Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني لأبحاث الأطفال (NCRC) ، ومجلس البحوث الأيرلندي (IRC) ، والورم الأرومي العصبي في المملكة المتحدة. تم إنشاء الرسوم التوضيحية باستخدام BioRender.

<ol>
	<li>Davidoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).</li><li>Matthay, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).</li><li>Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+the+3D+microenvironment+on+cancer+cell+behaviour+and+treatment+responsiveness:+a+recent+update+on+lung,+breast+and+prostate+cancer+models.">Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models.</a> Acta Biomaterialia. , (2021).</li><li>Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+the+genes,+the+tumor+microenvironment+in+neuroblastoma.">More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma.</a> Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).</li><li>Walker, C., Mojares, E., Del R&#237;o Hern&#225;ndez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+matrix+in+development+and+cancer+progression.">Role of extracellular matrix in development and cancer progression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).</li><li>Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+extracellular+matrix+direct+gene+expression.">How does the extracellular matrix direct gene expression.</a> Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).</li><li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reciprocity+in+the+wound+microenvironment.">Dynamic reciprocity in the wound microenvironment.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Medicine. 6, 11 (2008).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Medicine. 4, 38 (2006).</li><li>Ouellette, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+collagen+jungle:+The+biomedical+potential+of+fiber+organization+in+cancer.">Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer.</a> Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Hume, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell+invasiveness+and+response+to+chemotherapeutics+in+adipocyte+invested+3D+engineered+anisotropic+collagen+scaffolds.">Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).</li><li>Fitzgerald, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+collagen-based+scaffolds+to+simulate+prostate+cancer+bone+metastases+with+potential+for+evaluating+delivery+of+nanoparticulate+gene+therapeutics.">The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics.</a> Biomaterials. 66, 53-66 (2015).</li><li>Sapudom, J., Pompe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+tumor+microenvironments+based+on+collagen+matrices.">Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices.</a> Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).</li><li>Curtin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+relevant+3D+collagen-based+scaffold-neuroblastoma+cell+system+exhibits+chemosensitivity+similar+to+orthotopic+xenograft+models.">A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models.</a> Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).</li><li>Gavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+invasion+strategies+are+regulated+by+the+extracellular+matrix.">Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix.</a> Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).</li><li>Casal, e. J., Crane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry, Glycosaminoglycans. , (2019).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+freezing+rate+on+pore+structure+in+freeze-dried+collagen-GAG+scaffolds.">Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).</li><li>Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinking+and+mechanical+properties+significantly+influence+cell+attachment,+proliferation,+and+migration+within+collagen+glycosaminoglycan+scaffolds.">Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).</li><li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment,+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).</li><li>Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+dehydrothermal+treatment+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).</li><li>Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nanohydroxyapatite+nanocomposites+for+bone+tissue+engineering.">Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering.</a> ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).</li><li>Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterisation+of+a+collagen+nano-hydroxyapatite+composite+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering.</a> Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+hydroxyapatite+incorporation+methods+on+the+structural+and+biological+properties+of+porous+collagen+scaffolds+for+bone+repair.">Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).</li><li>Tierney, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+collagen+concentration+and+crosslink+density+on+the+biological,+structural+and+mechanical+properties+of+collagen-GAG+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).</li><li>Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteomimicry+of+mammary+adenocarcinoma+cells+in+vitro;+increased+expression+of+bone+matrix+proteins+and+proliferation+within+a+3D+collagen+environment.">Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment.</a> PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).</li><li>Nolan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+neuroblastoma:+advances+and+challenges.">Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges.</a> Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).</li><li>Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+cell+responses+in+threedimensional+conductive+collagen+gel+scaffolds+with+conductive+polymer+nanofibres+for+tissue+regeneration.">Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration.</a> Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).</li><li>Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+analyze+three-dimensional+cell+distribution+and+infiltration+in+degradable+scaffolds.">Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).</li><li>do Amaral, R. J. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalising+collagen-based+scaffolds+with+platelet-rich+plasma+for+enhanced+skin+wound+healing+potential.">Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).</li><li>Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogranin+A+as+a+valid+marker+in+oncology:+Clinical+application+or+false+hopes.">Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes.</a> World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).</li><li>O'Brien, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+permeability+and+cell+attachment+in+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering.">The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

