Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Children's Research Centre (NCRC), Irish Research Council (IRC) og Neuroblastoma UK. Illustrationerne blev skabt ved hjælp af BioRender.

<ol>
	<li>Davidoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).</li><li>Matthay, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).</li><li>Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+the+3D+microenvironment+on+cancer+cell+behaviour+and+treatment+responsiveness:+a+recent+update+on+lung,+breast+and+prostate+cancer+models.">Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models.</a> Acta Biomaterialia. , (2021).</li><li>Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+the+genes,+the+tumor+microenvironment+in+neuroblastoma.">More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma.</a> Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).</li><li>Walker, C., Mojares, E., Del R&#237;o Hern&#225;ndez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+matrix+in+development+and+cancer+progression.">Role of extracellular matrix in development and cancer progression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).</li><li>Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+extracellular+matrix+direct+gene+expression.">How does the extracellular matrix direct gene expression.</a> Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).</li><li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reciprocity+in+the+wound+microenvironment.">Dynamic reciprocity in the wound microenvironment.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Medicine. 6, 11 (2008).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Medicine. 4, 38 (2006).</li><li>Ouellette, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+collagen+jungle:+The+biomedical+potential+of+fiber+organization+in+cancer.">Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer.</a> Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Hume, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell+invasiveness+and+response+to+chemotherapeutics+in+adipocyte+invested+3D+engineered+anisotropic+collagen+scaffolds.">Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).</li><li>Fitzgerald, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+collagen-based+scaffolds+to+simulate+prostate+cancer+bone+metastases+with+potential+for+evaluating+delivery+of+nanoparticulate+gene+therapeutics.">The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics.</a> Biomaterials. 66, 53-66 (2015).</li><li>Sapudom, J., Pompe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+tumor+microenvironments+based+on+collagen+matrices.">Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices.</a> Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).</li><li>Curtin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+relevant+3D+collagen-based+scaffold-neuroblastoma+cell+system+exhibits+chemosensitivity+similar+to+orthotopic+xenograft+models.">A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models.</a> Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).</li><li>Gavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+invasion+strategies+are+regulated+by+the+extracellular+matrix.">Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix.</a> Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).</li><li>Casal, e. J., Crane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry, Glycosaminoglycans. , (2019).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+freezing+rate+on+pore+structure+in+freeze-dried+collagen-GAG+scaffolds.">Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).</li><li>Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinking+and+mechanical+properties+significantly+influence+cell+attachment,+proliferation,+and+migration+within+collagen+glycosaminoglycan+scaffolds.">Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).</li><li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment,+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).</li><li>Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+dehydrothermal+treatment+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).</li><li>Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nanohydroxyapatite+nanocomposites+for+bone+tissue+engineering.">Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering.</a> ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).</li><li>Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterisation+of+a+collagen+nano-hydroxyapatite+composite+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering.</a> Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+hydroxyapatite+incorporation+methods+on+the+structural+and+biological+properties+of+porous+collagen+scaffolds+for+bone+repair.">Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).</li><li>Tierney, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+collagen+concentration+and+crosslink+density+on+the+biological,+structural+and+mechanical+properties+of+collagen-GAG+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).</li><li>Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteomimicry+of+mammary+adenocarcinoma+cells+in+vitro;+increased+expression+of+bone+matrix+proteins+and+proliferation+within+a+3D+collagen+environment.">Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment.</a> PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).</li><li>Nolan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+neuroblastoma:+advances+and+challenges.">Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges.</a> Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).</li><li>Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+cell+responses+in+threedimensional+conductive+collagen+gel+scaffolds+with+conductive+polymer+nanofibres+for+tissue+regeneration.">Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration.</a> Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).</li><li>Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+analyze+three-dimensional+cell+distribution+and+infiltration+in+degradable+scaffolds.">Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).</li><li>do Amaral, R. J. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalising+collagen-based+scaffolds+with+platelet-rich+plasma+for+enhanced+skin+wound+healing+potential.">Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).</li><li>Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogranin+A+as+a+valid+marker+in+oncology:+Clinical+application+or+false+hopes.">Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes.</a> World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).</li><li>O'Brien, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+permeability+and+cell+attachment+in+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering.">The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

3D-stilladskræftcellemodellen har vist sig at være et værdifuldt og alsidigt værktøj til at opnå mekanistisk indsigt i neuroblastomcellevækst, levedygtighed og infiltration af celler i en forenklet TME32. 3D-neuroblastommodellen, der er beskrevet her, efterligner den minimale TME og giver mere fysiologisk relevante data end en 2D-monolagskultur. En stor ulempe ved 3D-cellekultur er øget eksperimentel kompleksitet og længere tidsrammer. Beskrevet her er en optimeret protokol til såning, vækst og vedligeholdelse af neuroblastomceller på kollagenbaserede stilladser efterfulgt af downstream-analyser og applikationer, hvilket giver robust karakterisering af cellevækst. Vi havde til formål at få indsigt i den optimale cellesåtæthed for stilladserne for at skabe et forudsigeligt og kontrollerbart miljø til vurdering af kræftbehandlinger i et hurtigt 14-dages eksperimentelt vindue. Kombinationen af alle disse beskrevne enkle protokoller giver en velafrundet vurdering af neuroblastomcellevækst i det stilladsbaserede in vitro-kultursystem .
De kritiske punkter i protokolopsætningen er blevet understreget for at give forskere mulighed for hurtigt at etablere det samme i deres laboratorier. For eksempel tillader de angivne inkubationstider for bedre ydeevne af den kolorimetriske cellelevedygtighedsanalyse dybere penetration af reagenset i stilladsporerne for at nå alle celler. Desuden er den fluorescerende dsDNA-farvningsteknik robust og ligetil; DNA-frigivelse fra stilladserne kræver imidlertid kraftig cellelyse, da cellerne er 'fanget' i kollagenfibre.
