Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het National Children's Research Centre (NCRC), Irish Research Council (IRC) en Neuroblastoma UK. De illustraties zijn gemaakt met behulp van BioRender.

<ol>
	<li>Davidoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).</li><li>Matthay, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).</li><li>Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+the+3D+microenvironment+on+cancer+cell+behaviour+and+treatment+responsiveness:+a+recent+update+on+lung,+breast+and+prostate+cancer+models.">Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models.</a> Acta Biomaterialia. , (2021).</li><li>Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+the+genes,+the+tumor+microenvironment+in+neuroblastoma.">More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma.</a> Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).</li><li>Walker, C., Mojares, E., Del R&#237;o Hern&#225;ndez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+matrix+in+development+and+cancer+progression.">Role of extracellular matrix in development and cancer progression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).</li><li>Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+extracellular+matrix+direct+gene+expression.">How does the extracellular matrix direct gene expression.</a> Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).</li><li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reciprocity+in+the+wound+microenvironment.">Dynamic reciprocity in the wound microenvironment.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Medicine. 6, 11 (2008).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Medicine. 4, 38 (2006).</li><li>Ouellette, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+collagen+jungle:+The+biomedical+potential+of+fiber+organization+in+cancer.">Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer.</a> Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Hume, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell+invasiveness+and+response+to+chemotherapeutics+in+adipocyte+invested+3D+engineered+anisotropic+collagen+scaffolds.">Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).</li><li>Fitzgerald, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+collagen-based+scaffolds+to+simulate+prostate+cancer+bone+metastases+with+potential+for+evaluating+delivery+of+nanoparticulate+gene+therapeutics.">The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics.</a> Biomaterials. 66, 53-66 (2015).</li><li>Sapudom, J., Pompe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+tumor+microenvironments+based+on+collagen+matrices.">Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices.</a> Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).</li><li>Curtin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+relevant+3D+collagen-based+scaffold-neuroblastoma+cell+system+exhibits+chemosensitivity+similar+to+orthotopic+xenograft+models.">A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models.</a> Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).</li><li>Gavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+invasion+strategies+are+regulated+by+the+extracellular+matrix.">Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix.</a> Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).</li><li>Casal, e. J., Crane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry, Glycosaminoglycans. , (2019).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+freezing+rate+on+pore+structure+in+freeze-dried+collagen-GAG+scaffolds.">Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).</li><li>Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinking+and+mechanical+properties+significantly+influence+cell+attachment,+proliferation,+and+migration+within+collagen+glycosaminoglycan+scaffolds.">Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).</li><li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment,+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).</li><li>Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+dehydrothermal+treatment+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).</li><li>Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nanohydroxyapatite+nanocomposites+for+bone+tissue+engineering.">Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering.</a> ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).</li><li>Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterisation+of+a+collagen+nano-hydroxyapatite+composite+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering.</a> Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+hydroxyapatite+incorporation+methods+on+the+structural+and+biological+properties+of+porous+collagen+scaffolds+for+bone+repair.">Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).</li><li>Tierney, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+collagen+concentration+and+crosslink+density+on+the+biological,+structural+and+mechanical+properties+of+collagen-GAG+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).</li><li>Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteomimicry+of+mammary+adenocarcinoma+cells+in+vitro;+increased+expression+of+bone+matrix+proteins+and+proliferation+within+a+3D+collagen+environment.">Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment.</a> PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).</li><li>Nolan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+neuroblastoma:+advances+and+challenges.">Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges.</a> Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).</li><li>Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+cell+responses+in+threedimensional+conductive+collagen+gel+scaffolds+with+conductive+polymer+nanofibres+for+tissue+regeneration.">Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration.</a> Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).</li><li>Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+analyze+three-dimensional+cell+distribution+and+infiltration+in+degradable+scaffolds.">Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).</li><li>do Amaral, R. J. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalising+collagen-based+scaffolds+with+platelet-rich+plasma+for+enhanced+skin+wound+healing+potential.">Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).</li><li>Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogranin+A+as+a+valid+marker+in+oncology:+Clinical+application+or+false+hopes.">Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes.</a> World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).</li><li>O'Brien, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+permeability+and+cell+attachment+in+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering.">The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).</li></ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Het 3D-scaffold-kankercelmodel heeft bewezen een waardevol en veelzijdig hulpmiddel te zijn voor het verkrijgen van mechanistisch inzicht in de groei, levensvatbaarheid en infiltratie van neuroblastoomcellen in een vereenvoudigde TME32. Het hier beschreven 3D-neuroblastoommodel bootst de minimale TME na en levert meer fysiologisch relevante gegevens op dan een 2D-monolaagcultuur. Een groot nadeel van 3D-celkweek is de toegenomen experimentele complexiteit en langere tijdsbestekken. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven voor het zaaien, groeien en onderhouden van neuroblastoomcellen op op collageen gebaseerde steigers, gevolgd door stroomafwaartse analyses en toepassingen, wat een robuuste karakterisering van celgroei oplevert. We wilden inzicht krijgen in de optimale celseeding-dichtheid voor de steigers om een voorspelbare en controleerbare omgeving te creëren voor het beoordelen van behandelingen tegen kanker in een snel experimenteel venster van 14 dagen. De combinatie van al deze beschreven eenvoudige protocollen biedt een goed afgeronde beoordeling van de groei van neuroblastoomcellen in het op steigers gebaseerde in-vitrokweeksysteem .
De kritieke punten in de opzet van het protocol zijn benadrukt om wetenschappers in staat te stellen dit snel in hun laboratoria vast te stellen. De aangegeven incubatietijden voor betere prestaties van de colorimetrische cellevensvatbaarheidstest maken bijvoorbeeld een diepere penetratie van het reagens in de poriën van de steiger mogelijk om alle cellen te bereiken. Bovendien is de fluorescerende dsDNA-kleuringstechniek robuust en eenvoudig; het vrijkomen van DNA uit de steigers vereist echter krachtige cellyse, omdat de cellen 'gevangen' zitten in collageenvezels.