لقد ثبت أن نموذج خلية سرطان السقالة ثلاثية الأبعاد أداة قيمة ومتعددة الاستخدامات لاكتساب نظرة ثاقبة ميكانيكية لنمو خلايا الورم الأرومي العصبي ، وقدرتها على البقاء ، وتسلل الخلايا في TME32 المبسط. يحاكي نموذج الورم الأرومي العصبي 3D الموصوف هنا الحد الأدنى من TME ويوفر بيانات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية أكثر من ثقافة أحادية الطبقة 2D. عيب رئيسي في ثقافة الخلايا 3D هو زيادة التعقيد التجريبي والأطر الزمنية الأطول. الموصوف هنا هو بروتوكول محسن لبذر ونمو وصيانة خلايا الورم الأرومي العصبي على السقالات القائمة على الكولاجين تليها تحليلات وتطبيقات المصب ، مما يؤدي إلى توصيف قوي لنمو الخلايا. كنا نهدف إلى اكتساب نظرة ثاقبة حول كثافة بذر الخلايا المثلى للسقالات لخلق بيئة يمكن التنبؤ بها ويمكن التحكم فيها لتقييم العلاجات الدوائية المضادة للسرطان في نافذة تجريبية سريعة مدتها 14 يوما. يوفر الجمع بين كل هذه البروتوكولات البسيطة الموصوفة تقييما شاملا لنمو خلايا الورم الأرومي العصبي في نظام الزراعة في المختبر القائم على السقالة.
تم التأكيد على النقاط الحرجة في إعداد البروتوكول للسماح للعلماء بتأسيسها في مختبراتهم بسرعة. على سبيل المثال ، تسمح أوقات الحضانة المشار إليها للحصول على أداء أفضل لمقايسة صلاحية الخلية اللونية باختراق أعمق للكاشف في مسام السقالة للوصول إلى جميع الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن تقنية تلطيخ dsDNA الفلورية قوية ومباشرة. ومع ذلك ، فإن إطلاق الحمض النووي من السقالات يتطلب تحللا قويا للخلايا لأن الخلايا "محاصرة" داخل ألياف الكولاجين.
باستخدام مقايسة قياس كمية الحمض النووي البسيطة الموصوفة ، يمكننا تحديد مرحلة نمو السجل على السقالات القائمة على الكولاجين لفحص الأدوية المضادة للسرطان باستخدام هذا النموذج. في الإعداد التجريبي الموصوف ، تم استخدام 4 كثافات أولية لبذر الخلايا مع فترة إجمالية مدتها 14 يوما ونقاط زمنية للتحليل في الأيام 1 و 7 و 14. حددنا أن خلايا KellyLuc المصنفة في 4 × 105 خلايا / سقالة لديها نافذة الانتشار الأكثر نشاطا بين اليومين 7 و 14. ستسمح بيانات نمو مرحلة السجل هذه بتفسير موثوق لمختلف تجارب السمية الخلوية للخلايا. إنه يزيل التكهنات حول أي انخفاض في النمو أو موت الخلايا الناتج عن النمو المكبوت على منصة 3D المسامية بدلا من سمية الأدوية. تعد صلاحية الخلية أيضا تقييما مستخدما على نطاق واسع لمدى ملاءمة منصات 3D لدعم نمو أنواع الخلايا المختلفة33,34. في حين أن هناك العديد من المقايسات لقياس صلاحية الخلية ، بما في ذلك التلوين الحي / الميت ، وقياس ATP ، ومقايسات الانتشار ، وجدنا أن استخدام مقايسة بقاء الخلية اللونية Alamar Blue هو تقنية بسيطة وفعالة لدعم بيانات قياس كمية الحمض النووي.
قدم الاستخدام المشترك لقياس كمية الحمض النووي وصلاحية الخلية دليلا تكميليا على أن الكثافة المثلى لخلايا البذور على السقالة لتحقيق نمو مستمر على مدى فترة 14 يوما هي 2-4 × 105 خلايا / سقالة. ومع ذلك ، يمكن بسهولة تكييف هذا البروتوكول لتلبية الأطر الزمنية التجريبية المختلفة والنقاط الزمنية للتحليل والتطبيقات النهائية. على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف تقييم نمو الخلايا أحادية الزراعة لخلايا الورم الأرومي العصبي على السقالات ، إلا أن السقالات قابلة للتعديل بسهولة لاستخدامها كمنصة للثقافة المشتركة ، كما وصفها دو أمارال وآخرون ، الذين استخدموا سقالات الكولاجين GAG للمشاركة في زراعة الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية في التحقيق في التئام الجروح35.
