Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי לחקר ילדים (NCRC), מועצת המחקר האירית (IRC) ונוירובלסטומה בריטניה. האיורים נוצרו באמצעות BioRender.

<ol>
	<li>Davidoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).</li><li>Matthay, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).</li><li>Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+the+3D+microenvironment+on+cancer+cell+behaviour+and+treatment+responsiveness:+a+recent+update+on+lung,+breast+and+prostate+cancer+models.">Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models.</a> Acta Biomaterialia. , (2021).</li><li>Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+the+genes,+the+tumor+microenvironment+in+neuroblastoma.">More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma.</a> Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).</li><li>Walker, C., Mojares, E., Del R&#237;o Hern&#225;ndez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+matrix+in+development+and+cancer+progression.">Role of extracellular matrix in development and cancer progression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).</li><li>Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+extracellular+matrix+direct+gene+expression.">How does the extracellular matrix direct gene expression.</a> Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).</li><li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reciprocity+in+the+wound+microenvironment.">Dynamic reciprocity in the wound microenvironment.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Medicine. 6, 11 (2008).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Medicine. 4, 38 (2006).</li><li>Ouellette, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+collagen+jungle:+The+biomedical+potential+of+fiber+organization+in+cancer.">Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer.</a> Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Hume, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell+invasiveness+and+response+to+chemotherapeutics+in+adipocyte+invested+3D+engineered+anisotropic+collagen+scaffolds.">Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).</li><li>Fitzgerald, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+collagen-based+scaffolds+to+simulate+prostate+cancer+bone+metastases+with+potential+for+evaluating+delivery+of+nanoparticulate+gene+therapeutics.">The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics.</a> Biomaterials. 66, 53-66 (2015).</li><li>Sapudom, J., Pompe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+tumor+microenvironments+based+on+collagen+matrices.">Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices.</a> Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).</li><li>Curtin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+relevant+3D+collagen-based+scaffold-neuroblastoma+cell+system+exhibits+chemosensitivity+similar+to+orthotopic+xenograft+models.">A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models.</a> Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).</li><li>Gavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+invasion+strategies+are+regulated+by+the+extracellular+matrix.">Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix.</a> Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).</li><li>Casal, e. J., Crane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry, Glycosaminoglycans. , (2019).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+freezing+rate+on+pore+structure+in+freeze-dried+collagen-GAG+scaffolds.">Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).</li><li>Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinking+and+mechanical+properties+significantly+influence+cell+attachment,+proliferation,+and+migration+within+collagen+glycosaminoglycan+scaffolds.">Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).</li><li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment,+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).</li><li>Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+dehydrothermal+treatment+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).</li><li>Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nanohydroxyapatite+nanocomposites+for+bone+tissue+engineering.">Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering.</a> ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).</li><li>Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterisation+of+a+collagen+nano-hydroxyapatite+composite+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering.</a> Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+hydroxyapatite+incorporation+methods+on+the+structural+and+biological+properties+of+porous+collagen+scaffolds+for+bone+repair.">Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).</li><li>Tierney, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+collagen+concentration+and+crosslink+density+on+the+biological,+structural+and+mechanical+properties+of+collagen-GAG+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).</li><li>Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteomimicry+of+mammary+adenocarcinoma+cells+in+vitro;+increased+expression+of+bone+matrix+proteins+and+proliferation+within+a+3D+collagen+environment.">Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment.</a> PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).</li><li>Nolan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+neuroblastoma:+advances+and+challenges.">Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges.</a> Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).</li><li>Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+cell+responses+in+threedimensional+conductive+collagen+gel+scaffolds+with+conductive+polymer+nanofibres+for+tissue+regeneration.">Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration.</a> Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).</li><li>Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+analyze+three-dimensional+cell+distribution+and+infiltration+in+degradable+scaffolds.">Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).</li><li>do Amaral, R. J. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalising+collagen-based+scaffolds+with+platelet-rich+plasma+for+enhanced+skin+wound+healing+potential.">Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).</li><li>Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogranin+A+as+a+valid+marker+in+oncology:+Clinical+application+or+false+hopes.">Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes.</a> World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).</li><li>O'Brien, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+permeability+and+cell+attachment+in+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering.">The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

מודל התא התלת-ממדי של פיגומים סרטניים הוכח ככלי רב ערך ורב-תכליתי להשגת תובנה מכניסטית לגבי גדילת תאי נוירובלסטומה, כדאיות וחדירה של תאים ב-TME32 פשוט. מודל הנוירובלסטומה התלת-ממדי המתואר כאן מחקה את ה-TME המינימלי ומספק נתונים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר תרבית חד-שכבתית דו-ממדית. החיסרון העיקרי של תרבית תאים תלת-ממדית הוא מורכבות ניסויית מוגברת ומסגרות זמן ארוכות יותר. מתואר כאן פרוטוקול אופטימלי לזריעה, גדילה ותחזוקה של תאי נוירובלסטומה על פיגומים מבוססי קולגן, ואחריו ניתוחים ויישומים במורד הזרם, המניבים אפיון חזק של גדילת תאים. מטרתנו הייתה לקבל תובנות לגבי צפיפות זריעת התאים האופטימלית עבור הפיגומים, כדי ליצור סביבה צפויה וניתנת לשליטה להערכת טיפולים תרופתיים נגד סרטן בחלון ניסוי מהיר של 14 יום. השילוב של כל הפרוטוקולים הפשוטים המתוארים הללו מספק הערכה מקיפה היטב של צמיחת תאי נוירובלסטומה במערכת תרבית חוץ גופית מבוססת פיגומים.