Met behulp van de beschreven eenvoudige DNA-kwantificeringstest kunnen we met behulp van dit model de loggroeifase identificeren op op collageen gebaseerde steigers voor screening op geneesmiddelen tegen kanker. In de beschreven experimentele setting werden 4 initiële celzaaidichtheden gebruikt met een totale periode van 14 dagen en analysetijdstippen op dag 1, 7 en 14. We hebben vastgesteld dat KellyLuc-cellen die op 4 × 105 cellen/scaffold zijn gezaaid, het meest significant actieve proliferatievenster hebben tussen dag 7 en 14. Deze groeigegevens van de logfase zullen een betrouwbare interpretatie van verschillende celcytotoxiciteitsexperimenten mogelijk maken. Het elimineert speculatie over een afname van de groei of celdood als gevolg van onderdrukte groei op het poreuze 3D-platform in plaats van door toxiciteit van geneesmiddelen. De levensvatbaarheid van cellen is ook een veelgebruikte beoordeling voor de geschiktheid van 3D-platforms om de groei van verschillende celtypen te ondersteunen33,34. Hoewel er veel tests zijn om de levensvatbaarheid van cellen te meten, waaronder levende/dode kleuring, ATP-meting, proliferatietests, vonden we het gebruik van de Alamar Blue colorimetrische cellevensvatbaarheidstest een eenvoudige en effectieve techniek om DNA-kwantificeringsgegevens te ondersteunen.
Het gecombineerde gebruik van DNA-kwantificering en cellevensvatbaarheid leverde complementair bewijs dat de optimale dichtheid om cellen op het schavot te zaaien om gedurende een periode van 14 dagen verdere groei te bereiken, gemiddeld 2-4 × 105 cellen/steiger is. Dit protocol kan echter eenvoudig worden aangepast om te voldoen aan verschillende experimentele tijdschema's, analysetijdstippen en stroomafwaartse toepassingen. Hoewel dit protocol de evaluatie van monocultuurcelgroei van neuroblastoomcellen op steigers beschrijft, zijn de steigers gemakkelijk aanpasbaar voor gebruik als platform voor co-cultuur, beschreven door do Amaral et al., die collageen-GAG-steigers gebruikten om keratinocyten en fibroblasten samen te kweken in een onderzoek naar wondgenezing35.
Het beschreven 3D-model maakt het mogelijk om celgroei en -infiltratie te visualiseren met behulp van verschillende bekende technieken, zoals immunofluorescentie en standaard H&E. Het is belangrijk om de cellen samen met de karakterisering van de groei te visualiseren met behulp van biochemische assays vanwege de diversiteit van de celmorfologie en groeipatronen op steigers. Inzicht in het groeipatroon kan inzicht geven in groeigedrag en toekomstige respons op geneesmiddelen tegen kanker. IMR32-groei met behulp van DNA-kwantificering levert bijvoorbeeld vergelijkbare patronen op als Kelly, hoewel IMR32 bij visualisatie met behulp van H&E in grotere clusters groeit dan Kelly, die meer verspreide groei vertoonde (Figuur 9). Deze gevarieerde groeipatronen van cellijnen in steigers weerspiegelen het klinische scenario van tumorheterogeniteit. Het onderzoeken van de respons op geneesmiddelen tegen kanker met behulp van een panel van cellijnen met verschillende morfologieën in 3D-steigers zal de voorspellende waarde voor de respons van de patiënt op dezelfde geneesmiddelen vergroten.
Detectie van gen- of eiwitexpressie kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere benaderingen zoals RT-qPCR of ELISA als het eiwit van belang wordt uitgescheiden. Een surrogaatmarker van neuroblastoomprogressie, chromogranine A (CgA)36, werd gebruikt om de groei van neuroblastoomcellen in 3D extra te karakteriseren. Zoals beschreven in eerder werk17, nam de CgA-secretie toe naarmate cellen zich vermenigvuldigden (Figuur 10). Hoewel monolaagse celkweek deze toename niet kon opvangen, omdat proliferatie betekende dat cellen volledige samenvloeiing bereikten in de kweekschalen, maakte het gebruik van de 3D-collageensteigers een langdurige beoordeling van de CgA-secretie mogelijk.
Dit 3D in vitro model is mogelijk niet geschikt voor alle onderzoeksvragen om de biologie van neuroblastoom en de respons op therapieën te bestuderen. Een van de beperkingen is ongelijke celpenetratie in steigers en de vorming van celclusters van verschillende grootte, die afhankelijk is van een bepaalde cellijn en kan leiden tot oncontroleerbare diffusie van voedingsstoffen en testmedicijnen. Deze eigenschap beïnvloedt de robuustheid van therapeutische screening. Ondanks deze beperking is het echter belangrijk om te bedenken dat inheemse tumoren ook heterogeen zijn in grootte en verdeling van kankercellen en vele andere celtypen in het tumorweefsel bevatten. Om deze beperking te overwinnen, stellen we voor om elke met cellen bevolkte steiger te gebruiken als een enkel microweefsel waarvoor de volgende parameters zullen worden geoptimaliseerd: (a) incubatietijden voor het cellevensvatbaarheidsreagens om de cellen en celclusters te bereiken, en (b) lysing van de cellen in Triton X-100-buffer door voorbewerking van cellen op steigers met een weefsellyser om het DNA van de cellen diep in de steiger vrij te maken.
Een andere technische beperking van dit protocol is het ontbreken van mechanische tests van elke batch nieuw vervaardigde steigers voor dit model. Het gebruik van het robuuste productieproces van de steigers, die uitgebreid zijn gekarakteriseerd met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de steigers, zoals druk- en trekmodulus, porositeit en visuele poriënstructuur en homogeniteit, zorgt er echter voor dat de kwaliteiten van de steiger behouden blijven door batches 21,24,27,30,37.