يتيح نموذج 3D الموصوف تصور نمو الخلايا وتسللها باستخدام تقنيات مختلفة معروفة ، مثل التألق المناعي و H&E القياسي. من المهم تصور الخلايا جنبا إلى جنب مع توصيف النمو باستخدام المقايسات الكيميائية الحيوية بسبب تنوع مورفولوجيا الخلية وأنماط النمو على السقالات. يمكن أن يؤدي فهم نمط النمو إلى رؤى حول سلوك النمو والاستجابة المستقبلية للأدوية المضادة للسرطان. على سبيل المثال ، ينتج عن نمو IMR32 باستخدام القياس الكمي للحمض النووي أنماطا مماثلة لكيلي ، على الرغم من أنه عند التصور باستخدام H&E ، ينمو IMR32 في مجموعات أكبر من كيلي ، والتي أظهرت نموا أكثر تشتتا (الشكل 9). تعكس أنماط النمو المتنوعة لخطوط الخلايا في السقالات السيناريو السريري لعدم تجانس الورم. إن فحص الاستجابة للأدوية المضادة للسرطان باستخدام لوحة من خطوط الخلايا ذات الأشكال المختلفة في سقالات 3D سيزيد من القيمة التنبؤية لاستجابة المريض لنفس الأدوية.
يمكن أيضا إجراء الكشف عن التعبير الجيني أو البروتيني باستخدام طرق أخرى مثل RT-qPCR أو ELISA إذا تم إفراز البروتين محل الاهتمام. تم استخدام علامة بديلة لتطور الورم الأرومي العصبي ، chromogranin A (CgA) 36 ، لتوصيف نمو خلايا الورم الأرومي العصبي في 3D. كما هو موضح في العمل السابق17 ، زاد إفراز CgA مع تكاثر الخلايا (الشكل 10). في حين أن زراعة الخلايا أحادية الطبقة لم تستطع التقاط هذه الزيادة ، حيث أن الانتشار يعني أن الخلايا وصلت إلى التقاء كامل في أطباق الاستزراع ، فإن استخدام سقالات الكولاجين 3D سمح بالتقييم المطول لإفراز CgA.
قد لا يكون نموذج 3D في المختبر مناسبا لجميع الأسئلة البحثية لدراسة بيولوجيا الورم الأرومي العصبي والاستجابة للعلاجات. أحد القيود هو الاختراق غير المتكافئ للخلايا داخل السقالات وتشكيل مجموعات خلايا متفاوتة الحجم ، والتي تعتمد على خط خلية معين وقد تؤدي إلى انتشار لا يمكن السيطرة عليه للمغذيات وأدوية الاختبار. تؤثر هذه الميزة على متانة الفحص العلاجي. ومع ذلك ، على الرغم من هذا القيد ، من المهم مراعاة أن الأورام الأصلية غير متجانسة أيضا في الحجم وتوزيع الخلايا السرطانية وتحتوي على العديد من أنواع الخلايا الأخرى داخل أنسجة الورم. للتغلب على هذا القيد ، نقترح استخدام كل سقالة مملوءة بالخلايا كنسيج مجهري واحد سيتم تحسين المعلمات التالية له: (أ) أوقات الحضانة لكاشف صلاحية الخلية للوصول إلى الخلايا ومجموعات الخلايا ، و (ب) تحلل الخلايا في المخزن المؤقت Triton X-100 عن طريق المعالجة المسبقة للخلايا على السقالات باستخدام محلل الأنسجة لتحرير الحمض النووي للخلايا الموجودة في عمق السقالة.
هناك قيد تقني آخر لهذا البروتوكول وهو عدم وجود اختبار ميكانيكي لكل دفعة من السقالات المصنعة حديثا لهذا النموذج. ومع ذلك ، فإن استخدام عملية التصنيع القوية للسقالات ، والتي تم وصفها على نطاق واسع فيما يتعلق بالخصائص الفيزيائية والكيميائية للسقالات ، مثل معامل الانضغاط والشد ، والمسامية وهيكل المسام البصري ، والتجانس ، يضمن الحفاظ على صفات السقالة من خلال الدفعات21،24،27،30،37.
باختصار ، تقدم هذه الورقة سلسلة من الطرق البسيطة لتحليل النمو الخلوي على السقالات القائمة على الكولاجين. يمكن تبادل كل من الجدول الزمني التجريبي ونقاط التحليل اعتمادا على أسئلة البحث المحددة. هذا البروتوكول قابل للتكيف أيضا مع أنواع الخلايا الأخرى. تقدم النتائج الموضحة أعلاه دليلا على كيفية إعطاء هذا التجميع من الأساليب نظرة ثاقبة لكثافة البذر المثلى لمختلف خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي لخلق نمو مستمر على مدار 14 يوما. يؤدي دمج النتائج التي تم الحصول عليها من جميع الطرق في هذا البروتوكول إلى فهم فائق لنمو الخلايا داخل مصفوفة الكولاجين 3D. من المحتمل أن يشمل الاستخدام المستقبلي لهذا النموذج أنظمة الاستزراع المشترك الخاصة بالورم الأرومي العصبي TME واختبار العديد من الأدوية الجديدة المضادة للسرطان.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