הנקודות הקריטיות במערך הפרוטוקול הודגשו כדי לאפשר למדענים לבסס את אותו הדבר במעבדותיהם במהירות. לדוגמה, זמני הדגירה המצוינים לביצועים טובים יותר של בדיקת הכדאיות של התא הקולורימטרי מאפשרים חדירה עמוקה יותר של מגיב לתוך נקבוביות הפיגום כדי להגיע לכל התאים. יתר על כן, טכניקת צביעת dsDNA פלואורסצנטית היא חזקה ופשוטה; עם זאת, שחרור DNA מהפיגומים דורש ליזה תאית נמרצת מכיוון שהתאים "נלכדים" בתוך סיבי קולגן.
באמצעות בדיקת כימות הדנ"א הפשוטה שתוארה, אנו יכולים לזהות את שלב צמיחת היומן על פיגומים מבוססי קולגן לבדיקת תרופות אנטי-סרטניות באמצעות מודל זה. במסגרת הניסוי המתוארת, נעשה שימוש ב-4 צפיפויות ראשוניות של זריעת תאים עם תקופה כוללת של 14 יום ונקודות זמן לניתוח בימים 1, 7 ו-14. זיהינו שלתאי KellyLuc שנזרעו ב-4 × 105 תאים/פיגומים יש את חלון ההתרבות הפעיל המשמעותי ביותר בין ימים 7 ל-14. נתוני גידול שלב יומן זה יאפשרו פרשנות אמינה של ניסויים ציטוטוקסיים שונים בתאים. זה מבטל ספקולציות על כל ירידה בגדילה או מוות תאי כתוצאה מגידול מדוכא על פלטפורמת הנקבוביות התלת-ממדית ולא מרעילות סמים. כדאיות התא היא גם הערכה בשימוש נרחב עבור ההתאמה של פלטפורמות 3D כדי לתמוך בצמיחה של סוגי תאים שונים33,34. בעוד שישנן בדיקות רבות למדידת כדאיות התא, כולל צביעה חיה/מתה, מדידת ATP, מבחני התפשטות, מצאנו שהשימוש בבדיקת הכדאיות של התא הצבעוני הכחול של אלמר הוא טכניקה פשוטה ויעילה לתמיכה בנתוני כימות DNA.
השימוש המשולב בכימות DNA ויכולת קיום התא סיפק ראיות משלימות לכך שבממוצע, הצפיפות האופטימלית לזרע תאים על הפיגום כדי להשיג צמיחה מתמשכת על פני תקופה של 14 יום היא 2-4 × 105 תאים / פיגום. עם זאת, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם כדי לספק מסגרות זמן ניסיוני שונות, נקודות זמן ניתוח, ויישומים במורד הזרם. למרות שפרוטוקול זה מתאר את הערכת צמיחת תאי המונוקולטורה של תאי נוירובלסטומה על פיגומים, הפיגומים ניתנים לשינוי בקלות לשימוש כפלטפורמה לתרבית משותפת, שתוארה על ידי אמרל ואחרים, שהשתמשו בפיגומי קולגן-GAG לתרבית משותפת של קרטינוציטים ופיברובלסטים בחקירה של ריפוי פצעים35.