Samenvattend presenteert dit artikel een reeks eenvoudige methoden voor de analyse van cellulaire groei op op collageen gebaseerde steigers. Zowel de experimentele tijdlijn als de analysepunten kunnen worden uitgewisseld, afhankelijk van de specifieke onderzoeksvragen. Dit protocol is ook aanpasbaar aan andere celtypen. De hierboven getoonde resultaten leveren bewijs over hoe deze compilatie van methoden inzicht gaf in de optimale zaaidichtheid voor verschillende neuroblastoomcellijnen om continue groei gedurende 14 dagen te creëren. De samenvoeging van resultaten verkregen uit alle methoden in dit protocol levert een superieur begrip op van celgroei binnen de 3D-collageenmatrix. Toekomstig gebruik van dit model zal waarschijnlijk co-cultuursystemen omvatten die specifiek zijn voor het neuroblastoom TME en het testen van verschillende nieuwe geneesmiddelen tegen kanker.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

Neuroblastoom is een pediatrische kanker van het sympathische zenuwstelsel die ontstaat tijdens de embryonale ontwikkeling of het vroege postnatale leven als gevolg van de transformatie van neurale topcellen1. Het is de meest voorkomende solide extracraniale tumor bij kinderen, die 8% van de maligniteiten vertegenwoordigt die worden gediagnosticeerd bij patiënten jonger dan 15 jaar en is verantwoordelijk voor 15% van alle sterfgevallen door kanker bij kinderen. De ziekte vertoont zeer heterogeen klinisch gedrag als gevolg van specifieke chromosomale, genetische en epigenetische veranderingen, en histopathologische kenmerken.
Deze veranderingen dragen bij aan de agressiviteit van neuroblastoom en slechte resultaten bij pediatrische patiënten. Vandaar dat de huidige therapieën op de lange termijn niet effectief blijken te zijn voor bijna 80% van de patiënten met de klinisch agressieve ziekte2, wat benadrukt dat de behandeling voor deze groep patiënten een uitdaging blijft. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de mechanismen van neuroblastoomheterogeniteit en metastasen nog steeds niet volledig worden begrepen. Er wordt nu echter algemeen aangenomen dat de tumormicro-omgeving (TME) een rol speelt bij de progressie van veel kankers; Toch blijft het onderbelicht in neuroblastoom 3,4.
De natuurlijke TME is een complexe 3D-micro-omgeving met kankercellen en niet-kankercellen omgeven door een ECM. De ECM verwijst naar de acellulaire component van een weefsel die structurele en biochemische ondersteuning biedt aan de cellulaire bewoners en bijdraagt aan ziekteprogressie, prognose van de patiënt en therapeutische respons5. Deze bevordering van ziekteprogressie is te wijten aan "dynamische wederkerigheid" of voortdurende bidirectionele communicatie tussen cellen en de ECM 6,7,8. Naarmate kanker vordert, wordt stromaal collageen gereorganiseerd, vaak in lineaire patronen loodrecht op de stroma-kankerinterface, die kankercellen gebruiken als een migratieroute naar metastase 9,10,11.
De belangrijkste componenten van deze natuurlijke functionele biologische steiger zijn een vezelig netwerk van collagenen type I en II en andere eiwitten, waaronder elastine, glycoproteïnen zoals laminine, evenals een reeks proteoglycanen en andere oplosbare componenten12,13. Deze eiwitten van het natuurlijke ECM zijn nu aantrekkelijke natuurlijke biomoleculen geworden voor het ontwikkelen van 3D in vitro modellen3. De toepassing van 3D-steigers voor in vitro celkweek wordt steeds populairder vanwege de grotere fysiologische weergave van de TME in vergelijking met traditionele 2D-monolaagcultuur. De gefabriceerde 3D-steigers helpen bij celhechting, proliferatie, migratie, metabolisme en reactie op stimuli die worden gezien in in vivo biologische systemen.
Het hoofdbestanddeel van deze 3D-steigers is collageen, dat een belangrijke speler is in veel normale biologische processen, waaronder weefselherstel, angiogenese, weefselmorfogenese, celadhesie enmigratie11. Op collageen gebaseerde 3D-matrices hebben hun robuuste functionaliteit getoond om ECM te modelleren, en dienen als een in vitro biomimetische micro-omgeving en tegelijkertijd cel-ECM-interacties mogelijk maken, evenals celmigratie en -invasie. Deze 3D-matrices bieden ook een nauwkeurigere analyse van de celrespons op chemotherapeutische geneesmiddelen dan traditionele 2D- of "platte" cultuur in veel kankermodellen 14,15,16, waaronder neuroblastoom 17,18. Genetische analyse van 3D-celculturen heeft een hogere correlatie met het menselijke weefselprofiel gerapporteerd, zelfs in vergelijking met diermodellen19. Over het algemeen is de hoeksteen van deze 3D-steigers om cellen een geschikte in vitro-omgeving te bieden, die de oorspronkelijke weefselarchitectuur recapituleert en bidirectionele moleculaire overspraak vergemakkelijkt8.
Om de complexiteit van op collageen gebaseerde modellen te vergroten, worden andere gemeenschappelijke ECM-componenten opgenomen in het weefselmanipulatieproces, waardoor meer fysiologisch relevante modellen worden gecreëerd om niche-TME's van verschillende weefsels weer te geven. GAG's, negatief geladen polysacchariden die aanwezig zijn in alle zoogdierweefsels20, vergemakkelijken bijvoorbeeld celhechting, migratie, proliferatie en differentiatie. Chondroïtinesulfaat is een specifiek type GAG dat wordt aangetroffen in het bot en kraakbeen, dat eerder is gebruikt in weefselmanipulatietoepassingen voor botherstel 21,22,23,24,25. Nanohydroxyapatiet (nHA) is het belangrijkste anorganische bestanddeel van de minerale samenstelling van menselijk botweefsel, dat tot 65 gewichtsprocent van het bot uitmaakt26 en wordt daarom veel gebruikt voor botvervanging en -regeneratie27. GAG's en nHA zijn dus aantrekkelijke composieten voor het reconstrueren van de primaire neuroblastoom-ECM en het modelleren van de meest voorkomende metastatische plaatsen van neuroblastoom, beenmerg (70,5%) en bot (55,7%)28.