Ved hjælp af det beskrevne enkle DNA-kvantificeringsassay kan vi identificere logvækstfasen på kollagenbaserede stilladser til screening af kræftlægemidler ved hjælp af denne model. I den beskrevne eksperimentelle indstilling blev der anvendt 4 indledende cellesåningstætheder med en samlet 14-dages periode og analysetidspunkter på dag 1, 7 og 14. Vi identificerede, at KellyLuc-celler podet ved 4 × 105 celler / stillads har det mest signifikante aktive spredningsvindue mellem dag 7 og 14. Disse logfasevækstdata giver mulighed for pålidelig fortolkning af forskellige cellecytotoksicitetseksperimenter. Det eliminerer spekulationer om ethvert fald i vækst eller celledød som følge af undertrykt vækst på den 3D-porøse platform snarere end fra lægemiddeltoksicitet. Cellelevedygtighed er også en meget anvendt vurdering af 3D-platformes egnethed til at understøtte væksten af forskellige celletyper33,34. Mens der er mange analyser til måling af cellelevedygtighed, herunder levende / død farvning, ATP-måling, proliferationsassays, fandt vi, at brugen af Alamar Blue kolorimetriske cellelevedygtighedsanalyser var en enkel og effektiv teknik til understøttelse af DNA-kvantificeringsdata.
Den kombinerede anvendelse af DNA-kvantificering og cellelevedygtighed gav supplerende bevis for, at den optimale tæthed til frøceller på stilladset for at opnå fortsat vækst over en 14-dages periode i gennemsnit er 2-4 × 105 celler / stillads. Denne protokol kan dog let tilpasses til at tilfredsstille forskellige eksperimentelle tidsrammer, analysetidspunkter og downstream-applikationer. Selvom denne protokol beskriver evalueringen af monokulturcellevækst af neuroblastomceller på stilladser, kan stilladserne let ændres til brug som en platform for samkultur, beskrevet af do Amaral et al., der udnyttede kollagen-GAG-stilladser til co-kultur keratinocytter og fibroblaster i en undersøgelse af sårheling35.
Den beskrevne 3D-model muliggør visualisering af cellevækst og infiltration ved hjælp af forskellige velkendte teknikker, såsom immunofluorescens og standard H&E. Det er vigtigt at visualisere cellerne sammen med karakteriseringen af vækst ved hjælp af biokemiske assays på grund af mangfoldigheden af cellemorfologi og vækstmønstre på stilladser. Forståelse af vækstmønsteret kan give indsigt i vækstadfærd og fremtidig reaktion på kræftmedicin. For eksempel giver IMR32-vækst ved hjælp af DNA-kvantificering lignende mønstre som Kelly, selvom IMR32 ved visualisering ved hjælp af H&E vokser i større klynger end Kelly, som viste mere spredt vækst (figur 9). Disse varierede vækstmønstre af cellelinjer i stilladser afspejler det kliniske scenario for tumorheterogenitet. Undersøgelse af lægemiddelrespons mod kræft ved hjælp af et panel af cellelinjer med forskellige morfologier i 3D-stilladser vil øge den prædiktive værdi for patientens respons på de samme lægemidler.
Påvisning af gen- eller proteinekspression kan også udføres ved hjælp af andre tilgange såsom RT-qPCR eller ELISA, hvis proteinet af interesse udskilles. En surrogatmarkør for neuroblastomprogression, chromogranin A (CgA)36, blev brugt til yderligere at karakterisere neuroblastomcellevækst i 3D. Som beskrevet i tidligere arbejde17 steg CgA-sekretionen, efterhånden som cellerne spredte sig (figur 10). Mens enkeltlagscellekultur ikke kunne fange denne stigning, da spredning betød, at celler nåede fuld sammenløb i kulturskålene, tillod brugen af 3D-kollagenstilladserne langvarig vurdering af CgA-sekretion.
Denne 3D in vitro-model er muligvis ikke egnet til alle forskningsspørgsmål til undersøgelse af neuroblastombiologi og respons på terapi. En af begrænsningerne er ujævn celleindtrængning i stilladser og dannelse af celleklynger af varierende størrelse, som afhænger af en given cellelinje og kan føre til ukontrollabel diffusion af næringsstoffer og testlægemidler. Denne funktion påvirker robustheden i terapeutisk screening. På trods af denne begrænsning er det imidlertid vigtigt at overveje, at indfødte tumorer også er heterogene i størrelse og kræftcellefordeling og indeholder mange andre celletyper i tumorvævet. For at overvinde denne begrænsning foreslår vi brugen af hvert cellebefolket stillads som et enkelt mikrovæv, for hvilket følgende parametre vil blive optimeret: (a) inkubationstider for cellelevedygtighedsreagenset for at nå cellerne og celleklyngerne og (b) lysering af cellerne i Triton X-100-buffer ved forbehandling af celler på stilladser med en vævslyser for at frigive DNA'et fra cellerne indeholdt dybt i stilladset.
En anden teknisk begrænsning af denne protokol er manglen på mekanisk test af hvert parti nyfremstillede stilladser til denne model. Ved hjælp af stilladsets robuste fremstillingsproces, som i vid udstrækning er blevet karakteriseret i forhold til stilladsets fysiske og kemiske egenskaber, såsom tryk- og trækmodul, porøsitet og visuel porestruktur og homogenitet, sikres det imidlertid, at stilladskvaliteter opretholdes gennem batches 21,24,27,30,37.