המודל התלת-ממדי המתואר מאפשר הדמיה של גדילת תאים וחדירה באמצעות טכניקות מוכרות שונות, כגון אימונופלואורסנציה ו-H&E סטנדרטי. חשוב לדמיין את התאים יחד עם אפיון הצמיחה באמצעות בדיקות ביוכימיות בשל מגוון המורפולוגיה של התא ודפוסי הצמיחה על פיגומים. הבנת דפוס הגידול יכולה להניב תובנות לגבי התנהגות גדילה ותגובה עתידית לתרופות נגד סרטן. לדוגמה, גידול IMR32 באמצעות כימות דנ"א מניב דפוסים דומים לקלי, אם כי בהדמיה באמצעות H&E, IMR32 גדל בצבירים גדולים יותר מאשר קלי, שהציג צמיחה מפוזרת יותר (איור 9). דפוסי גידול מגוונים אלה של קווי תאים בפיגומים משקפים את התרחיש הקליני של הטרוגניות הגידול. בחינת התגובה לתרופות אנטי-סרטניות באמצעות פאנל של קווי תאים בעלי מורפולוגיות שונות בפיגומים תלת-ממדיים תגדיל את ערך הניבוי של תגובת המטופל לאותן תרופות.
זיהוי ביטוי גנים או חלבונים יכול להתבצע גם באמצעות גישות אחרות כגון RT-qPCR או ELISA אם החלבון המעניין מופרש. סמן חלופי של התקדמות נוירובלסטומה, כרומוגרנין A (CgA)36, שימש בנוסף לאפיון צמיחת תאי נוירובלסטומה בתלת-ממד. כפי שתואר בעבודה קודמת17, הפרשת CgA גדלה ככל שהתאים התרבו (איור 10). בעוד שתרבית תאים חד-שכבתית לא יכלה ללכוד עלייה זו, מכיוון שמשמעות ההתרבות הייתה שהתאים הגיעו למפגש מלא בצלחות התרבית, השימוש בפיגומי הקולגן התלת-ממדיים איפשר הערכה ממושכת של הפרשת CgA.
מודל תלת-ממדי זה במבחנה עשוי שלא להתאים לכל שאלות המחקר לחקר נוירובלסטומה, ביולוגיה ותגובה לטיפולים. אחת המגבלות היא חדירה לא אחידה של תאים בתוך פיגומים והיווצרות צבירי תאים בגדלים שונים, התלויה בקו תאים נתון ועלולה להוביל לדיפוזיה בלתי נשלטת של חומרי מזון ותרופות בדיקה. תכונה זו משפיעה על החוסן בסינון הטיפולי. עם זאת, למרות מגבלה זו, חשוב לקחת בחשבון כי גידולים מקומיים הם גם הטרוגניים בגודל ובפיזור תאים סרטניים ומכילים סוגי תאים רבים אחרים בתוך רקמת הגידול. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מציעים להשתמש בכל פיגום המאוכלס בתאים כמיקרו-רקמה אחת שעבורה יותאמו הפרמטרים הבאים: (א) זמני הדגירה של מגיב יכולת הקיום של התא להגיע לתאים ולצברי התא, ו-(ב) שכיבה של התאים במאגר טריטון X-100 על ידי עיבוד מקדים של תאים על פיגומים עם לייזר רקמות כדי לשחרר את הדנ"א של התאים שנמצאים עמוק בתוך הפיגומים.
מגבלה טכנית נוספת של פרוטוקול זה היא היעדר בדיקות מכניות של כל אצווה של פיגומים שיוצרו לאחרונה עבור דגם זה. עם זאת, שימוש בתהליך הייצור החזק של הפיגומים, אשר אופיינו בהרחבה ביחס לתכונות פיזיקליות וכימיות של הפיגומים, כגון מודולוס דחיסה ומתיחה, נקבוביות ומבנה נקבוביות חזותי, והומוגניות, מבטיח כי איכויות הפיגום נשמרות באמצעות אצוות 21,24,27,30,37.
לסיכום, מאמר זה מציג סדרה של שיטות פשוטות לניתוח גדילת תאים על פיגומים מבוססי קולגן. ניתן להחליף הן את ציר הזמן הניסויי והן את נקודות הניתוח בהתאם לשאלות המחקר הספציפיות. פרוטוקול זה ניתן להתאמה גם לסוגי תאים אחרים. התוצאות המוצגות לעיל מספקות ראיות כיצד אוסף זה של שיטות נתן תובנה לגבי צפיפות הזריעה האופטימלית עבור שורות תאי נוירובלסטומה שונים כדי ליצור צמיחה מתמשכת במשך 14 ימים. שילוב התוצאות המתקבלות מכל השיטות בפרוטוקול זה מניב הבנה מעולה של גדילת תאים בתוך מטריצת הקולגן התלת-ממדית. שימוש עתידי במודל זה יכלול ככל הנראה מערכות תרבות משותפת ספציפיות לנוירובלסטומה TME ובדיקות של תרופות אנטי-סרטניות חדשניות שונות.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

נוירובלסטומה הוא סרטן ילדים של מערכת העצבים הסימפתטית המתעורר במהלך התפתחות עוברית או חיים מוקדמים לאחר הלידה עקב טרנספורמציה של תאי פסגה עצבית1. זהו הגידול החוץ-גולגולתי המוצק השכיח ביותר בילדים, המייצג 8% מהממאירויות המאובחנות בחולים מתחת לגיל 15 ואחראי ל -15% מכלל מקרי המוות מסרטן בילדות. המחלה מציגה התנהגויות קליניות הטרוגניות מאוד עקב שינויים כרומוזומליים ספציפיים, גנטיים ואפיגנטיים, ותכונות היסטופתולוגיות.