Scaffolds waarin deze ECM-componenten zijn verwerkt, zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor toepassingen op het gebied van botweefselengineering met uitgebreide analyse van hun biocompatibiliteit, toxiciteit en osteoconductieve en osteoinductieve eigenschappen29,30. Het zijn poreuze, op collageen gebaseerde matrices die worden geproduceerd met behulp van vriesdroogtechnieken om hun fysische en biologische eigenschappen te controleren. De collageensteigers aangevuld met nHA (Coll-I-nHA) of chondroïtine-6-sulfaat (Coll-I-GAG) toonden succes aan bij het nabootsen van de primaire TME bij borstkanker31 en metastase naar bot bij prostaatkanker15 en neuroblastoom17. De vriesdroogtechniek die wordt gebruikt om deze composietsteigers te vervaardigen, levert reproduceerbare homogeniteit in poriegrootte en porositeit op binnen de steigers22,23,24. In het kort wordt een collageenslurry (0,5 gew.%) vervaardigd door fibrillair collageen te mengen met 0,05 M azijnzuur. Voor Coll-I-GAG wordt tijdens het mengen 0,05 gew.% chrondoitine-6-sulfaat geïsoleerd uit haaienkraakbeen toegevoegd aan de collageensuspensie. Voor de composiet Coll-I-nHA-steigers worden hydroxyapatietdeeltjes van nanoformaat gesynthetiseerd zoals eerder beschreven27 en toegevoegd aan de collageensuspensie in een verhouding van 2:1 tot het gewicht van het collageen tijdens het mengproces. Alle steigers worden fysiek verknoopt en gesteriliseerd met behulp van een dehydrothermale behandeling bij 105 °C gedurende 24 uuren 25 minuten. Cilindrische steigers (6 mm diameter, 4 mm hoogte) worden verkregen met behulp van een biopsiepons en kunnen chemisch worden verknoopt met 3 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidehydrochloride en 5,5 mM N-hydroxysuccinimide (EDAC/NHS) in gedestilleerd water (dH2O) om de mechanische eigenschappen van de constructies te verbeteren30. Dit goed geoptimaliseerde productieproces van twee collageensteigers creëert steigers met reproduceerbare mechanische eigenschappen, waaronder poriegrootte, porositeit en stijfheid (kPa). Zowel Coll-I-GAG- als Coll-I-nHA-steigers hebben verschillende fysische eigenschappen, waardoor verschillende omgevingsomstandigheden ontstaan. De eigenschappen van elke steiger worden weergegeven in tabel 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Coll-I-GAG</td>
			<td>Coll-I-nHA</td>
		</tr><tr><td>Steiger Grootte (diameter [mm] x hoogte [mm])</td>
			<td>6 x 4 17</td>
			<td>6 x 4 17</td>
		</tr><tr><td>Collageenconcentratie (gew. %)</td>
			<td>0,5 17</td>
			<td>0,5 17</td>
		</tr><tr><td>Substraatconcentratie (gew. %) [op basis van het gewicht van collageen]</td>
			<td>0,05 15,17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>Gemiddelde poriegrootte (mm)</td>
			<td>96 22</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>Porositeit (%)</td>
			<td>99,5 23</td>
			<td>98,9 – 99,4 27</td>
		</tr><tr><td>Stijfheid (kPa)</td>
			<td>1.5 27</td>
			<td>5,5 - 8,63 29</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Overzicht van de mechanische eigenschappen van de twee steigers die zijn gebruikt voor het bestuderen van de biologie van neuroblastoom.
Dit artikel beschrijft een protocol voor het samenstellen van een op 3D-steigers gebaseerd systeem om de micro-omgeving van neuroblastoom beter na te bootsen met behulp van neuroblastoomcellijnen en eerder beschreven op collageen gebaseerde steigers aangevuld met nHA (Coll-I-nHA) of chondroïtine-6-sulfaat (Coll-I-GAG). Het protocol omvat stroomafwaartse methoden om de groeimechanismen van de neuroblastoomcellen in een meer fysiologisch relevante omgeving te analyseren met behulp van eerder geoptimaliseerde goedkope methoden die zijn aangepast aan 2D-monolaagkweek Figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> Figuur 1: Algemene protocolworkflow. (A) Cellen worden tot voldoende aantallen gekweekt, gesplitst, geteld en opnieuw gesuspendeerd in een geschikte hoeveelheid medium. (B) Dit celmateriaal ondergaat vervolgens seriële verdunning om in totaal 4 celsuspensies van verschillende dichtheden te bereiden. (C) Op collageen gebaseerde steigers worden steriel geplateerd in niet-klevende platen met 24 putjes, en (D) 20 μL celsuspensie wordt toegevoegd aan het midden van elke steiger en gedurende 3-5 uur laten incuberen bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid. (E) Volledig groeimedium (1 ml) wordt vervolgens langzaam aan elke steiger toegevoegd en de platen worden teruggeplaatst in de incubator om celgroei gedurende het gewenste tijdsbestek mogelijk te maken. (F) Op elk vooraf bepaald tijdstip worden verschillende steigers opgehaald voor beoordeling van de levensvatbaarheid en groei van cellen, analyse van genexpressie en histologische kleuring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

Neuroblastoom is de meest voorkomende extracraniële solide tumor bij kinderen, goed voor 15% van de totale sterfgevallen door kinderkanker. Het oorspronkelijke tumorweefsel is een complexe driedimensionale (3D) micro-omgeving met lagen kankercellen en niet-kankercellen omgeven door een extracellulaire matrix (ECM). De ECM biedt fysieke en biologische ondersteuning en draagt bij aan ziekteprogressie, prognose van de patiënt en therapeutische respons.
Dit artikel beschrijft een protocol voor het samenstellen van een op 3D-steigers gebaseerd systeem om de micro-omgeving van neuroblastoom na te bootsen met behulp van neuroblastoomcellijnen en op collageen gebaseerde steigers. De steigers worden aangevuld met nanohydroxyapatiet (nHA) of glycosaminoglycanen (GAG's), die van nature in hoge concentraties worden aangetroffen in het bot en het beenmerg, de meest voorkomende metastatische plaatsen van neuroblastoom. De 3D poreuze structuur van deze steigers maakt de hechting, proliferatie en migratie van neuroblastoomcellen en de vorming van celclusters mogelijk. In deze 3D-matrix is de celrespons op therapieën meer een afspiegeling van de in vivo situatie.
Het op steigers gebaseerde kweeksysteem kan hogere celdichtheden handhaven dan conventionele tweedimensionale (2D) celkweek. Daarom zijn optimalisatieprotocollen voor het initiële zaaien van celaantallen afhankelijk van de gewenste experimentele tijdschema's. Het model wordt gemonitord door celgroei te beoordelen via DNA-kwantificering, cellevensvatbaarheid via metabole assays en celdistributie binnen de steigers via histologische kleuring.