Sammenfattende præsenterer dette papir en række enkle metoder til analyse af cellulær vækst på kollagenbaserede stilladser. Både den eksperimentelle tidslinje og analysepunkter kan udskiftes afhængigt af de specifikke forskningsspørgsmål. Denne protokol kan også tilpasses andre celletyper. Resultaterne vist ovenfor giver bevis for, hvordan denne samling af metoder gav indsigt i den optimale såtæthed for forskellige neuroblastomcellelinjer for at skabe kontinuerlig vækst over 14 dage. Sammenlægningen af resultater opnået fra alle metoderne i denne protokol giver en overlegen forståelse af cellevækst inden for 3D-kollagenmatrixen. Fremtidig anvendelse af denne model vil sandsynligvis involvere samkultursystemer, der er specifikke for neuroblastoma TME og testning af forskellige nye kræftlægemidler.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

Neuroblastom er en pædiatrisk kræft i det sympatiske nervesystem, der opstår under embryonal udvikling eller tidligt postnatalt liv på grund af transformationen af neurale kamceller1. Det er den mest almindelige solide ekstrakranielle tumor hos børn, der repræsenterer 8% af de maligniteter, der diagnosticeres hos patienter under 15 år og er ansvarlig for 15% af alle dødsfald hos børnekræft. Sygdommen viser meget heterogen klinisk adfærd på grund af specifikke kromosomale, genetiske og epigenetiske ændringer og histopatologiske træk.
Disse ændringer bidrager til aggressiviteten af neuroblastom og dårlige resultater hos pædiatriske patienter. Derfor viser de nuværende behandlinger sig ineffektive på lang sigt for næsten 80% af patienterne med den klinisk aggressive sygdom2, hvilket understreger, at behandling for denne gruppe patienter fortsat er udfordrende. Dette skyldes sandsynligvis, at mekanismerne for neuroblastom, heterogenitet og metastaser stadig ikke forstås fuldt ud. Imidlertid antages tumormikromiljøet (TME) nu bredt at spille en rolle i udviklingen af mange kræftformer; Alligevel er det stadig underundersøgt i neuroblastom 3,4.
Den oprindelige TME er et komplekst 3D-mikromiljø, der involverer kræftceller og ikke-kræftceller omgivet af en ECM. ECM refererer til den acellulære komponent i et væv, der giver strukturel og biokemisk støtte til dets cellulære beboere og bidrager til sygdomsprogression, patientprognose og terapeutisk respons5. Denne fremme af sygdomsprogression skyldes "dynamisk gensidighed" eller løbende tovejskommunikation mellem celler og ECM 6,7,8. Efterhånden som kræft skrider frem, omorganiseres stromalkollagen ofte i lineære mønstre vinkelret på stroma-cancer-grænsefladen, som kræftceller bruger som migrationsrute til metastase 9,10,11.
Hovedkomponenterne i dette indfødte funktionelle biologiske stillads inkluderer et fibrøst netværk af kollagener type I og II og andre proteiner, herunder elastin, glycoproteiner såsom laminin samt en række proteoglycaner og andre opløselige komponenter12,13. Disse proteiner fra den oprindelige ECM er nu blevet attraktive naturlige biomolekyler til udvikling af 3D in vitro modeller3. Anvendelsen af 3D-stilladser til in vitro-cellekultur er stigende i popularitet på grund af dens større fysiologiske repræsentation af TME sammenlignet med traditionel 2D-monolagskultur. De fremstillede 3D-stilladser hjælper cellebinding, spredning, migration, metabolisme og respons på stimuli set i in vivo biologiske systemer.
Hovedkomponenten i disse 3D-stilladser er kollagen, som er en nøglespiller i mange normale biologiske processer, herunder vævsreparation, angiogenese, vævsmorfogenese, celleadhæsion og migration11. Kollagenbaserede 3D-matricer har vist deres robuste funktionalitet til at modellere ECM, der fungerer som et in vitro biomimetisk mikromiljø, samtidig med at de muliggør celle-ECM-interaktioner samt cellemigration og invasion. Disse 3D-matricer giver også en mere nøjagtig analyse af cellerespons på kemoterapeutiske lægemidler end traditionel 2D eller "flad" kultur i mange kræftmodeller 14,15,16, herunder neuroblastom 17,18. Genetisk analyse af 3D-cellekulturer har rapporteret en højere korrelation med den humane vævsprofil, selv sammenlignet med dyremodeller19. Samlet set er hjørnestenen i disse 3D-stilladser at give celler et passende in vitro-miljø, som rekapitulerer den oprindelige vævsarkitektur og letter tovejs molekylær krydstale8.
For at øge kompleksiteten af kollagenbaserede modeller inkorporeres andre almindelige ECM-komponenter i vævsteknologiprocessen, hvilket skaber mere fysiologisk relevante modeller til at afspejle niche-TME'er i forskellige væv. For eksempel letter GAG'er, negativt ladede polysaccharider, der findes i alle pattedyrvæv20, cellebinding, migration, proliferation og differentiering. Chondroitinsulfat er en specifik type GAG, der findes i knogle og brusk, som tidligere har været anvendt i vævstekniske applikationer til knoglereparation 21,22,23,24,25. Nanohydroxyapatit (nHA) er den vigtigste uorganiske bestanddel af mineralsammensætningen i humant knoglevæv, der udgør op til 65 vægtprocent af knoglen26 og derfor i vid udstrækning anvendes til knogleudskiftning og regenerering27. GAG'er og nHA er således attraktive kompositter til rekonstruktion af det primære neuroblastom ECM og modellering af de mest almindelige metastatiske steder for neuroblastom, knoglemarv (70,5%) og knogle (55,7%)28.