שינויים אלה תורמים לאגרסיביות של נוירובלסטומה ולתוצאות גרועות בחולים ילדים. לפיכך, הטיפולים הנוכחיים מוכיחים את עצמם כלא יעילים בטווח הארוך עבור כמעט 80% מהחולים עם המחלה האגרסיבית קלינית2, מה שמדגיש את העובדה שהטיפול בקבוצה זו של חולים נותר מאתגר. זה כנראה בגלל המנגנונים של הטרוגניות נוירובלסטומה וגרורות עדיין לא מובנים במלואם. עם זאת, כיום מקובל לחשוב שהמיקרו-סביבה של הגידול (TME) ממלאת תפקיד בהתקדמות של סוגי סרטן רבים; עם זאת, היא עדיין לא נחקרה מספיק בנוירובלסטומה 3,4.
TME המקורי הוא מיקרו-סביבה תלת-ממדית מורכבת הכוללת תאים סרטניים ולא סרטניים המוקפים ב-ECM. ECM מתייחס למרכיב האצלולרי של רקמה המספק תמיכה מבנית וביוכימית ליושבי התא שלה ותורם להתקדמות המחלה, פרוגנוזה של המטופל ותגובה טיפולית5. קידום זה של התקדמות המחלה נובע מ"הדדיות דינמית" או תקשורת דו-כיוונית מתמשכת בין התאים לבין ECM 6,7,8. ככל שהסרטן מתקדם, קולגן סטרומה מאורגן מחדש לעתים קרובות בדפוסים ליניאריים בניצב לממשק סטרומה-סרטן, שבו תאי סרטן משתמשים כנתיב נדידה לגרורות 9,10,11.
המרכיבים העיקריים של פיגום ביולוגי פונקציונלי טבעי זה כוללים רשת סיבית של קולגנים מסוג I ו- II וחלבונים אחרים, כולל אלסטין, גליקופרוטאינים כגון למינין, כמו גם מגוון של פרוטאוגליקנים ורכיבים מסיסים אחרים12,13. חלבונים אלה של ECM המקומי הפכו כעת לביומולקולות טבעיות אטרקטיביות לפיתוח מודלים תלת-ממדיים במבחנה 3. היישום של פיגומים תלת-ממדיים עבור תרבית תאים במבחנה גדל בפופולריות בשל הייצוג הפיזיולוגי הגדול יותר של TME בהשוואה לתרבית חד-שכבתית דו-ממדית מסורתית. הפיגומים התלת-ממדיים המיוצרים מסייעים להתקשרות תאים, להתרבות, לנדידה, לחילוף חומרים ולתגובה לגירויים הנראים במערכות ביולוגיות in vivo.
המרכיב העיקרי של פיגומים תלת-ממדיים אלה הוא קולגן, שהוא שחקן מפתח בתהליכים ביולוגיים נורמליים רבים, כולל תיקון רקמות, אנגיוגנזה, מורפוגנזה של רקמות, הידבקות תאים ונדידה11. מטריצות תלת-ממדיות מבוססות קולגן הוכיחו את הפונקציונליות החזקה שלהן למדל ECM, ומשמשות כמיקרו-סביבה ביומימטית במבחנה תוך מתן אפשרות לאינטראקציות בין תאים ל-ECM, כמו גם נדידת תאים ופלישה. מטריצות תלת-ממדיות אלה מספקות גם ניתוח מדויק יותר של תגובת התא לתרופות כימותרפיות מאשר תרבית דו-ממדית מסורתית או "שטוחה" במודלים רבים של סרטן 14,15,16, כולל נוירובלסטומה 17,18. ניתוח גנטי של תרביות תאים תלת-ממדיות דיווח על מתאם גבוה יותר עם פרופיל הרקמה האנושית גם בהשוואה למודלים של בעלי חיים19. בסך הכל, אבן הפינה של פיגומים תלת-ממדיים אלה היא לספק לתאים סביבה מתאימה במבחנה, אשר משחזרת את ארכיטקטורת הרקמה הטבעית ומאפשרת הצלבה מולקולרית דו-כיוונית8.