De toepassingen van dit model omvatten de beoordeling van gen- en eiwitexpressieprofielen en cytotoxiciteitstesten met behulp van conventionele geneesmiddelen en miRNA's. Het 3D-kweeksysteem maakt de nauwkeurige manipulatie van cel- en ECM-componenten mogelijk, waardoor een omgeving wordt gecreëerd die fysiologisch meer lijkt op het oorspronkelijke tumorweefsel. Daarom zal dit 3D in vitro model het begrip van de pathogenese van de ziekte vergroten en de correlatie verbeteren tussen resultaten verkregen in vitro, in vivo in diermodellen en menselijke proefpersonen.

Het op collageen gebaseerde steigermodel dat hier wordt beschreven, heeft vele toepassingen, variërend van het bestuderen van de biologie van neuroblastoom tot het screenen van antikankertherapieën in een omgeving die fysiologisch meer lijkt op inheemse tumoren dan conventionele 2D-celkweek. Alvorens een bepaalde onderzoeksvraag te testen, is het van cruciaal belang om een volledige karakterisering van celhechting, proliferatie en infiltratie te verkrijgen binnen het gewenste experimentele tijdsbestek. De groeiomstandigheden zijn afhankelijk van de biologie van elke specifieke cellijn. Belangrijk is dat verschillende methoden voor het beoordelen van celgroei moeten worden geïmplementeerd om optimale omstandigheden en robuuste prestaties te bepalen.
Hier werd de levensvatbaarheid van neuroblastoomcellen die op steigers werden gekweekt, beoordeeld met behulp van een colorimetrische cellevensvatbaarheidstest. Deze test kan zo vaak als gewenst worden uitgevoerd gedurende het experimentele tijdsbestek. Voor het beschreven experiment werd op dag 1, 7 en 14 een beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen uitgevoerd voor twee neuroblastoomcellijnen, KellyLuc en IMR32, gekweekt op Coll-I-nHA-steigers met 4 verschillende dichtheden (Figuur 6). De levensvatbaarheid op dag 1 werd als basislijn vastgesteld om alle volgende metingen te vergelijken. De mate van reductie van het reagens voor de levensvatbaarheid van cellen weerspiegelt de celbiologie en groeikenmerken van individuele cellijnen, met inbegrip van hun proliferatiesnelheid en metabolisme. Er werd een correlatie verwacht tussen het aantal cellen dat op de steigers werd gezaaid en de mate van reductie. In dit experiment nam de vermindering van het reagens voor de levensvatbaarheid van de cellen over het algemeen toe met elk tijdstip voor beide cellijnen bij alle dichtheden, zoals verwacht.
Elke dichtheid werd vervolgens afzonderlijk beoordeeld voor beide cellijnen om de reductie over tijdstippen te vergelijken. Eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest werd uitgevoerd om significante verschillen in reductie tussen tijdstippen te detecteren (Figuur 7). Voor beide cellijnen en alle zaaidichtheden was er een significante toename (P<0,05) in de vermindering van het cellevensvatbaarheidsreagens bij vergelijking van dag 1 en dag 14. Dit duidde op een significante toename van metabolisch actieve cellen die op de steigers aanwezig waren. Deze toename was niet in alle gevallen significant bij het beoordelen van de intervallen van 7 dagen (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14), wat het belang aantoont van de optimalisatie van de zaaidichtheid om het gewenste groeivenster te bereiken.
Om de resultaten van de cellevensvatbaarheidstest te ondersteunen, kan celgroei op steigers ook indirect worden gemeten via de kwantificering van dsDNA dat uit steigers wordt geëxtraheerd met behulp van een fluorescerende dsDNA-kleuring (Figuur 8A). Net als de levensvatbaarheid van cellen kan DNA-kwantificering zo vaak als gewenst worden gedaan binnen de experimentele tijdlijn. Deze analyse vereist echter het volledig ophalen van steigers en het beëindigen van de celgroei en moet dus worden meegenomen in de experimentele planning, zoals besproken in sectie 1. Voor dit experiment werd DNA gekwantificeerd op dag 1, 7 en 14 voor twee neuroblastoomcellijnen, KellyLuc en IMR32, gekweekt op Coll-I-nHA-steigers met 4 verschillende dichtheden. Omdat voor deze cellijnen de gemiddelde concentratie dsDNA per cel bekend is, was het mogelijk om het aantal cellen per monster af te leiden uit het gekwantificeerde DNA (figuur 8B).
DNA-kwantificering gaf aanleiding tot een grotere variabiliteit tussen biologische replicaten dan beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen, maar nam over het algemeen toe voor elk tijdstip, waarbij de hoogste niveaus op dag 14 werden gekwantificeerd. IMR32-cellen lijken hogere celaantallen te bereiken op Coll-I-nHA-steigers, zoals aangegeven door DNA-concentratie, dan KellyLuc-cellen. Elke dichtheid werd vervolgens afzonderlijk beoordeeld voor de twee cellijnen om de reductie op verschillende tijdstippen te vergelijken. Eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest werd uitgevoerd om significante verschillen in reductie tussen tijdstippen te detecteren (Figuur 8B).
Voor beide cellijnen en alle zaaidichtheden was er een significante toename (P<0,05) in celaantallen bij het vergelijken van dag 1 en dag 14, met uitzondering van KellyLuc bij zaaidichtheid 4 (1 × 105 cellen/steiger), wat op geen van de tijdstippen een significante toename opleverde. Net als bij de resultaten van de levensvatbaarheid van de cellen, waren de stijgingen niet in alle gevallen significant bij het beoordelen van de intervallen van 7 dagen (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14). Bij het vergelijken van de tijdpunttrends voor de levensvatbaarheid van cellen en DNA-kwantificering, waren er enkele kleine verschillen tussen de twee analyses. Over het algemeen werden echter vergelijkbare trends waargenomen, waarbij de gemiddelde waarden voor de meeste dichtheden tussen intervallen van 7 dagen toenamen. Dit toont het belang aan van het monitoren van celgroei met behulp van meer dan één methode.
Vervolgens werd een visuele beoordeling van de morfologie en verdeling van de celgroei op de steigers geïmplementeerd, waarbij traditionele hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring en IHC werden opgenomen. Verwacht wordt dat de verschillende groeipatronen van individuele cellijnen zullen leiden tot gevarieerde ruimtelijke arrangementen op steigers, inclusief verschillende graden van penetratie in de steiger en celclustering. Steigers waren met formaline gefixeerd, met paraffine ingebed en in secties van 5 mm gesneden (Figuur 9A), waardoor de steigers werden voorbereid op meerdere visualisatietechnieken, waaronder histologische kleuring en IHC.