Stilladser, der indeholder disse ECM-komponenter, blev oprindeligt udviklet til knoglevævstekniske applikationer med omfattende analyse af deres biokompatibilitet, toksicitet og osteokonduktive og osteoinduktive egenskaber29,30. De er porøse, kollagenbaserede matricer produceret ved hjælp af frysetørringsteknikker til at kontrollere deres fysiske og biologiske egenskaber. Kollagenstilladserne suppleret med enten nHA (Coll-I-nHA) eller chondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG) viste succes med at efterligne den primære TME i brystkræft31 og metastase til knogle i prostatacancer15 samt neuroblastom17. Den frysetørringsteknik, der anvendes til fremstilling af disse sammensatte stilladser, giver reproducerbar homogenitet i porestørrelse og porøsitet inden for stilladserne22,23,24. Kort fortalt fremstilles en kollagensopslæmning (0,5 vægt%) ved at blande fibrillært kollagen med 0,05 M eddikesyre. For Coll-I-GAG tilsættes 0,05 vægt% chrondoitin-6-sulfat isoleret fra hajbrusk til kollagenopslæmningen under blanding. Til de sammensatte Coll-I-nHA-stilladser syntetiseres hydroxyapatitpartikler i nanostørrelse som tidligere beskrevet27 og tilsættes til kollagensopslæmningen i forholdet 2: 1 til vægten af kollagen under blandingsprocessen. Alle stilladser er fysisk tværbundet og steriliseret ved hjælp af en dehydrotermisk behandling ved 105 °C i 24 timer25. Cylindriske stilladser (6 mm diameter, 4 mm højde) opnås ved hjælp af en biopsistans og kan kemisk tværbindes med 3 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid og 5,5 mM N-hydroxysuccinimid (EDAC / NHS) i destilleret vand (dH2O) for at forbedre konstruktionernes mekaniske egenskaber30. Denne veloptimerede fremstillingsproces af to kollagenstilladser skaber stilladser med reproducerbare mekaniske egenskaber, herunder porestørrelse, porøsitet og stivhed (kPa). Både Coll-I-GAG og Coll-I-nHA stilladser har forskellige fysiske egenskaber, hvilket skaber forskellige miljøforhold. Egenskaberne for hvert stillads er vist i tabel 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Coll-I-GAG</td>
			<td>Coll-I-nHA</td>
		</tr><tr><td>Stillads størrelse (diameter [mm] x højde [mm])</td>
			<td>6 x 4 17</td>
			<td>6 x 4 17</td>
		</tr><tr><td>Kollagenkoncentration (vægtprocent)</td>
			<td>0.5 17</td>
			<td>0.5 17</td>
		</tr><tr><td>Substratkoncentration (vægtprocent) [baseret på vægten af kollagen]</td>
			<td>0,05 15,17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>Gennemsnitlig porestørrelse (mm)</td>
			<td>96 22</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>Porøsitet (%)</td>
			<td>99,5 23</td>
			<td>98,9 – 99,4 27</td>
		</tr><tr><td>Stivhed (kPa)</td>
			<td>1.5 27</td>
			<td>5,5 - 8,63 29</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Oversigt over de mekaniske egenskaber af de to stilladser, der er vedtaget til undersøgelse af neuroblastombiologi.
Dette papir beskriver en protokol til samling af et 3D-stilladsbaseret system for bedre at efterligne neuroblastommikromiljøet ved hjælp af neuroblastomcellelinjer og tidligere beskrevne kollagenbaserede stilladser suppleret med enten nHA (Coll-I-nHA) eller chondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG). Protokollen inkluderer downstream-metoder til at analysere neuroblastomcellernes vækstmekanismer i et mere fysiologisk relevant miljø ved hjælp af tidligere optimerede billige metoder tilpasset fra 2D-monolagskultur figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> Figur 1: Samlet protokolarbejdsgang. (A) Celler dyrkes til tilstrækkeligt antal, opdeles, tælles og resuspenderes i et passende volumen medium. (B) Denne cellestamme gennemgår derefter seriel fortynding for at fremstille i alt 4 cellesuspensioner med forskellige densiteter. (C) Kollagenbaserede stilladser er sterilt belagt i ikke-klæbende plader med 24 brønde, og (D) 20 μL cellesuspension tilsættes til midten af hvert stillads og efterlades til inkubation ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed i 3-5 timer. (E) Komplet vækstmedium (1 ml) tilsættes derefter langsomt til hvert stillads, og pladerne placeres tilbage i inkubatoren for at tillade cellevækst i den ønskede tidsramme. (F) På hvert forudbestemt tidspunkt hentes flere stilladser til cellelevedygtighed og vækstvurdering, genekspressionsanalyse og histologisk farvning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

Neuroblastom er den mest almindelige ekstrakranielle solide tumor hos børn, der tegner sig for 15% af de samlede pædiatriske kræftdødsfald. Det indfødte tumorvæv er et komplekst tredimensionelt (3D) mikromiljø, der involverer lag af kræftceller og ikke-kræftceller omgivet af en ekstracellulær matrix (ECM). ECM giver fysisk og biologisk støtte og bidrager til sygdomsprogression, patientprognose og terapeutisk respons.
Dette papir beskriver en protokol til samling af et 3D-stilladsbaseret system til efterligning af neuroblastommikromiljøet ved hjælp af neuroblastomcellelinjer og kollagenbaserede stilladser. Stilladserne suppleres med enten nanohydroxyapatit (nHA) eller glycosaminoglycaner (GAG'er), der naturligt findes i høje koncentrationer i knogle og knoglemarv, de mest almindelige metastatiske steder for neuroblastom. Den 3D porøse struktur af disse stilladser tillader neuroblastom cellebinding, proliferation og migration og dannelse af celleklynger. I denne 3D-matrix afspejler celleresponsen på terapi mere in vivo-situationen .
Det stilladsbaserede kultursystem kan opretholde højere celletætheder end konventionel todimensionel (2D) cellekultur. Derfor er optimeringsprotokoller for indledende såcellenumre afhængige af de ønskede eksperimentelle tidsrammer. Modellen overvåges ved at vurdere cellevækst via DNA-kvantificering, cellelevedygtighed via metaboliske assays og cellefordeling i stilladserne via histologisk farvning.
