No. SZBL202002271003).

Todas las operaciones experimentales relacionadas con pseudovirus se realizaron bajo la condición ABSL2 en el Instituto Pasteur de la Academia China de Ciencias de Shanghai (IPS, CAS). Los experimentos con animales se realizaron con base en los protocolos animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de IPS, CAS.
1. Envasado de pseudovirus con transfección de fosfato de calcio
<ol><li>Hacer suspensiones unicelulares de células HEK293FT (9 x ...

<ol>
	<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin.">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li><li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies.">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).</li><li>Duverg&#233;, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotyping+lentiviral+vectors:+When+the+clothes+make+the+virus.">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311 (2020).</li><li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza:+A+systematic+analysis.">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li><li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation:+Past,+present+and+future.">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+influenza+vaccines:+opportunities+and+challenges.">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza.">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination.">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li><li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents.">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li><li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates.">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection.">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li><li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells.">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li><li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures.">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).</li><li>. Luciferase assay system Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021)</li><li>. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021)</li></ol>

HEK293FT células se utilizan generalmente como células de empaquetamiento para producir pseudovirus. La detección regular de micoplasmas es esencial durante el cultivo celular. La contaminación por micoplasma puede disminuir drásticamente los rendimientos de pseudovirus y, a veces, cerca de cero. En comparación con otras contaminaciones, las contaminaciones por micoplasma no provocan cambios en el valor del pH ni en la turbidez del medio de cultivo celular. Incluso una alta concentración de micoplasma no es visibl...

Desde 1996, los virus H5 de la influenza aviar altamente patógena (HPAI) de linaje A/goose/Guangdong/1/96 han estado causando brotes continuos de gripe en aves de corral y aves silvestres, lo que representa enormes pérdidas socioeconómicas en la industria avícola mundial. A veces, los humanos también se infectan con ella, enfrentándose a una alta tasa de mortalidad 1,2. Sin embargo, la investigación del virus HPAI a menudo se ve obstaculizada, dado que no se puede manejar fuera de los laboratorios de nivel 3 de bioseguridad. Para abordar este problema, los pseudovirus se adoptan como una alternativa a los virus de tipo salvaje en algunos experimentos de estudios de HPAI H5. Los pseudovirus son lo suficientemente seguros como para practicarlos en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad.
Los pseudovirus H5 HPAI pertenecen a virus quiméricos que consisten en núcleos de virus sustitutos, envolturas lipídicas con glicoproteínas de superficie de los virus de la influenza y genes reporteros. Los núcleos de pseudovirus generalmente se derivan del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) lentiviral, retrovirus como el virus de la leucemia murina (MLV) y el virus de la estomatitis vesicular (VSV)3. Específicamente, el sistema de empaquetado del VIH-1 es ampliamente utilizado para producir pseudovirus de la influenza, donde los genes primarios proporcionados son gag y pol. El gen gag del VIH expresa proteínas centrales. El gen pol expresa la integrasa y la transcriptasa inversa, las cuales son necesarias para la expresión del gen reportero en las células transducidas. Imitando el genoma del virus sustituto, el gen reportero se adopta en el núcleo del pseudovirus en forma de ARN. El gen reportero expresará la proteína en las células huésped. Los niveles de expresión génica de los genes reporteros pueden ser utilizados para medir la eficiencia de la infección por pseudovirus 3,4. El reportero principal es luciferasa luciérnaga para medir las unidades de luminiscencia relativa (RLU) o la actividad relativa de luciferasa (RLA) en células transducidas. También se utilizan otros reporteros como lacZ, Gaussia y Renilla luciferasa, solo que en menor medida5.
Los pseudovirus son herramientas ideales para estudiar anticuerpos neutralizantes contra los virus H5 HAPI. Para medir la potencia de los anticuerpos neutralizantes, se utilizan ensayos de neutralización de pseudovirus (PN)6. La hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) son glicoproteínas en la superficie del virus de la gripe A 7,8. El AH está compuesto por un dominio globular de la cabeza para la unión al receptor y un dominio del tallo para la fusión de la membrana. La proteína NA tiene la actividad sialidasa para facilitar la liberación del virus 7,8. Un ensayo de PN puede medir anticuerpos neutralizantes dirigidos a proteínas HA. Los anticuerpos neutralizantes dirigidos a la región de la cabeza y el tallo de HA también se pueden detectar mediante ensayos de unión viral y entrada. En comparación con los virus de tipo salvaje, los experimentos de neutralización de pseudovirus tienen valores de detección más sensibles, se pueden manejar de manera segura en un laboratorio de bioseguridad de Nivel 2 y, en general, son más fáciles de operar en la práctica.
Este protocolo presenta en detalle los procedimientos y pasos críticos de las preparaciones de pseudovirus H5 HPAI y los ensayos de PN. Además, se analiza la solución de problemas, la limitación y las modificaciones de estos ensayos. En este estudio, se utilizó como ejemplo la cepa A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) de los virus H5N1 HPAI. Para obtener los sueros inmunes utilizados en los ensayos, este protocolo seleccionó la proteína HA procedente de la cepa TH como inmunógeno para inmunizar ratones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Chiken Erythrocyte</td>
			<td>Bio-channel</td>
			<td>BC-RBC-C001</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (flat-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates (round-bottom)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>324910</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>1B1110-500G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroquine diphosphate</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S4157</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R700-07</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES FREE ACID</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0511-250G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 p24 Antigen ELISA</td>
			<td>ZeptoMetrix</td>
			<td>801111</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System Freezer Pack</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4530</td>
			<td>Reagent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2935</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>509-GRD-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF102-10-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (100 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#956;L)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170355N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (10 mL)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>170356N</td>
			<td>consumable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>--</td>
			<td>Equipment/Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacket Incubator</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment/Cell incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of pseudo-typed h5 avian influenza viruses with calcium phosphate transfection method and measurement of antibody neutralizing activity