الورم الأرومي العصبي هو سرطان يصيب الأطفال في الجهاز العصبي الودي ينشأ أثناء التطور الجنيني أو الحياة المبكرة بعد الولادة بسبب تحول خلايا القمة العصبية1. إنه الورم الصلب خارج الجمجمة الأكثر شيوعا عند الأطفال ، ويمثل 8٪ من الأورام الخبيثة التي تم تشخيصها في المرضى الذين تقل أعمارهم عن 15 عاما وهو مسؤول عن 15٪ من جميع وفيات سرطان الأطفال. يظهر المرض سلوكيات سريرية غير متجانسة للغاية بسبب تغيرات كروموسومية وجينية وجينية محددة ، وميزات علم التشريح المرضي.
تساهم هذه التعديلات في عدوانية الورم الأرومي العصبي والنتائج السيئة لدى مرضى الأطفال. وبالتالي ، أثبتت العلاجات الحالية عدم فعاليتها على المدى الطويل لما يقرب من 80 ٪ من المرضى الذين يعانون من المرض العدواني سريريا2 ، مما يسلط الضوء على حقيقة أن العلاج لهذه المجموعة من المرضى لا يزال يمثل تحديا. من المحتمل أن يكون هذا بسبب آليات عدم تجانس الورم الأرومي العصبي والنقائل التي لا تزال غير مفهومة تماما. ومع ذلك ، يعتقد الآن على نطاق واسع أن البيئة المكروية للورم (TME) تلعب دورا في تطور العديد من أنواع السرطان. ومع ذلك ، فإنه لا يزال غير مدروس في الورم الأرومي العصبي 3,4.
TME الأصلي هو بيئة دقيقة 3D معقدة تنطوي على خلايا سرطانية وغير سرطانية محاطة ب ECM. يشير ECM إلى المكون اللاخلوي للنسيج الذي يوفر الدعم الهيكلي والكيميائي الحيوي لسكانه الخلويين ويساهم في تطور المرض وتشخيص المريض والاستجابة العلاجية5. يرجع هذا الترويج لتطور المرض إلى "المعاملة بالمثل الديناميكية" أو الاتصال ثنائي الاتجاه المستمر بين الخلايا و ECM6،7،8. مع تقدم السرطان ، يتم إعادة تنظيم الكولاجين اللحمي في كثير من الأحيان في أنماط خطية عمودية على واجهة سرطان السدى ، والتي تستخدمها الخلايا السرطانية كطريق مهاجر إلى ورم خبيث9،10،11.
تشمل المكونات الرئيسية لهذه السقالة البيولوجية الوظيفية الأصلية شبكة ليفية من الكولاجين من النوع الأول والثاني وبروتينات أخرى ، بما في ذلك الإيلاستين والبروتينات السكرية مثل اللامينين ، بالإضافة إلى مجموعة من البروتيوغليكان والمكونات الأخرى القابلة للذوبان12,13. أصبحت هذه البروتينات من ECM الأصلية الآن جزيئات حيوية طبيعية جذابة لتطوير نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر 3. يزداد تطبيق سقالات 3D لثقافة الخلايا في المختبر بسبب تمثيلها الفسيولوجي الأكبر ل TME مقارنة بثقافة 2D أحادية الطبقة التقليدية. تساعد سقالات 3D المصنعة على ربط الخلايا ، والانتشار ، والهجرة ، والتمثيل الغذائي ، والاستجابة للمنبهات التي تظهر في الأنظمة البيولوجية في الجسم الحي.
المكون الرئيسي لهذه السقالات 3D هو الكولاجين ، وهو لاعب رئيسي في العديد من العمليات البيولوجية الطبيعية بما في ذلك إصلاح الأنسجة ، وتكوين الأوعية ، وتشكل الأنسجة ، والتصاق الخلايا ، والهجرة11. أظهرت مصفوفات 3D القائمة على الكولاجين وظائفها القوية لنمذجة ECM ، حيث تعمل كبيئة دقيقة للمحاكاة الحيوية في المختبر مع تمكين تفاعلات الخلايا ECM بالإضافة إلى هجرة الخلايا وغزوها. توفر هذه المصفوفات ثلاثية الأبعاد أيضا تحليلا أكثر دقة لاستجابة الخلايا لأدوية العلاج الكيميائي من الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد أو "المسطحة" في العديد من نماذج السرطان 14،15،16 ، بما في ذلك الورم الأرومي العصبي17،18. أبلغ التحليل الجيني لثقافات الخلايا ثلاثية الأبعاد عن ارتباط أعلى مع ملف الأنسجة البشرية حتى عند مقارنته بالنماذج الحيوانية19. بشكل عام ، فإن حجر الزاوية في هذه السقالات ثلاثية الأبعاد هو توفير خلايا مناسبة في بيئة المختبر ، والتي تلخص بنية الأنسجة الأصلية وتسهل الحديث المتبادل الجزيئيثنائي الاتجاه 8.
لزيادة تعقيد النماذج القائمة على الكولاجين ، يتم دمج مكونات ECM الشائعة الأخرى في عملية هندسة الأنسجة ، وبالتالي إنشاء نماذج أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لتعكس TMEs المتخصصة للأنسجة المختلفة. على سبيل المثال ، GAGs ، السكريات سالبة الشحنة الموجودة في جميع أنسجة الثدييات20 ، تسهل ارتباط الخلايا والهجرة والانتشار والتمايز. كبريتات شوندروتن هي نوع معين من GAG الموجود في العظام والغضاريف ، والذي تم استخدامه سابقا في تطبيقات هندسة الأنسجة لإصلاح العظام21،22،23،24،25. نانو هيدروكسيباتيت (nHA) هو المكون غير العضوي الرئيسي للتكوين المعدني لأنسجة العظام البشرية ، ويشكل ما يصل إلى 65٪ من العظام بالوزن26 ، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع لاستبدال العظام وتجديدها27. وبالتالي ، فإن GAGs و nHA هي مركبات جذابة لإعادة بناء الورم الأرومي العصبي الأولي ECM ونمذجة المواقع النقيلية الأكثر شيوعا للورم الأرومي العصبي ونخاع العظام (70.5٪) والعظام (55.7٪) 28.