Denne models anvendelser omfatter vurdering af gen- og proteinekspressionsprofiler samt cytotoksicitetstest ved hjælp af konventionelle lægemidler og miRNA'er. 3D-kultursystemet giver mulighed for præcis manipulation af celle- og ECM-komponenter, hvilket skaber et miljø, der mere fysiologisk ligner naturligt tumorvæv. Derfor vil denne 3D in vitro-model fremme forståelsen af sygdomspatogenesen og forbedre sammenhængen mellem resultater opnået in vitro, in vivo i dyremodeller og mennesker.

Den kollagenbaserede stilladsmodel, der er beskrevet her, har mange anvendelser lige fra at studere neuroblastombiologi til screening af kræftbehandlinger i et miljø, der ligner mere fysiologisk indfødte tumorer end konventionel 2D-cellekultur. Før du tester et givet forskningsspørgsmål, er det afgørende at opnå en fuldstændig karakterisering af cellebinding, proliferation og infiltration inden for den ønskede eksperimentelle tidsramme. Vækstbetingelserne afhænger af biologien for hver specifik cellelinje. Det er vigtigt, at flere metoder til vurdering af cellevækst skal implementeres for at bestemme optimale forhold og robust ydeevne.
Her blev levedygtigheden af neuroblastomceller dyrket på stilladser vurderet ved hjælp af en kolorimetrisk cellelevedygtighedsanalyse. Dette assay kan udføres så ofte som ønsket i hele den eksperimentelle tidsramme. For det beskrevne eksperiment blev cellelevedygtighedsvurdering udført på dag 1, 7 og 14 for to neuroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på Coll-I-nHA-stilladser ved 4 forskellige tætheder (figur 6). Levedygtighed på dag 1 blev fastsat som en baseline for at sammenligne alle efterfølgende målinger. Reduktionshastigheden for reagenset af cellelevedygtighedsreagenset afspejler cellebiologien og vækstegenskaberne for de enkelte cellelinjer, herunder deres proliferationshastigheder og metabolisme. Der forventedes en sammenhæng mellem antallet af celler, der blev sået på stilladserne, og reduktionsniveauet. I dette eksperiment steg reduktionen af cellelevedygtighedsreagenset generelt med hvert tidspunkt for begge cellelinjer ved alle tætheder som forventet.
Hver tæthed blev derefter vurderet individuelt for begge cellelinjer for at sammenligne reduktionen på tværs af tidspunkter. Envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest blev udført for at detektere signifikante forskelle i reduktion mellem tidspunkter (figur 7). For både cellelinjer og alle såtætheder var der en signifikant stigning (P<0,05) i reduktionen af cellelevedygtighedsreagenset, når dag 1 og dag 14 sammenlignes. Dette indikerede en signifikant stigning i metabolisk aktive celler til stede på stilladserne. Denne stigning var ikke signifikant i alle tilfælde, når man vurderede 7-dages intervallerne (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14), hvilket viser vigtigheden af optimering af såtætheden for at opnå det ønskede vækstvindue.
For at understøtte resultaterne af cellelevedygtighedsanalysen kan cellevækst på stilladser også indirekte måles via kvantificering af dsDNA ekstraheret fra stilladser ved hjælp af en fluorescerende dsDNA-plet (figur 8A). Ligesom cellelevedygtighed kan DNA-kvantificering udføres så ofte som ønsket inden for den eksperimentelle tidslinje. Denne analyse kræver imidlertid fuldstændig hentning af stilladser og afslutning af cellevækst og skal derfor indregnes i eksperimentel planlægning som diskuteret i afsnit 1. Til dette eksperiment blev DNA kvantificeret på dag 1, 7 og 14 for to neuroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på Coll-I-nHA-stilladser ved 4 forskellige tætheder. Da den gennemsnitlige koncentration af dsDNA pr. celle er kendt for disse cellelinjer, var det muligt at udlede antallet af celler pr. prøve fra det kvantificerede DNA (figur 8B).
DNA-kvantificering gav anledning til større variabilitet mellem biologiske replikater end vurdering af cellelevedygtighed, men steg generelt for hvert tidspunkt, hvor de højeste niveauer blev kvantificeret på dag 14. IMR32-celler ser ud til at nå højere celletal på Coll-I-nHA-stilladser, som angivet ved DNA-koncentration, end KellyLuc-celler. Hver tæthed blev derefter vurderet individuelt for de to cellelinjer for at sammenligne reduktionen på tværs af tidspunkter. Envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest blev udført for at detektere signifikante forskelle i reduktion mellem tidspunkter (figur 8B).
For både cellelinjer og alle såtætheder var der en signifikant stigning (P<0,05) i celleantallet, når man sammenlignede dag 1 og dag 14, med undtagelse af KellyLuc ved såtæthed 4 (1 × 105 celler / stillads), hvilket ikke gav signifikante stigninger på tværs af nogen af tiderne. I lighed med resultaterne af cellelevedygtigheden var stigningerne ikke signifikante i alle tilfælde, når 7-dages intervallerne blev vurderet (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14). Når man sammenlignede tidstendenserne for cellelevedygtighed og DNA-kvantificering, var der nogle små forskelle mellem de to analyser. Der blev dog generelt observeret lignende tendenser, idet gennemsnitsværdierne steg mellem 7-dages intervaller for de fleste tætheder. Dette viser vigtigheden af at overvåge cellevækst ved hjælp af mere end én metode.
En visuel vurdering af cellevækstmorfologi og fordeling på stilladserne blev derefter implementeret, der omfattede traditionel hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning samt IHC. Det forventes, at de forskellige vækstmønstre for individuelle cellelinjer vil føre til varierede rumlige arrangementer på stilladser, herunder forskellige grader af penetration i stilladset og celleklynger. Stilladser blev formalinfastgjort, paraffinindlejret og skåret i 5 mm sektioner (figur 9A) og forberedte stilladserne til flere visualiseringsteknikker, herunder histologisk farvning og IHC.