כדי להגדיל את המורכבות של מודלים מבוססי קולגן, רכיבי ECM נפוצים אחרים משולבים בתהליך הנדסת הרקמות, ובכך יוצרים מודלים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית כדי לשקף TMEs נישה של רקמות שונות. לדוגמה, GAGs, פוליסכרידים בעלי מטען שלילי הנמצאים בכל רקמות היונקים20, מאפשרים התקשרות תאים, נדידה, התרבות והתמיינות. כונדרויטין סולפט הוא סוג מסוים של GAG שנמצא בעצם ובסחוס, אשר שימש בעבר ביישומי הנדסת רקמות לתיקון עצם 21,22,23,24,25. ננו-הידרוקסיאפטיט (nHA) הוא המרכיב האנאורגני העיקרי בהרכב המינרלים של רקמות העצם האנושיות, המהווה עד 65% מהעצם לפי משקל26 ולכן נמצא בשימוש נרחב להחלפת עצם והתחדשות27. לפיכך, GAGs ו- nHA הם חומרים מרוכבים אטרקטיביים לשחזור הנוירובלסטומה הראשונית ECM ולמידול האתרים הגרורתיים הנפוצים ביותר של נוירובלסטומה, מח עצם (70.5%) ועצם (55.7%)28.
פיגומים המשלבים רכיבי ECM אלה פותחו במקור עבור יישומי הנדסת רקמות עצם עם ניתוח מקיף של התאימות הביולוגית שלהם, רעילות, ותכונות אוסטיאו-מוליכות ואוסטיאואינדוקטיביות 29,30. מדובר במטריצות נקבוביות על בסיס קולגן המיוצרות בטכניקות ייבוש בהקפאה כדי לשלוט בתכונות הפיזיות והביולוגיות שלהן. פיגומי הקולגן בתוספת nHA (Coll-I-nHA) או כונדרויטין-6-סולפט (Coll-I-GAG) הדגימו הצלחה בחיקוי ה-TME הראשוני בסרטן השד31 וגרורות לעצם בסרטן הערמונית15 וכן נוירובלסטומה17. טכניקת הייבוש בהקפאה המשמשת לייצור פיגומים מרוכבים אלה מניבה הומוגניות הניתנת לשחזור בגודל הנקבוביות ובנקבוביות בתוך הפיגומים22,23,24. בקצרה, תרחיף קולגן (0.5 wt%) מיוצר על-ידי ערבוב קולגן פיברילרי עם חומצה אצטית במינון 0.05 M. עבור Coll-I-GAG, 0.05 wt% של chrondoitin-6-sulfate שבודד מסחוס הכריש מתווסף לתמיסת הקולגן בזמן הערבוב. עבור פיגומים מרוכבים Coll-I-nHA, חלקיקי הידרוקסיאפטיט בגודל ננומטרי מסונתזים כפי שתואר קודם לכן27 ומוסיפים לתרחיף הקולגן ביחס של 2:1 למשקל הקולגן בתהליך הערבוב. כל הפיגומים מוצלבים פיזית ומעוקרים באמצעות טיפול דהידרותרמי ב 105 ° C במשך 24 שעות25. פיגומים גליליים (קוטר 6 מ"מ, גובה 4 מ"מ) מתקבלים באמצעות ניקוב ביופסיה וניתן להצליב אותם כימית עם הידרוכלוריד 3 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride ו- 5.5 mM N-hydroxysuccinimide (EDAC/NHS) במים מזוקקים (dH2O) כדי לשפר את התכונות המכניות של המבנים30. תהליך ייצור אופטימלי זה של שני פיגומי קולגן יוצר פיגומים בעלי תכונות מכניות הניתנות לשחזור, כולל גודל נקבוביות, נקבוביות וקשיחות (kPa). גם לפיגומי Coll-I-GAG וגם ל-Coll-I-nHA יש תכונות פיזיקליות שונות, היוצרות תנאים סביבתיים שונים. המאפיינים של כל פיגום מוצגים בטבלה 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>קול-אי-גאג</td>
			<td>קול-אני-נהה</td>
		</tr><tr><td>גודל פיגום (קוטר [מ"מ] x גובה [מ"מ])</td>
			<td>6 x 4 17</td>
			<td>6 x 4 17</td>
		</tr><tr><td>ריכוז קולגן (wt. %)</td>
			<td>0.5 17</td>
			<td>0.5 17</td>
		</tr><tr><td>ריכוז המצע (wt. %) [מבוסס על משקל קולגן]</td>
			<td>0.05 15,17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>גודל נקבוביות ממוצע (מ"מ)</td>
			<td>96 22</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>נקבוביות (%)</td>
			<td>99.5 23</td>
			<td>98.9 – 99.4 27</td>
		</tr><tr><td>נוקשות (kPa)</td>
			<td>1.5 27</td>
			<td>5.5 - 8.63 29</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: סקירה כללית של התכונות המכניות של שני הפיגומים שאומצו לחקר ביולוגיה של נוירובלסטומה.