Desde 1996, los virus H5 de la influenza aviar altamente patógena (HPAI) de linaje A/ganso/Guangdong/1/96 han estado causando brotes de influenza en aves de corral y aves silvestres. Ocasionalmente, los humanos también son víctimas de ella, lo que resulta en una alta mortalidad. No obstante, la investigación del virus HPAI a menudo se ve obstaculizada, teniendo en cuenta que debe manejarse dentro de los laboratorios de nivel 3 de bioseguridad. Para abordar este problema, los pseudovirus se adoptan como una alternativa a los virus de tipo salvaje en algunos experimentos de estudios de HPAI H5. Los pseudovirus demuestran ser las herramientas ideales para estudiar anticuerpos neutralizantes contra los virus H5 HPAI. Este protocolo describe los procedimientos y pasos críticos de las preparaciones de pseudovirus H5 HPAI y los ensayos de neutralización de pseudovirus. Además, se analiza la solución de problemas, la limitación y las modificaciones de estos ensayos.

Expresión de la proteína HA, NA y VIH-1 p24 del pseudovirus de la gripe Para identificar la eficiencia del empaquetado viral, las existencias de pseudovirus de la influenza se detectaron primero mediante el ensayo de AH (Figura 2A). Las unidades de AH por mililitro de pseudovirus de influenza son 643 (Tabla 3). Se utilizó el ensayo Western blot y los ensayos ELISA sándwich para probar la expresión de la proteína p24 de HA, NA y VIH-1. Luego se calcu...

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Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

Aquí describimos un protocolo para el empaquetado de pseudovirus y la medición de la actividad neutralizante de anticuerpos.

Preparación de virus de la influenza aviar H5 pseudotipificados con el método de transfección de fosfato de calcio y medición de la actividad neutralizante de anticuerpos