Rutinemæssig H&E-farvning blev anvendt på Kelly-, KellyCis83- og IMR32-celler dyrket på kollagenbaserede stilladser på dag 1, 7 og 14 (figur 9B). Dette tillod visualisering af cellernes rumlige orientering på to kollagenbaserede stilladser over en 14-dages periode. Cisplatinfølsomme Kelly-celler og resistente KellyCis83-celler blev dyrket på både Coll-I-nHA-stilladser (figur 9B, i) og Coll-I-GAG-stilladser (figur 9B, ii). I overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data voksede KellyCis83-celler med en højere hastighed og infiltrerede dybere ind i begge stilladssammensætninger end den mindre invasive Kelly-cellelinje. H&E-pletten på en anden neuroblastomcellelinje, IMR32, dyrket på Coll-I-nHA viser et kontrasterende vækstmønster (figur 9B, iii). Denne cellelinje voksede i store, tætpakkede klynger på kollagenstilladserne i løbet af den 14-dages periode. Brightfield konfokalmikroskopi kan bruges til at visualisere den porøse arkitektur af kollagenbaserede stilladser (figur 9C) på grund af autofluorescensen af kollagenfibre.
Vi farvede celler med phalloidin rettet mod cytoskeletal actin og den nukleare modplet, 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), for at overvåge specifikke celletræk gennem hele den eksperimentelle tidslinje. En overflod af actin blev observeret i Kelly og KellyCis83 celler på Coll-I-GAG stilladser ved hjælp af denne teknik (figur 9D). Disse resultater viser, hvordan flere billeddannelsesteknikker kan bruges til at udlede rumligt opløst information fra neuroblastomceller dyrket på stilladser ved hjælp af denne protokol. Denne karakterisering af cellevækstmønstre på kollagenbaserede stilladser over en given periode vil forbedre forståelsen og fortolkningen af eventuelle downstream biokemiske assays.
Proteinekspression af celler dyrket på kollagenbaserede stilladser kan analyseres for at sammenligne cellulær aktivitet med in vivo-scenarier . Tidligere offentliggjorte data undersøgte ekspressionen af chromogranin A (CgA) som en surrogatudskilt markør for neuroblastom af KellyLuc- og KellyCis83Luc-celler dyrket i cellemonolag såvel som på Coll-I-nHA og Coll-I-GAG stilladser (figur 10). CgA blev vurderet i det konditionerede medie ved anvendelse af et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) (figur 10A). CgA udskilles med en højere hastighed i den mere aggressive kemoresistente KellyCis83-cellelinje end i Kelly (figur 10B, C). Dette var signifikant på dag 7 på både Coll-I-GAG og Coll-I-nHA stilladser (P<0,05), mens der ikke var nogen signifikant forskel på dette tidspunkt for celler dyrket som et monolag ved konventionel 2D-kultur.
Disse resultater fremhæver også den begrænsede eksperimentelle tidslinje, når der dyrkes celler i et monolag, hvor kun 7 dages vækst viser sig mulig, før cellerne når sammenløb. Væksten af celler på stilladser overvinder denne begrænsning, da de kan opretholdes over en længere periode under mere fysiologisk relevante forhold. Ovennævnte kombination af teknikker til at erhverve information om cellelevedygtighed, DNA-indhold, cellulær morfologi og rumligt arrangement og ekspressionsprofiler letter vurderingen af væksten af neuroblastomceller på en række kollagenbaserede stilladser. Denne protokol kan også let tilpasses til at opfylde specifikke eksperimentelle krav og ønskede applikationer.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig06.jpg"> Figur 6: Analyse af cellelevedygtighed. A) Generel procedure til måling af neuroblastomcellers levedygtighed på kollagenbaserede stilladser ved hjælp af en kolorimetrisk cellelevedygtighedsanalyse. Inkubationsperioden skal optimeres for hver ny cellelinje med henvisning til producentens retningslinjer. (B) Procentvis reduktion af cellelevedygtighedsreagens af KellyLuc- og IMR32-celler dyrket på Coll-I-nHA-stilladser ved fire forskellige indledende såtætheder, målt på dag 1, 7 og 14. Prøverne blev vurderet i biologisk tredobbelt med fejlbjælker, der repræsenterede standardafvigelsen. Forkortelser: nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig07.jpg"> Figur 7: Cellelevedygtighed ved såtæthed for celler dyrket på Coll-I-nHA over en 14-dages periode. a) KellyLuc B) IMR32. Navngivne cellenumre henviser til den indledende cellesåningstæthed på stilladserne på dag 0. Prøverne blev vurderet i biologisk triplicat, angivet med tredobbelte punkter, hvor søjlerne repræsenterede gennemsnittet. One-Way ANOVA med flere sammenligninger blev brugt til at detektere signifikante forskelle i % cellelevedygtighed reagensreduktion på tværs af de tre tidspunkter, noteret på graferne (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Forkortelser: nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA; ANOVA = variansanalyse; ns = ikke signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig08.jpg"> Figur 8: Kvantificering af DNA ekstraheret fra celler i stilladser . (A) Proces til kvantificering af dsDNA fra celler dyrket på kollagenbaserede stilladser ved hjælp af en fluorescerende dsDNA-plet. (B) Celleantal fra DNA-kvantificeringsanalyse ved såtæthed for KellyLuc- og IMR32-celler dyrket på Coll-I-nHA over en periode på 14 dage. Navngivne cellenumre henviser til den indledende cellesåningstæthed på stilladser på dag 0. Prøverne blev vurderet i biologisk triplicat, angivet med tredobbelte punkter, hvor søjlerne repræsenterede gennemsnittet. One-Way ANOVA med flere sammenligninger blev brugt til at detektere signifikante forskelle i cellenumre på tværs af de tre tidspunkter, noteret på graferne (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Forkortelser: nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA; dsDNA = dobbeltstrenget DNA; TE = Tris-EDTA; ANOVA = variansanalyse; ns = ikke signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig09.jpg"> Figur 9: Vævsbehandlingstrin til immunhistokemisk analyse af stilladser . (A) Skematisk gengivelse af protokollen til behandling af stilladser til billedanalyse. Denne proces tillader rutinemæssig histologisk farvning og specifik antistofsondering ved hjælp af primære antistoffer og fluorescerende mærkede sekundære antistoffer. (B) Repræsentative billeder af tre neuroblastomcellelinjer, der udsættes for H&E-farvning. H&E-billeder tages på dag 1, 7, 14 for at overvåge vækstmønstre i løbet af eksperimentet. Skalabjælke = 200 μm. Stiplede firkanter repræsenterer det område, der blev valgt til zoomede 20x billeder i nederste venstre kant. Skalabjælke = 20 μm. (i og ii) H&E af Kelly og KellyCis83 neuroblastomcellelinjer (henholdsvis øvre og nedre paneler) på to typer kollagenbaserede stilladser. (iii) H&E af IMR32-cellelinje, der repræsenterer klynget cellulær vækst på Coll-I-nHA-stilladset. (C) Repræsentativt billede af Kelly-cellelinjen, udsat for brightfield konfokal mikroskopi. Kollagenautofluorescensen tillader visualisering af det porøse stillads. 10x skalabjælke = 200 μm, 20x skalabjælke = 20 μm. (D) Repræsentativt billede af indlejrede stilladser efterfulgt af analyse af IHC med phalloidin og DAPI ved 10x forstørrelse, skalabjælke = 200 μm. Mindre indvendige firkanter repræsenterer zoomede billeder (20x), skalabjælke = 20 μm. Forkortelser: nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA; GAG = glycosaminoglycan; Coll-I-GAG = kollagenstilladser suppleret med chondroitin-6-sulfat; H&E = hæmatoxylin og eosin; IHC = immunhistokemi; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig10.jpg"> Figur 10: Proteinekspression af neuroblastomceller dyrket på 3D-kollagenbaserede stilladser sammenlignet med 2D-plast. (A) Et skema over, hvordan CgA ELISA blev udført på konditionerede medier af celler dyrket på 2D-plast- eller 3D-kollagenbaserede stilladser. (B) CgA-proteinekspressionsniveauer taget fra konditionerede medier af celler dyrket på et 2D-plastmonolag. Da cellerne nåede sammenløb efter 7 dage, var 14-dages tidspunktet ikke læsbart. På dag 7 på plast var der ingen signifikant forskel i CgA-niveauer mellem Kelly og KellyCis83-cellelinjer. C) CgA ELISA udført ved hjælp af konditionerede medier af celler dyrket på kollagenbaserede stilladser i 14 på hinanden følgende dage. På dag 7, på begge kollagenstilladser, er CgA-niveauerne højere i den mere aggressive KellyCis83-cellelinje, hvilket fremhæver mere fysiologisk relevante niveauer af CgA i 3D-matrix sammenlignet med 2D-monolag. Dette tal er blevet ændret fra Curtin et al.17. Forkortelser: 3D = tredimensionel; 2D = todimensionel; CgA = chromogranin A; ELISA = enzymbundet immunosorbentassay nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA; GAG = glycosaminoglycan; Coll-I-GAG = kollagenstilladser suppleret med chondroitin-6-sulfat; TMB = 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin; HRP = peberrodsperoxidase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Dette papir viser de trin, der kræves for at frø neuroblastomcellelinjer på tidligere beskrevne tredimensionelle kollagenbaserede stilladser, opretholde cellevækst i en forudbestemt tidsramme og hente stilladser til flere cellevækst- og celleadfærdsanalyser og downstream-applikationer, der kan tilpasses til at tilfredsstille en række eksperimentelle mål.

Tredimensionel in vitro biomimetisk model af neuroblastom ved hjælp af kollagenbaserede stilladser

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Vores protokol tilbyder en 3D bio-manipuleret model, der tæt påvirker det oprindelige væv. Dette kan potentielt bruges til at opdage nye behandlinger og biomarkører til behandling og diagnose af neuroblastom. Den største fordel er, at det skaber mere fysiologisk relevante eksperimentelle betingelser for at studere tumormikromiljøet ved hjælp af en reproducerbar teknik, der opnår batch til batchkonsistens.Vores stilladsmetode kan for det første bruges til at identificere nye lægemidler til neuroblastom og for det andet til at inkorporere patientafledte celler for bedre forudsigelse af individuel patientrespons. Til at begynde med skal du placere stilladset, der er opbevaret i PBS, i laminar flowhætten. Brug steril pincet til forsigtigt at løfte stilladset fra hjørnet, og tryk mod sidevæggen for at fjerne overskydende PBS.Placer derefter stilladset med det skinnende lag nedad i midten af brønden på en ikke-klæbende 24-brøndplade. Mærk pladen med detaljer om cellelinjen, såtætheden og tidspunkterne. Arbejd med cellerne med en såtæthed ad gangen, og hold de resterende celler ved 37 grader Celsius i inkubatoren, indtil de er klar til brug.Til cellefastgørelsen i stilladset skal du bruge en P20-pipette med sterile spidser til grundigt at blande cellesuspensionen og tilføje 20 mikroliter af den relevante cellesuspension i midten af hvert stillads, hvilket sikrer, at cellesuspensionen forbliver oven på stilladset og ikke på sidevæggen eller bunden af brønden. Lad cellerne sætte sig fast i tre til fem timer ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid og 95% fugtighed. Ved afslutningen af inkubationen skal du bruge en P1000-pipette til langsomt at tilføje en milliliter forvarmet vækstmedium til hver brønd, forhindre forskydning af stilladserne og inkubere pladen natten over.Overhold stilladserne i første omgang hver anden til tredje dag for farveændringer af vækstmediet, når cellerne spredes inden for stilladset. Brug