تم تطوير السقالات التي تتضمن مكونات ECM هذه في الأصل لتطبيقات هندسة أنسجة العظام مع تحليل مكثف للتوافق الحيوي والسمية والسمات الموصلة للعظام والحثالعظمي 29,30. إنها مصفوفات مسامية قائمة على الكولاجين يتم إنتاجها باستخدام تقنيات التجفيف بالتجميد للتحكم في خصائصها الفيزيائية والبيولوجية. أظهرت سقالات الكولاجين المكملة إما ب nHA (Coll-I-nHA) أو شوندروتن-6-كبريتات (Coll-I-GAG) نجاحا في محاكاة TME الأساسي في سرطان الثدي31 وورم خبيث للعظام في سرطان البروستاتا15 وكذلك الورم الأرومي العصبي17. تنتج تقنية التجفيف بالتجميد المستخدمة في تصنيع هذه السقالات المركبة تجانسا قابلا للتكرار في حجم المسام والمسامية داخل السقالات22،23،24. باختصار ، يتم تصنيع ملاط الكولاجين (0.5 بالوزن٪) عن طريق مزج الكولاجين الليفي مع 0.05 M حمض الأسيتيك. بالنسبة ل Coll-I-GAG ، تتم إضافة 0.05٪ بالوزن من كروندويتين-6-سلفات المعزولة من غضروف سمك القرش إلى ملاط الكولاجين أثناء المزج. بالنسبة لسقالات Coll-I-nHA المركبة ، يتم تصنيع جزيئات هيدروكسيباتيت بحجم النانو كما هو موضح سابقا27 وتضاف إلى ملاط الكولاجين بنسبة 2: 1 إلى وزن الكولاجين أثناء عملية المزج. يتم ربط جميع السقالات وتعقيمها جسديا باستخدام المعالجة الحرارية المائية عند 105 درجة مئوية لمدة 24 ساعة25. يتم الحصول على سقالات أسطوانية (قطرها 6 مم ، ارتفاع 4 مم) باستخدام لكمة خزعة ويمكن ربطها كيميائيا مع 3 mM N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride و 5.5 mM N-hydroxysuccinimide (EDAC / NHS) في الماء المقطر (dH2O) لتحسين الخواص الميكانيكية للتركيبات30. تخلق عملية التصنيع المحسنة جيدا لسقالتين من الكولاجين سقالات ذات خصائص ميكانيكية قابلة للتكرار ، بما في ذلك حجم المسام والمسامية والصلابة (كيلو باسكال). تتميز كل من سقالات Coll-I-GAG و Coll-I-nHA بخصائص فيزيائية مختلفة ، مما يخلق ظروفا بيئية مختلفة. يتم عرض خصائص كل سقالة في الجدول 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>كول آي جاج</td>
			<td>كول-I-nHA</td>
		</tr><tr><td>حجم سقالة (القطر [مم] × الارتفاع [مم])</td>
			<td>6 س 4 17</td>
			<td>6 س 4 17</td>
		</tr><tr><td>تركيز الكولاجين (بالوزن٪)</td>
			<td>0.5 17</td>
			<td>0.5 17</td>
		</tr><tr><td>تركيز الركيزة (بالوزن٪) [على أساس وزن الكولاجين]</td>
			<td>0.05 15,17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>متوسط حجم المسام (مم)</td>
			<td>96 22</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>المسامية (٪)</td>
			<td>99.5 23</td>
			<td>98.9 – 99.4 27</td>
		</tr><tr><td>صلابة (كيلو باسكال)</td>
			<td>1.5 27</td>
			<td>5.5 - 8.63 29</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: نظرة عامة على الخواص الميكانيكية للسقالتين المعتمدتين لدراسة بيولوجيا الورم الأرومي العصبي.
تصف هذه الورقة بروتوكولا لتجميع نظام قائم على سقالة 3D لمحاكاة البيئة المكروية للورم الأرومي العصبي بشكل أفضل باستخدام خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي والسقالات القائمة على الكولاجين الموصوفة سابقا والتي تستكمل إما ب nHA (Coll-I-nHA) أو شوندروتن-6-كبريتات (Coll-I-GAG). يتضمن البروتوكول طرقا نهائية لتحليل آليات نمو خلايا الورم الأرومي العصبي في بيئة أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية باستخدام طرق غير مكلفة محسنة مسبقا مقتبسة من ثقافة أحادية الطبقة 2D الشكل 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> الشكل 1: سير عمل البروتوكول بشكل عام. (أ) تنمو الخلايا إلى أعداد كافية، وتنقسم وتعد، ويعاد تعليقها في حجم مناسب من الوسط. (ب) يخضع مخزون الخلية هذا بعد ذلك للتخفيف المتسلسل لتحضير إجمالي 4 معلقات خلوية بكثافات مختلفة. (ج) يتم طلاء السقالات القائمة على الكولاجين بشكل معقم في ألواح غير ملتصقة من 24 بئرا ، و (د) يضاف 20 ميكرولتر من معلق الخلية إلى مركز كل سقالة ويترك لاحتضانه عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO2 ، و 95٪ رطوبة لمدة 3-5 ساعات. (ه) ثم يضاف وسط النمو الكامل (1 مل) ببطء إلى كل سقالة ، وتوضع الألواح مرة أخرى في الحاضنة للسماح بنمو الخلايا للإطار الزمني المطلوب. (F) في كل نقطة زمنية محددة مسبقا ، يتم استرداد العديد من السقالات لتقييم صلاحية الخلية ونموها ، وتحليل التعبير الجيني ، والتلطيخ النسيجي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