Routinematige H&E-kleuring werd toegepast op Kelly-, KellyCis83- en IMR32-cellen die op dag 1, 7 en 14 op steigers op basis van collageen werden gekweekt (Figuur 9B). Dit maakte het mogelijk om de ruimtelijke oriëntatie van de cellen te visualiseren op twee op collageen gebaseerde steigers gedurende een periode van 14 dagen. Cisplatinegevoelige Kelly-cellen en resistente KellyCis83-cellen werden gekweekt op zowel Coll-I-nHA-steigers (Figuur 9B, i) als Coll-I-GAG-steigers (Figuur 9B, ii). In overeenstemming met eerder gepubliceerde gegevens groeiden KellyCis83-cellen sneller en infiltreerden ze dieper in beide steigersamenstellingen dan de minder invasieve Kelly-cellijn. De H&E-kleuring van een andere neuroblastoomcellijn, IMR32, gekweekt op Coll-I-nHA vertoont een contrasterend groeipatroon (Figuur 9B, iii). Deze cellijn groeide in grote, dicht opeengepakte clusters op de collageensteigers gedurende de periode van 14 dagen. Brightfield confocale microscopie kan worden gebruikt om de poreuze architectuur van op collageen gebaseerde steigers te visualiseren (Figuur 9C) als gevolg van de autofluorescentie van collageenvezels.
We kleurden cellen met phalloidine gericht op cytoskeletactine en de nucleaire tegenkleuring, 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), om specifieke celeigenschappen gedurende de experimentele tijdlijn te volgen. Met behulp van deze techniek werd een overvloed aan actine waargenomen in Kelly- en KellyCis83-cellen op Coll-I-GAG-steigers (Figuur 9D). Deze resultaten laten zien hoe meerdere beeldvormingstechnieken kunnen worden gebruikt om ruimtelijk opgeloste informatie af te leiden uit neuroblastoomcellen die met behulp van dit protocol op steigers zijn gekweekt. Deze karakterisering van celgroeipatronen op op collageen gebaseerde steigers gedurende een bepaalde periode zal het begrip en de interpretatie van eventuele stroomafwaartse biochemische assays verbeteren.
Eiwitexpressie door cellen die op op collageen gebaseerde steigers worden gekweekt, kan worden geanalyseerd om cellulaire activiteit te vergelijken met in vivo-scenario's . Eerder gepubliceerde gegevens onderzochten de expressie van chromogranine A (CgA) als een surrogaat-uitgescheiden marker van neuroblastoom door KellyLuc- en KellyCis83Luc-cellen die werden gekweekt in celmonolagen en op Coll-I-nHA- en Coll-I-GAG-steigers (Figuur 10). CgA werd beoordeeld in de geconditioneerde media met behulp van een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Figuur 10A). CgA wordt sneller uitgescheiden in de agressievere chemoresistente KellyCis83-cellijn dan in Kelly (Figuur 10B,C). Dit was significant op dag 7 op zowel Coll-I-GAG- als Coll-I-nHA-steigers (P<0,05), terwijl er op dit tijdstip geen significant verschil was voor cellen die als monolaag werden gekweekt door conventionele 2D-kweek.
Deze resultaten benadrukken ook de beperkte experimentele tijdlijn bij het kweken van cellen in een monolaag, waarbij slechts 7 dagen groei haalbaar blijkt te zijn voordat cellen samenvloeiing bereiken. De groei van cellen op steigers overwint deze beperking omdat ze over een langere periode kunnen worden gehandhaafd in meer fysiologisch relevante omstandigheden. De bovenstaande combinatie van technieken om informatie te verkrijgen over de levensvatbaarheid van cellen, DNA-inhoud, cellulaire morfologie en ruimtelijke rangschikking, en expressieprofielen, vergemakkelijkt de beoordeling van de groei van neuroblastoomcellen op een reeks op collageen gebaseerde steigers. Dit protocol kan ook eenvoudig worden aangepast om te voldoen aan specifieke experimentele vereisten en gewenste toepassingen.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig06.jpg"> Figuur 6: Analyse van de levensvatbaarheid van cellen. (A) Algemene procedure voor het meten van de levensvatbaarheid van neuroblastoomcellen op steigers op basis van collageen met behulp van een colorimetrische cellevensvatbaarheidstest. De incubatietijd moet voor elke nieuwe cellijn worden geoptimaliseerd, verwijzend naar de richtlijnen van de fabrikant. (B) Procentuele vermindering van het reagens voor de levensvatbaarheid van cellen door KellyLuc- en IMR32-cellen gekweekt op Coll-I-nHA-steigers bij vier verschillende initiële zaaidichtheden, gemeten op dag 1, 7 en 14. De monsters werden beoordeeld in biologisch drievoud met foutbalken die de standaarddeviatie vertegenwoordigen. Afkortingen: nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageen steigers aangevuld met nHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig07.jpg"> Figuur 7: Levensvatbaarheid van cellen door zaaidichtheid voor cellen die gedurende een periode van 14 dagen op Coll-I-nHA zijn gekweekt. (A) KellyLuc; (B) IMR32. Titelcelnummers verwijzen naar de initiële celzaaidichtheid op de steigers op dag 0. De monsters werden beoordeeld in biologisch drievoud, aangegeven met drievoudspunten, waarbij balken het gemiddelde vertegenwoordigen. One-Way ANOVA met meerdere vergelijkingen werd gebruikt om significante verschillen te detecteren in % cellevensvatbaarheidsreagensreductie over de drie tijdstippen, genoteerd in de grafieken (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Afkortingen: nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageensteigers aangevuld met nHA; ANOVA = variantieanalyse; ns = niet significant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig08.jpg"> Figuur 8: Kwantificering van DNA geëxtraheerd uit cellen in steigers. (A) Proces van het kwantificeren van dsDNA uit cellen die zijn gekweekt op op collageen gebaseerde steigers met behulp van een fluorescerende dsDNA-kleuring. (B) Celaantallen uit DNA-kwantificeringsanalyse door zaaidichtheid voor KellyLuc- en IMR32-cellen die gedurende een periode van 14 dagen op Coll-I-nHA zijn gekweekt. Celnummers met een titel verwijzen naar de initiële celzaaidichtheid op steigers op dag 0. De monsters werden beoordeeld in biologisch drievoud, aangegeven met drievoudspunten, waarbij balken het gemiddelde vertegenwoordigen. One-Way ANOVA met meerdere vergelijkingen werd gebruikt om significante verschillen in celaantallen over de drie tijdstippen te detecteren, genoteerd op de grafieken (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Afkortingen: nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageensteigers aangevuld met nHA; dsDNA = dubbelstrengs DNA; TE = Tris-EDTA; ANOVA = variantieanalyse; ns = niet significant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig09.jpg"> Figuur 9: Weefselverwerkingsstappen voor immunohistochemische analyse van scaffolds . (A) Schematische weergave van het protocol voor het verwerken van steigers voor beeldanalyse. Dit proces maakt routinematige histologische kleuring en specifieke antilichaamsondering mogelijk met behulp van primaire antilichamen en fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen. (B) Representatieve beelden van drie neuroblastoomcellijnen die zijn onderworpen aan H&E-kleuring. H&E-beelden worden gemaakt op dag 1, 7 en 14 om groeipatronen in de loop van het experiment te volgen. Schaalbalk = 200 μm. Gestippelde vierkanten vertegenwoordigen het gebied dat is gekozen voor ingezoomde 20x-afbeeldingen aan de linkeronderrand. Schaalbalk = 20 μm. (i en ii) H&E van Kelly en KellyCis83 neuroblastoomcellijnen (respectievelijk bovenste en onderste panelen) op twee soorten op collageen gebaseerde steigers. (iii) H&E van de IMR32-cellijn, die geclusterde cellulaire groei op de Coll-I-nHA-steiger vertegenwoordigt. (C) Representatief beeld van de Kelly-cellijn, onderworpen aan confocale helderveldmicroscopie. De collageen autofluorescentie maakt visualisatie van de poreuze steiger mogelijk. 10x schaalbalk = 200 μm, 20x schaalbalk = 20 μm. (D) Representatief beeld van ingebedde steigers gevolgd door analyse door IHC met falloidine en DAPI bij 10x vergroting, schaalbalk = 200 μm. Kleinere binnenvierkanten vertegenwoordigen ingezoomde afbeeldingen (20x), schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageensteigers aangevuld met nHA; GAG = glycosaminoglycaan; Coll-I-GAG = collageensteigers aangevuld met chondroïtine-6-sulfaat; H&E = hematoxyline en eosine; IHC = immunohistochemie; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig10.jpg"> Figuur 10: Eiwitexpressie door neuroblastoomcellen gekweekt op 3D-collageen-gebaseerde steigers in vergelijking met 2D-plastic. (A) Een schema van hoe de CgA ELISA werd uitgevoerd op geconditioneerde media van cellen gekweekt op 2D-plastic of 3D-collageen-gebaseerde steigers. (B) CgA-eiwitexpressieniveaus afkomstig van geconditioneerde media van cellen die zijn gekweekt op een 2D-plastic monolaag. Omdat de cellen na 7 dagen samenvloeiing bereikten, was het tijdstip van 14 dagen niet leesbaar. Op dag 7 op plastic was er geen significant verschil in CgA-niveaus tussen KellyCis83-cellijnen. (C) CgA ELISA uitgevoerd met behulp van geconditioneerde media van cellen die gedurende 14 opeenvolgende dagen op steigers op basis van collageen zijn gekweekt. Op dag 7, op beide collageensteigers, zijn de CgA-niveaus hoger in de agressievere KellyCis83-cellijn, wat meer fysiologisch relevante niveaus van CgA in de 3D-matrix benadrukt in vergelijking met de 2D-monolaag. Dit cijfer is aangepast van Curtin et al.17. Afkortingen: 3D = driedimensionaal; 2D = tweedimensionaal; CgA = chromogranine A; ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay; nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageensteigers aangevuld met nHA; GAG = glycosaminoglycaan; Coll-I-GAG = collageensteigers aangevuld met chondroïtine-6-sulfaat; TMB = 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine; HRP = mierikswortelperoxidase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Dit artikel somt de stappen op die nodig zijn om neuroblastoomcellijnen te zaaien op eerder beschreven driedimensionale op collageen gebaseerde steigers, de celgroei gedurende een vooraf bepaald tijdsbestek te behouden en steigers op te halen voor verschillende celgroei- en celgedragsanalyses en stroomafwaartse toepassingen, aanpasbaar om te voldoen aan een reeks experimentele doelen.