en 10 ml pipettepistol med langsom tilstand til at fjerne og kassere en milliliter af det brugte medium fra brønden. Når det konditionerede medium anvendes til forsøget, opsamles det brugte medium af de biologiske replikater i et 15 ml centrifugerør og pellet ned det cellulære affald ved centrifugering.Supernatanten overføres til et frisk glas og opbevares ved minus 80 grader Celsius. Når pipettepistolen er sat i dryptilstand, tilsættes forsigtigt to ml forvarmet vækstmedium til stilladserne. Inkuber den stilladsholdige plade og genopfyld det friske medium i løbet af den ønskede vækstperiode som vist.I laminar strømningshætten steriliseres det passende cellelevedygtighedsassayreagens ved filtrering gennem et 0,2 mikrometer sterilt filter i et centrifugerør. Forvarm den sterile opløsning, komplet vækstmedium og steril PBS i vandbadet ved 37 grader Celsius. Brug sterile pincetter til at overføre stilladserne, der skal analyseres i en frisk plade med 24 brønde, og mærk pladen med alle relevante detaljer.Tilsæt 900 mikroliter af det forvarmede vækstmedium til hver brønd. Derefter tilsættes 100 mikroliter af det sterile cellelevedygtighedsreagens til hver brønd. For en negativ kontrol tilsættes 900 mikroliter medium og 100 mikroliter af det sterile cellelevedygtighedsreagens i en brønd uden stillads.Sæt låget på pladen igen, og vip forsigtigt pladen i ca. tre minutter for at fordele det fortyndede cellelevedygtighedsreagens gennem brønden. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid og 95% fugtighed. Når du har fjernet pladen fra inkubatoren, skal du forsigtigt vippe pladen i et par sekunder og generere triplicaterne, som vist i tekstmanuskriptet.Generer de tekniske triplikater ved at overføre 100 mikroliter af det inkuberede medium og reagens fra en brønd i 24-brøndpladen til en brønd i den gennemskinnelige 96-brøndplade, og udfør dette trin i alt tre gange for en brønd. Dæk 96-brøndpladen med aluminiumsfolie for at beskytte cellelevedygtighedsreagenset mod lys. Fjern og kassér de resterende 700 mikroliter medium og reagens fra stilladserne i 24-brøndpladen.Vask hvert stillads to gange med en milliliter steril PBS. Brug en mikropladelæser til at måle absorbansen ved 570 og 600 nanometer, og beregn den procentvise reduktion af cellelevedygtighedsreagenserne i henhold til producentens anbefalinger. Analysér resultaterne af cellelevedygtigheden statistisk ved hjælp af passende software.Indtast de biologiske tredobbelte værdier for at frembringe fejlbjælker og angive analysevariabiliteten. Udfør en envejsanalyse af varianstest for at undersøge ændringerne i cellelevedygtighed over den eksperimentelle tidsramme ved hjælp af passende biostatistisk software. Angiv signifikante forskelle mellem tidspunkterne på graferne, som beskrevet i tekstmanuskriptet.Levedygtigheden af to neuroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på stilladserne, blev vurderet. Den øgede celletæthed resulterede i mere reduktion af cellelevedygtighedsreagenset med tiden. Cellevæksten på stilladserne blev indirekte målt ved at kvantificere DNA'et ekstraheret fra stilladserne, og cellerne pr. prøve blev beregnet.IMR32-cellerne viste øget vækst, derefter KellyLuc-celler, med tiden. Vækstmorfologien og fordelingen af celler på stilladserne blev visuelt vurderet ved hæmatoxylin, eosin og immunhistokemisk farvning. KellyCis83-celler voksede hurtigere og infiltrerede dybere ind i begge stilladssammensætninger end den mindre invasive Kelly-cellelinje.IMR32 dyrket på nanohydroxyapatit viste et kontrasterende vækstmønster med store, tætpakkede klynger over 14 dage. De cellespecifikke træk blev overvåget ved immunhistokemisk farvning efterfulgt af phalloidin- og DAPI-farvning, og forekomsten af actin blev observeret i Kelly- og KellyCis83-celler på kollagen-glycosaminoglycan-stilladser. Til in vitro-cellulær aktivitetsvurdering blev udskillede niveauer af chromogranin A målt, og cellerne dyrket på kollagen-glycosaminoglycan og kollagen nano-hydroxyapatitstilladser producerede mere kromogranin A sammenlignet med væksten på konventionel 2D-kultur.Den kemoresistente KellyCis83-cellelinje udskilte mere kromogranin A end Kelly-cellelinjen. Efter cellevedhæftning kan celler behandles med forskellige behandlinger. Dette ville give mere fysiologisk relevante resultater for cellernes respons på lægemidler end konventionel 2D-kultur.Denne teknik giver forskere mulighed for bedre at undersøge, hvordan kræftceller opfører sig og reagerer på en stimulus i tumormikromiljøet, lige fra respons på terapi eller interaktioner med andre celletyper.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Undersøgelse af virusvektorer i et tredimensionalt Lever Model genbefolket med Human hepatocellulært carcinom HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensionale Invasion Assay protokol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvågning af tre-dimensionelle Tumor Spheroids bruge optisk kohærens tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tre-dimensionelle knogle ekstracellulære Matrix Model for osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Fuldt humant tumor-baserede matrix i tredimensionale Spheroid invasion assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tre-dimensionel model af sfæroider til undersøgelse tyktarmskræft stamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafisk model af neuroblastom metastase

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

En tredimensionel spheroid model til at undersøge tumor-stromal interaktion i hepatocellulær karcinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...