الورم الأرومي العصبي هو الورم الصلب خارج الجمجمة الأكثر شيوعا لدى الأطفال، وهو ما يمثل 15٪ من إجمالي وفيات سرطان الأطفال. نسيج الورم الأصلي عبارة عن بيئة مجهرية معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) تتضمن طبقات من الخلايا السرطانية وغير السرطانية محاطة بمصفوفة خارج الخلية (ECM). يوفر ECM الدعم المادي والبيولوجي ويساهم في تطور المرض وتشخيص المريض والاستجابة العلاجية.
تصف هذه الورقة بروتوكولا لتجميع نظام قائم على سقالة 3D لتقليد البيئة المكروية للورم الأرومي العصبي باستخدام خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي والسقالات القائمة على الكولاجين. تستكمل السقالات إما بهيدروكسيباتيت نانو هيدروكسيباتيت (nHA) أو جليكوزامينوجليكان (GAGs) ، يوجد بشكل طبيعي بتركيزات عالية في العظام ونخاع العظام ، وهي أكثر المواقع النقيلية شيوعا للورم الأرومي العصبي. يسمح الهيكل المسامي 3D لهذه السقالات بربط خلايا الورم الأرومي العصبي والانتشار والهجرة وتشكيل مجموعات الخلايا. في هذه المصفوفة 3D ، تكون استجابة الخلية للعلاجات أكثر انعكاسا للوضع في الجسم الحي .
يمكن لنظام الاستزراع القائم على السقالات الحفاظ على كثافة خلايا أعلى من ثقافة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D). لذلك ، تعتمد بروتوكولات التحسين لأرقام خلايا البذر الأولية على الأطر الزمنية التجريبية المطلوبة. تتم مراقبة النموذج من خلال تقييم نمو الخلايا عن طريق تحديد كمية الحمض النووي ، وصلاحية الخلية عن طريق المقايسات الأيضية ، وتوزيع الخلايا داخل السقالات عن طريق التلوين النسيجي.
تشمل تطبيقات هذا النموذج تقييم ملامح التعبير الجيني والبروتيني بالإضافة إلى اختبار السمية الخلوية باستخدام الأدوية التقليدية و miRNAs. يسمح نظام الثقافة 3D بالتلاعب الدقيق بمكونات الخلية و ECM ، مما يخلق بيئة أكثر تشابها من الناحية الفسيولوجية مع أنسجة الورم الأصلية. لذلك ، فإن هذا النموذج 3D في المختبر سيعزز فهم التسبب في المرض ويحسن العلاقة بين النتائج التي تم الحصول عليها في المختبر ، في الجسم الحي في النماذج الحيوانية ، والموضوعات البشرية.