Driedimensionaal in vitro biomimetisch model van neuroblastoom met behulp van op collageen gebaseerde steigers

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Ons protocol biedt een 3D bio-engineered model dat het oorspronkelijke weefsel nauw beïnvloedt. Dit kan mogelijk worden gebruikt om nieuwe therapieën en biomarkers te ontdekken voor de behandeling en diagnose van neuroblastoom. Het belangrijkste voordeel is dat het meer fysiologisch relevante experimentele omstandigheden creëert om de micro-omgeving van de tumor te bestuderen met behulp van een reproduceerbare techniek die batch-to-batch-consistentie bereikt.Onze steigermethode kan ten eerste worden gebruikt om nieuwe therapieën voor neuroblastoom te identificeren en ten tweede om van patiënten afgeleide cellen op te nemen voor een betere voorspelling van de individuele respons van de patiënt. Plaats om te beginnen de steiger die in PBS is opgeslagen in de laminaire stroomkap. Gebruik een steriel pincet om de steiger voorzichtig uit de hoek te tillen en druk tegen de zijwand om overtollige PBS te verwijderen.Plaats vervolgens de steiger met de glanzende laag naar beneden in het midden van de put van een niet-klevende plaat met 24 putjes. Label de plaat met details van de cellijn, zaaidichtheid en tijdstippen. Werk met de cellen met één zaaidichtheid tegelijk en houd de resterende cellen op 37 graden Celsius in de incubator tot ze klaar zijn voor gebruik.Gebruik voor de celbevestiging in de steiger een P20-pipet met steriele punten om de celsuspensie grondig te mengen en voeg 20 microliter van de relevante celsuspensie toe in het midden van elke steiger, waarbij u ervoor zorgt dat de celsuspensie bovenop de steiger blijft en niet op de zijwand of basis van de put. Laat de cellen zich drie tot vijf uur hechten bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide en 95% luchtvochtigheid. Gebruik aan het einde van de incubatie een P1000-pipet om langzaam één milliliter voorverwarmd groeimedium aan elk putje toe te voegen, waardoor verplaatsing van de steigers wordt voorkomen, en incubeer de plaat een nacht.Observeer de steigers, in eerste instantie, om de twee tot drie dagen op kleurveranderingen van het groeimedium terwijl de cellen zich in de steiger vermenigvuldigen. Gebruik een pipetpistool van 10 milliliter met de langzame modus om één milliliter van het verbruikte medium uit de put te verwijderen en weg te gooien. Wanneer het geconditioneerde medium voor het experiment wordt gebruikt, verzamelt u het gebruikte medium van de biologische replicaten in een centrifugebuis van 15 milliliter en pelleteert u het celafval door centrifugatie.Breng het supernatans over in een verse buis en bewaar de buis bij min 80 graden Celsius. Nadat u het pipetpistool op de druppelmodus hebt gezet, voegt u voorzichtig twee milliliter voorverwarmd groeimedium toe aan de steigers. Incubeer de steiger-bevattende plaat en vul het verse medium aan voor de duur van de gewenste groeiperiode, zoals aangetoond.Steriliseer in de laminaire stromingskap het juiste reagens voor de cellevensvatbaarheidstest door filtratie door een steriel filter van 0,2 micrometer in een centrifugebuis. Verwarm de steriele oplossing, het volledige groeimedium en de steriele PBS voor in het waterbad, op 37 graden Celsius. Gebruik een steriel pincet om de te analyseren steigers over te brengen in een verse plaat met 24 putjes en label de plaat met alle relevante details.Voeg 900 microliter van het voorverwarmde groeimedium toe aan elk putje. Voeg vervolgens 100 microliter van het reagens voor de levensvatbaarheid van steriele cellen toe aan elk putje. Voeg voor een negatieve controle 900 microliter medium en 100 microliter van het reagens voor de levensvatbaarheid van steriele cellen toe in een putje zonder steiger.Plaats het deksel terug op de plaat en schud de plaat voorzichtig gedurende ongeveer drie minuten om het verdunde cellevensvatbaarheidsreagens door het putje te verdelen. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 95% luchtvochtigheid. Nadat u de plaat uit de couveuse hebt gehaald, schudt u de plaat een paar seconden voorzichtig en genereert u de drievouden, zoals aangetoond in het tekstmanuscript.Genereer de technische drievoud door 100 microliter van het geïncubeerde medium en reagens over te brengen van één putje van de plaat met 24 putjes naar één putje van de doorschijnende plaat met 96 putjes, en voer deze stap in totaal drie keer uit voor één putje. Bedek de plaat met 96 putjes met aluminiumfolie om het reagens voor de levensvatbaarheid van de cel tegen licht te beschermen. Verwijder de resterende 700 microliter medium en reagens van de steigers in de plaat met 24 putjes en gooi deze weg.Was elke steiger twee keer met één milliliter steriele PBS. Gebruik een microplaatlezer om de absorptie op 570 en 600 nanometer te meten en bereken de procentuele vermindering van de cellevensvatbaarheidsreagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Analyseer statistisch de resultaten van de levensvatbaarheid van de cel, met behulp van geschikte software.Voer de biologische drievoudige waarden in om foutbalken te produceren en de variabiliteit van de test aan te geven. Voer een eenrichtingsanalyse van de variantietest uit om de veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen gedurende het experimentele tijdsbestek te onderzoeken met behulp van geschikte biostatistische software. Geef significante verschillen aan tussen de tijdstippen op de grafieken, zoals beschreven in het tekstmanuscript.De levensvatbaarheid van twee neuroblastoomcellijnen, KellyLuc en IMR32, gekweekt op de steigers, werd beoordeeld. De verhoogde celdichtheid resulteerde in meer vermindering van het reagens voor de levensvatbaarheid van de cel in de loop van de tijd. De celgroei op de steigers werd indirect gemeten door het DNA uit de steigers te kwantificeren en de cellen per monster werden berekend.De IMR32-cellen vertoonden na verloop van tijd een verhoogde groei, daarna KellyLuc-cellen. De groeimorfologie en verdeling van cellen op de steigers werden visueel beoordeeld door middel van hematoxyline-, eosine- en immunohistochemische kleuring. KellyCis83-cellen groeiden sneller en infiltreerden dieper in beide steigersamenstellingen dan de minder invasieve Kelly-cellijn.IMR32 gekweekt op nano-hydroxyapatiet vertoonde een contrasterend groeipatroon met grote, dicht opeengepakte clusters, gedurende 14 dagen. De celspecifieke eigenschappen werden gecontroleerd door immunohistochemische kleuring, gevolgd door phalloidine- en DAPI-kleuring, en de overvloed aan actine werd waargenomen in Kelly- en KellyCis83-cellen op collageen-glycosaminoglycaansteigers. Voor de in vitro cellulaire activiteitsbeoordeling werden uitgescheiden niveaus van chromogranine A gemeten, en de cellen gekweekt op collageen-glycosaminoglycaan en collageen nano-hydroxyapatiet steigers produceerden meer chromogranine A in vergelijking met de groei op conventionele 2D-cultuur.De chemoresistente KellyCis83-cellijn scheidde meer chromogranine A af dan de Kelly-cellijn. Na celhechting kunnen cellen worden behandeld met verschillende therapieën. Dit zou fysiologisch relevantere resultaten opleveren voor de reactie van cellen op medicijnen dan conventionele 2D-kweek.Deze techniek stelt onderzoekers in staat om beter te onderzoeken hoe kankercellen zich gedragen en reageren op een stimulus binnen de micro-omgeving van de tumor, variërend van respons op therapieën of interacties met andere celtypen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Celdood evalueren met celvrije supernatant van probiotica in driedimensionale sferoïde culturen van colorectale kankercellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebravismodel van neuroblastoommetastase

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...