מאמר זה מתאר פרוטוקול של הרכבת מערכת מבוססת פיגומים תלת-ממדיים כדי לחקות טוב יותר את המיקרו-סביבה של נוירובלסטומה באמצעות קווי תאי נוירובלסטומה ופיגומים מבוססי קולגן שתוארו קודם לכן בתוספת nHA (Coll-I-nHA) או כונדרויטין-6-סולפט (Coll-I-GAG). הפרוטוקול כולל שיטות במורד הזרם לניתוח מנגנוני הגדילה של תאי נוירובלסטומה בסביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית באמצעות שיטות זולות שהותאמו בעבר מתרבית חד-שכבתית דו-ממדית איור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה כוללת של פרוטוקולים. (A) תאים גדלים למספרים מספיקים, מפוצלים, נספרים ומרחפים מחדש בנפח מתאים של תווך. (B) מלאי תאים זה עובר דילול סדרתי כדי להכין סך של 4 תרחיפים של תאים בצפיפויות שונות. (C) פיגומים מבוססי קולגן מצופים באופן סטרילי בלוחות 24 בארות לא דבוקים, ו-(D) 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים מתווסף למרכז כל פיגום ונשאר לדגור ב-37°C, 5% CO2 ו-95% לחות במשך 3-5 שעות. (E) מדיום גידול מלא (1 מ"ל) מתווסף באיטיות לכל פיגום, והלוחות מוכנסים חזרה לאינקובטור כדי לאפשר צמיחת תאים למסגרת הזמן הרצויה. (F) בכל נקודת זמן שנקבעה מראש, כמה פיגומים מאוחזרים לצורך הערכת כדאיות התא וגדילתו, ניתוח ביטוי גנים וצביעה היסטולוגית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

נוירובלסטומה הוא הגידול המוצק החוץ-גולגולתי השכיח ביותר בילדים, ומהווה 15% מכלל מקרי המוות מסרטן ילדים. רקמת הגידול הטבעית היא מיקרו-סביבה תלת-ממדית (תלת-ממדית) מורכבת הכוללת שכבות של תאים סרטניים ולא סרטניים המוקפות במטריצה חוץ-תאית (ECM). ה- ECM מספק תמיכה פיזית וביולוגית ותורם להתקדמות המחלה, פרוגנוזה של המטופל ותגובה טיפולית.
מאמר זה מתאר פרוטוקול להרכבת מערכת תלת-ממדית מבוססת פיגומים כדי לחקות את המיקרו-סביבה של נוירובלסטומה באמצעות קווי תאי נוירובלסטומה ופיגומים מבוססי קולגן. לפיגומים מתווספים ננו-הידרוקסיאפטיט (nHA) או גליקוזאמינוגליקנים (GAGs), הנמצאים באופן טבעי בריכוזים גבוהים בעצם ובמח העצם, האתרים הגרורתיים הנפוצים ביותר של נוירובלסטומה. המבנה הנקבובי התלת-ממדי של פיגומים אלה מאפשר התקשרות של תאי נוירובלסטומה, התרבות ונדידה, והיווצרות צבירי תאים. במטריצה תלת-ממדית זו, תגובת התא לטיפולים משקפת יותר את המצב in vivo .
מערכת התרבית מבוססת הפיגומים יכולה לשמור על צפיפות תאים גבוהה יותר מאשר תרבית תאים דו-ממדית (2D) קונבנציונלית. לכן, פרוטוקולי אופטימיזציה עבור מספרי תאי זריעה ראשוניים תלויים במסגרות הזמן הרצויות לניסוי. המודל מנוטר על ידי הערכת גדילת תאים באמצעות כימות DNA, כדאיות התא באמצעות בדיקות מטבוליות, ופיזור תאים בתוך הפיגומים באמצעות צביעה היסטולוגית.