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

تسرد هذه الورقة الخطوات المطلوبة لزرع خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي على سقالات ثلاثية الأبعاد قائمة على الكولاجين الموصوفة سابقا ، والحفاظ على نمو الخلايا لإطار زمني محدد مسبقا ، واسترداد السقالات للعديد من نمو الخلايا وتحليلات سلوك الخلية والتطبيقات النهائية ، قابلة للتكيف لتلبية مجموعة من الأهداف التجريبية.

نموذج محاكاة حيوية ثلاثي الأبعاد في المختبر للورم الأرومي العصبي باستخدام السقالات القائمة على الكولاجين

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

يقدم بروتوكولنا نموذجا حيويا 3D يؤثر بشكل وثيق على الأنسجة الأصلية. يمكن استخدام هذا لاكتشاف علاجات ومؤشرات حيوية جديدة لعلاج الورم الأرومي العصبي وتشخيصه. الميزة الرئيسية هي أنه يخلق ظروفا تجريبية أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة البيئة المكروية للورم باستخدام تقنية قابلة للتكرار تحقق اتساق دفعة إلى دفعة.يمكن استخدام طريقة السقالة الخاصة بنا أولا ، لتحديد علاجات جديدة للورم الأرومي العصبي ، وثانيا ، لدمج الخلايا المشتقة من المريض للتنبؤ بشكل أفضل باستجابة المريض الفردية. للبدء ، ضع السقالة المخزنة في PBS في غطاء التدفق الصفحي. استخدم ملاقط معقمة لرفع السقالة برفق من الزاوية ، واضغط على الجدار الجانبي لإزالة PBS الزائد.ثم ضع السقالة مع توجيه الطبقة اللامعة لأسفل في وسط بئر صفيحة 24 بئرا غير ملتصقة. قم بتسمية اللوحة بتفاصيل خط الخلية وكثافة البذر والنقاط الزمنية. اعمل مع الخلايا ذات كثافة البذر الواحدة في كل مرة ، واحتفظ بالخلايا المتبقية عند 37 درجة مئوية في الحاضنة ، حتى تصبح جاهزة للاستخدام.بالنسبة لمرفق الخلية في السقالة ، استخدم ماصة P20 ذات أطراف معقمة لخلط تعليق الخلية تماما ، وإضافة 20 ميكرولترا من تعليق الخلية ذي الصلة في وسط كل سقالة ، مما يضمن بقاء تعليق الخلية أعلى السقالة وليس على الجدار الجانبي أو قاعدة البئر. اترك الخلايا تلتصق لمدة ثلاث إلى خمس ساعات عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. في نهاية الحضانة ، استخدم ماصة P1000 لإضافة ملليلتر واحد ببطء من وسط النمو المسخن مسبقا إلى كل بئر ، ومنع إزاحة السقالات ، واحتضان اللوحة طوال الليل.راقب السقالات ، في البداية ، كل يومين إلى ثلاثة أيام لمعرفة تغيرات لون وسط النمو حيث تتكاثر الخلايا داخل السقالة. استخدم مسدس ماصة سعة 10 ملليلتر مع وضع بطيء لإزالة وتجاهل ملليلتر واحد من الوسط المستهلك من البئر. عند استخدام الوسط المكيف للتجربة ، اجمع الوسط المستهلك من النسخ البيولوجية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر ، وقم بإخراج الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي.انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بتخزين الأنبوب عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ضبط مسدس الماصة على وضع التنقيط ، أضف برفق ملليلتر من وسط النمو المسخن مسبقا إلى السقالات. احتضان اللوحة المحتوية على سقالة وتجديد الوسط الطازج طوال فترة النمو المطلوبة ، كما هو موضح.في غطاء التدفق الصفحي ، قم بتعقيم كاشف فحص صلاحية الخلية المناسب عن طريق الترشيح من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي. سخن المحلول المعقم ، ووسط النمو الكامل ، و PBS المعقم في حمام مائي ، عند 37 درجة مئوية. باستخدام ملاقط معقمة ، انقل السقالات لتحليلها في لوحة جديدة من 24 بئرا ، وقم بتسمية اللوحة بجميع التفاصيل ذات الصلة.أضف 900 ميكرولتر من وسط النمو المسخن مسبقا إلى كل بئر. ثم أضف 100 ميكرولتر من كاشف صلاحية الخلية المعقمة إلى كل بئر. للتحكم السلبي ، أضف 900 ميكرولتر من المتوسط و 100 ميكرولتر من كاشف صلاحية الخلية المعقمة في بئر بدون سقالة.