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

Este protocolo describe los procedimientos y los pasos críticos de las preparaciones de pseudovirus de la influenza aviar H5 de alto riesgo y los ensayos de neutralización del pseudovirus. Además, se discute la limitación de solución de problemas y las modificaciones de estos ensayos. Los patógenos altamente patógenos deben llevarse a cabo en el laboratorio de bioseguridad de nivel tres, mientras que los pseudovirus pueden manejarse de manera segura en un laboratorio de bioseguridad de nivel dos.Para comenzar, haga una suspensión de una sola celda de células HEK293 FT en un medio DMEM completo. Añadir 10 mililitros de suspensión unicelular a un matraz T75, seguido de incubación a 37 grados centígrados. Dos horas antes de la transfección, reemplace el medio viejo con 10 mililitros de medio completo fresco con cloroquina.Mezcle los reactivos y el ADN plásmido como se describe en el manuscrito y luego transfiera esta mezcla al medio por encima de las células y la roca suavemente. Después de la incubación, reemplace el medio con 15 mililitros de medio DMEM completo fresco. Después de 65 horas, cosechar el sobrenadante por centrifugación.Recoger el sobrenadante y alícuota. Para detectar la expresión de la proteína hemaglutinina, agregue 50 microlitros de PBS en las columnas dos a 12 de una placa inferior redonda de 96 pocillos. Agregue 100 microlitros de pseudo virus en los pozos de la columna uno.Luego transfiera 50 microlitros de pseudo virus de la columna uno a los pozos de la columna dos. Realice esta doble dilución hasta la columna 11 seguida de una mezcla suave. Luego deseche los 50 microlitros adicionales de la columna 11.Agregue 50 microlitros de eritrocitos al 0,5% en cada pocillo seguido de una mezcla suave. Después de 30 a 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, observe y registre los títulos de hemaglutinina del pseudovirus. Para la titulación del pseudovirus, haga una suspensión de una sola célula de cinco veces 10 a la cuarta células por mililitro de células MDCK en un medio DMEM completo.Agregue 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 y 40, 000 celdas a diferentes pocillos de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Después de la incubación, descongele y vortex el pseudo virus. Agregue seis HAU de pseudovirus a cada pocillo de una placa inferior redonda de 96 pocillos y reponga cada pocillo con DMEM completo de hasta 120 microlitros.Transfiera 100 microlitros de la mezcla a las células en la placa de pocillos 96. Incubar la placa de cultivo durante 48, 60 y 72 horas para la infección viral y realizar un ensayo de luciferasa. Para realizar el ensayo de luciferasa, lave las células retirando el medio con cuidado y enjuagándolo con 200 microlitros de PBS.Retire la mayor cantidad posible de PBS, luego agregue 50 mililitros del tampón de lisis a cada pozo. Al día siguiente, equilibre las placas a temperatura ambiente durante dos horas, luego balancee las placas de cultivo varias veces y transfiera todos los lisados celulares a placas opacas de 96 pocillos. Añadir 50 microlitros del sustrato a cada plato y mezclar bien.Registre los títulos de luciferasa del pseudovirus usando el luminómetro. Agregue 100 microlitros de la suspensión de células de MDCK a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos e incube durante 20 horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, descongele y vórtice el pseudo virus y los sueros almacenados a menos 80 grados centígrados.Diluir los sueros 20 veces en un medio completo. Agregue 100 microlitros de medio DMEM a las columnas de tres a 10. Agregue 200 microlitros de sueros diluidos en los pocillos de la segunda columna y realice la dilución en serie.Luego agregue 100 microlitros de medio DMEM a la columna 11 como control negativo. Agregue 100 microlitros de pseudovirus a cada pocillo y mézclelo. Transfiera 100 microlitros de la mezcla de la placa inferior redonda de 96 pocillos al pocillo correspondiente de la placa de cultivo celular de 96 pocillos.Después de 60 horas de incubación a 37 grados centígrados, realice el ensayo de luciferasa. El ensayo de hemaglutinina mostró que 643 unidades de HA por mililitro de pseudovirus de influenza están presentes en las existencias de pseudovirus de influenza. Las proporciones de HA y Gag P24 estaban dentro de un rango normal.El ensayo Western blot mostró la presencia de cuatro tipos de proteínas, incluidas las proteínas HA0, HA1, HA2 y NA, lo que indica la similitud de los pseudovirus de la influenza con los virus de tipo salvaje. Los resultados de la titulación del pseudovirus indican que las condiciones adecuadas para la mayor actividad relativa de luciferasa incluyen la alimentación de 5.000 células en un pocillo de una placa de 96 pocillos y la detección de lecturas relativas de actividad de luciferasa después de 60 horas de infección por virus. Los sueros inmunes del grupo DDV exhibieron altos títulos de neutralización contra la cepa Can 104 del pseudovirus A Tailandia 1, mientras que los sueros del grupo control no exhibieron ninguna actividad de neutralización.La actividad neutralizante de los sueros inmunes fue potente en comparación con los sueros de control, lo que indica que muchos anticuerpos se dirigieron a la cabeza de HA en los sueros inmunes. Las diferencias significativas entre los sueros inmunes y los controles durante la evaluación de la entrada viral indican que los anticuerpos se dirigen a la región madre HA en el suero inmune. Al realizar este procedimiento, recuerde mantener estable el pH de la solución de transfección y el medio de cultivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

El diagnóstico rápido del virus de la influenza aviar en aves silvestres: El uso de un portátil de RT-PCR y reactivos liofilizados en el campo

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Investigación

Inmunología e Infección

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Vigilancia de la Gripe Aviar, con tarjetas FTA: Métodos de Campo, la bioseguridad y los problemas de transporte resueltos

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

La determinación de la actividad fagocítica de los anticuerpos de muestras clínicas

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Medición de los efectos de anticuerpos en la función celular de cardiomiocitos aislados

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Detección Molecular rápida y diferenciación de virus gripales A y B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...