היישומים של מודל זה כוללים הערכה של פרופילי ביטוי גנים וחלבונים וכן בדיקות ציטוטוקסיות באמצעות תרופות קונבנציונליות ו-miRNA. מערכת התרבית התלת-ממדית מאפשרת מניפולציה מדויקת של רכיבי התא וה-ECM, ויוצרת סביבה דומה יותר מבחינה פיזיולוגית לרקמת הגידול המקומית. לכן, מודל תלת-ממדי זה במבחנה יקדם את הבנת הפתוגנזה של המחלה וישפר את המתאם בין תוצאות המתקבלות במבחנה, in vivo במודלים של בעלי חיים ונבדקים אנושיים.

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

מאמר זה מפרט את השלבים הדרושים כדי לזרוע שורות תאי נוירובלסטומה על פיגומים תלת-ממדיים מבוססי קולגן שתוארו קודם לכן, לשמור על גדילת התאים למסגרת זמן שנקבעה מראש, ולאחזר פיגומים עבור מספר ניתוחים של צמיחת תאים והתנהגות תאים ויישומים במורד הזרם, הניתנים להתאמה כדי לספק מגוון מטרות ניסוי.

מודל ביומימטי תלת מימדי במבחנה של נוירובלסטומה באמצעות פיגומים מבוססי קולגן

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

הפרוטוקול שלנו מציע מודל תלת-ממדי מהונדס ביולוגית המשפיע באופן הדוק על הרקמה הטבעית. זה יכול לשמש פוטנציאלית כדי לגלות טיפולים חדשים וסמנים ביולוגיים לטיפול נוירובלסטומה ואבחון. היתרון העיקרי הוא שהוא יוצר תנאי ניסוי רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות טכניקה הניתנת לשחזור המשיגה עקביות מאצווה לאצווה.ניתן להשתמש בשיטת הפיגום שלנו ראשית, כדי לזהות טיפולים חדשניים לנוירובלסטומה, ושנית, לשלב תאים שמקורם במטופל לחיזוי טוב יותר של תגובת המטופל האינדיבידואלי. כדי להתחיל, הניחו את הפיגום המאוחסן ב-PBS לתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להרים בעדינות את הפיגום מהפינה, ולחצו על הדופן כדי להסיר עודפי PBS.לאחר מכן מניחים את הפיגום כשהשכבה המבריקה פונה כלפי מטה במרכז הבאר של צלחת לא דבקה בת 24 בארות. תייג את הלוח עם פרטים של קו התא, צפיפות הזריעה ונקודות הזמן. עבדו עם תאים בעלי צפיפות זריעה אחת בכל פעם, ושמרו על התאים הנותרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור, עד שיהיו מוכנים לשימוש.לחיבור התא בפיגום השתמשו בפיפטת P20 עם קצוות סטריליים כדי לערבב היטב את מתלה התא, והוסיפו 20 מיקרוליטר של תרחיף התא הרלוונטי במרכז כל פיגום, כדי להבטיח שתרחיף התא יישאר על גבי הפיגום ולא על דופן או בסיס הבאר. אפשרו לתאים להיצמד במשך שלוש עד חמש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני ו-95% לחות. בסוף הדגירה, השתמשו בפיפט P1000 כדי להוסיף לאט מיליליטר אחד של מצע גידול שחומם מראש לכל באר, כדי למנוע תזוזה של הפיגומים, ולדגור על הצלחת למשך הלילה.שימו לב לפיגומים, בתחילה, כל יומיים-שלושה לשינויי צבע של מדיום הגידול כאשר התאים מתרבים בתוך הפיגומים. השתמש אקדח פיפטה 10 מיליליטר עם מצב איטי כדי להסיר ולהשליך מיליליטר אחד של המדיום בילה מן הבאר. כאשר התווך המותנה משמש לניסוי, אספו את התווך המשומש של ההעתקים הביולוגיים בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, ושפכו את פסולת התא באמצעות צנטריפוגה.מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי ומאחסנים את הצינור בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הגדרת אקדח פיפטה על מצב טפטוף, להוסיף בעדינות שני מיליליטר של מדיום צמיחה שחומם מראש לפיגומים. דוגרים על הצלחת המכילה פיגומים ומחדשים את התווך הטרי למשך תקופת הגידול הרצויה, כפי שמוכיח.במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, יש לעקר את מגיב בדיקת הכדאיות התאית המתאים על ידי סינון דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה. מחממים מראש את התמיסה הסטרילית, מצע צמיחה מלא וPBS סטרילי באמבט המים, ב 37 מעלות צלזיוס. בעזרת פינצטה סטרילית, מעבירים את הפיגומים לניתוח בצלחת טרייה בת 24 בארות, ומתייגים את הצלחת בכל הפרטים הרלוונטיים.