استبدل الغطاء الموجود على اللوحة ، وقم بهز اللوحة برفق لمدة ثلاث دقائق تقريبا لتوزيع كاشف صلاحية الخلية المخفف في جميع أنحاء البئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. بعد إزالة اللوحة من الحاضنة ، هز اللوحة برفق لبضع ثوان وقم بإنشاء ثلاث نسخ ، كما هو موضح في المخطوطة النصية.قم بتوليد النسخ الثلاثية التقنية عن طريق نقل 100 ميكرولتر من الوسط المحتضن والكاشف من بئر واحد من الصفيحة المكونة من 24 بئرا إلى بئر واحد من الصفيحة الشفافة المكونة من 96 بئرا ، وقم بتنفيذ هذه الخطوة ما مجموعه ثلاث مرات لبئر واحد. قم بتغطية اللوحة المكونة من 96 بئرا بورق الألمنيوم لحماية كاشف صلاحية الخلية من الضوء. قم بإزالة وتجاهل 700 ميكرولتر المتبقية من الوسط والكاشف من السقالات في لوحة 24 بئرا.اغسل كل سقالة مرتين بمليلتر واحد من برنامج تلفزيوني معقم. استخدم قارئ الصفائح الدقيقة لقياس الامتصاص عند 570 و 600 نانومتر ، وحساب النسبة المئوية لتخفيض كواشف صلاحية الخلية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. تحليل إحصائي لنتائج صلاحية الخلية ، باستخدام البرامج المناسبة.أدخل القيم الثلاثية البيولوجية لإنتاج أشرطة الخطأ والإشارة إلى تباين الفحص. إجراء تحليل أحادي الاتجاه لاختبار التباين لفحص التغيرات في صلاحية الخلية خلال الإطار الزمني التجريبي باستخدام برنامج الإحصاء الحيوي المناسب. أشر إلى اختلافات كبيرة بين النقاط الزمنية على الرسوم البيانية ، كما هو موضح في مخطوطة النص.تم تقييم صلاحية خطين من خلايا الورم الأرومي العصبي ، KellyLuc و IMR32 ، نمت على السقالات. أدت زيادة كثافة الخلايا إلى تقليل أكبر في كاشف صلاحية الخلية مع مرور الوقت. تم قياس نمو الخلايا على السقالات بشكل غير مباشر عن طريق تحديد كمية الحمض النووي المستخرج من السقالات ، وتم حساب الخلايا لكل عينة.أظهرت خلايا IMR32 نموا متزايدا ، ثم خلايا KellyLuc ، مع مرور الوقت. تم تقييم مورفولوجيا النمو وتوزيع الخلايا على السقالات بصريا عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين والكيمياء المناعية. نمت خلايا KellyCis83 بشكل أسرع وتسللت أعمق في كل من تركيبات السقالة من خط خلايا كيلي الأقل توغلا.أظهر IMR32 المزروع على نانو هيدروكسيباتيت نمط نمو متناقض مع مجموعات كبيرة مكتظة ، على مدار 14 يوما. تمت مراقبة السمات الخاصة بالخلية عن طريق تلطيخ الكيمياء المناعية ، تليها تلطيخ phalloidin و DAPI ، ولوحظت وفرة الأكتين في خلايا Kelly و KellyCis83 على سقالات الكولاجين والجليكوزامينوجليكان. لتقييم النشاط الخلوي في المختبر ، تم قياس المستويات المفرزة من الكروموجرانين A ، وأنتجت الخلايا المزروعة على سقالات الكولاجين والجليكوزامينوجليكان والكولاجين نانو هيدروكسيباتيت المزيد من الكروموجرانين A مقارنة بالنمو في ثقافة 2D التقليدية.يفرز خط خلايا KellyCis83 المقاوم للعلاج الكيميائي كروموجرانين أ أكثر من خط خلية كيلي. بعد تعلق الخلية ، يمكن علاج الخلايا بعلاجات مختلفة. هذا من شأنه أن يوفر نتائج أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لاستجابة الخلايا للأدوية من ثقافة 2D التقليدية.تسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف أفضل لكيفية تصرف الخلايا السرطانية وتفاعلها مع التحفيز داخل البيئة المكروية للورم ، بدءا من الاستجابة للعلاجات أو التفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

دراسة ناقلات فيروسية في الكبد نموذج إسكانها ثلاثي الأبعاد مع الخط خلية الإنسان سرطان الكبد HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

رصد المورفولوجية والفسيولوجية طولية من الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

نموذج المصفوفة خارج الخلية العظام ثلاثية الأبعاد ل Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

نموذج الزرد من ورم أرومي عصبي

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للتحقيق في التفاعل الورمي-السترومالي في سرطان الكبد

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...