מוסיפים 900 מיקרוליטר של מצע הגידול המחומם מראש לכל באר. לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של מגיב קיימא התא סטרילי לכל באר. עבור בקרה שלילית, להוסיף 900 מיקרוליטר של בינוני ו 100 מיקרוליטר של מגיב קיימא התא סטרילי בבאר ללא פיגומים.החלף את המכסה בצלחת, וניער בעדינות את הצלחת במשך כשלוש דקות כדי לפזר את מגיב הכדאיות התא המדולל ברחבי הבאר. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות. לאחר הוצאת הצלחת מהאינקובטור, נענעו בעדינות את הצלחת למשך מספר שניות ויצרו את הטריפליקטים, כפי שמודגם בכתב היד של הטקסט.צור את הטריפליקטים הטכניים על ידי העברת 100 מיקרוליטר של התווך ומגיב המודגר מבאר אחת של צלחת 24 הקידוחים לבאר אחת של צלחת 96 בארות שקופה, ובצע שלב זה בסך הכל שלוש פעמים עבור באר אחת. כסו את הצלחת בעלת 96 הבארות ברדיד אלומיניום כדי להגן על מגיב הכדאיות של התא מפני אור. מוציאים ומשליכים את 700 המיקרוליטרים הנותרים של מדיום וריאגנט מהפיגומים בצלחת 24 הקידוחים.שטפו כל פיגום פעמיים במיליליטר אחד של PBS סטרילי. השתמש בקורא microplate כדי למדוד את הספיגה ב 570 ו 600 ננומטר, ולחשב את אחוז ההפחתה של ריאגנטים כדאיות התא בהתאם להמלצות היצרן. נתח סטטיסטית את תוצאות כדאיות התא, באמצעות תוכנה מתאימה.הזן את הערכים הביולוגיים המשולשים כדי ליצור קווי שגיאה ולציין את השתנות המבחן. לבצע ניתוח חד-כיווני של בדיקת שונות כדי לבחון את השינויים בכדאיות התא לאורך מסגרת הזמן של הניסוי באמצעות תוכנה ביוסטטיסטית מתאימה. ציין הבדלים משמעותיים בין נקודות הזמן בגרפים, כמתואר בכתב היד של הטקסט.הוערכה הכדאיות של שני קווי תאי נוירובלסטומה, KellyLuc ו-IMR32, שגדלו על הפיגומים. צפיפות התאים המוגברת הביאה להפחתה רבה יותר של מגיב הכדאיות התא עם הזמן. גדילת התאים על הפיגומים נמדדה בעקיפין על ידי כימות הדנ"א שהופק מהפיגומים, וחושבו התאים לכל דגימה.תאי IMR32 הראו צמיחה מוגברת, ולאחר מכן תאי KellyLuc, עם הזמן. מורפולוגיית הגדילה והתפלגות התאים על הפיגומים הוערכו חזותית על ידי צביעת המטוקסילין, אאוסין ואימונוהיסטוכימיה. תאי KellyCis83 גדלו מהר יותר וחדרו עמוק יותר לשני הרכבי הפיגומים, מאשר לקו תאי קלי הפחות פולשני.IMR32 שגדל על ננו-הידרוקסיאפטיט הדגים דפוס גידול מנוגד עם צבירים גדולים וצפופים, במשך 14 יום. התכונות הספציפיות לתאים נוטרו על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית, ולאחר מכן צביעת פלואידין ו- DAPI, ושפע האקטין נצפה בתאי Kelly ו- KellyCis83 על פיגומים קולגן-גליקוזאמינוגליקן. לצורך הערכת הפעילות התאית במבחנה, נמדדו רמות מופרשות של כרומוגרנין A, והתאים שגדלו על פיגומים של קולגן-גליקוזאמינוגליקן וננו-הידרוקסיאפטיט קולגן הפיקו יותר כרומוגרנין A בהשוואה לגידול בתרבית דו-ממדית קונבנציונלית.קו התאים העמיד לכימותרפיה KellyCis83 הפריש יותר כרומוגרנין A מאשר קו תאי קלי. לאחר התקשרות התא, תאים יכולים להיות מטופלים עם טיפולים שונים. זה יספק תוצאות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית לתגובת התאים לתרופות מאשר תרבית דו-ממדית קונבנציונלית.טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור טוב יותר כיצד תאים סרטניים מתנהגים ומגיבים לגירוי בתוך המיקרו-סביבה של הגידול, החל מתגובה לטיפולים או אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

הערכת מוות תאים באמצעות Supernatant ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת מימדיות של תאים סרטניים המעי הגס

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

מודל ספרואידי תלת מימדי לחקר האינטראקציה בין גידולים סרטניים בקרצינומה הפטוקולרית

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...