Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Children's Research Centre (NCRC), dall'Irish Research Council (IRC) e da Neuroblastoma UK. Le illustrazioni sono state realizzate con BioRender.

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Il modello 3D di cellule tumorali con scaffold si è dimostrato uno strumento prezioso e versatile per ottenere informazioni meccanicistiche sulla crescita, la vitalità e l'infiltrazione delle cellule di neuroblastoma in una TME32 semplificata. Il modello 3D di neuroblastoma qui descritto imita la TME minima e fornisce dati fisiologicamente più rilevanti rispetto a una coltura monostrato 2D. Uno dei principali svantaggi della coltura cellulare 3D è l'aumento della complessità sperimentale e i tempi più lunghi. Qui è descritto un protocollo ottimizzato per la semina, la crescita e il mantenimento di cellule di neuroblastoma su scaffold a base di collagene, seguito da analisi e applicazioni a valle, che producono una robusta caratterizzazione della crescita cellulare. Il nostro obiettivo era quello di ottenere informazioni sulla densità ottimale di semina cellulare per gli scaffold per creare un ambiente prevedibile e controllabile per la valutazione dei trattamenti farmacologici antitumorali in una rapida finestra sperimentale di 14 giorni. La combinazione di tutti questi semplici protocolli descritti fornisce una valutazione completa della crescita delle cellule di neuroblastoma nel sistema di coltura in vitro basato su scaffold.
I punti critici nell'impostazione del protocollo sono stati enfatizzati per consentire agli scienziati di stabilire rapidamente lo stesso nei loro laboratori. Ad esempio, i tempi di incubazione indicati per una migliore esecuzione del test colorimetrico di vitalità cellulare consentono una penetrazione più profonda del reagente nei pori dell'impalcatura per raggiungere tutte le cellule. Inoltre, la tecnica di colorazione fluorescente del dsDNA è robusta e semplice; tuttavia, il rilascio di DNA dagli scaffold richiede una vigorosa lisi cellulare poiché le cellule sono "intrappolate" all'interno delle fibre di collagene.
Utilizzando il semplice saggio di quantificazione del DNA descritto, possiamo identificare la fase di crescita logaritmica su scaffold a base di collagene per lo screening di farmaci antitumorali utilizzando questo modello. Nel contesto sperimentale descritto, sono state utilizzate 4 densità iniziali di semina cellulare con un periodo complessivo di 14 giorni e punti temporali di analisi nei giorni 1, 7 e 14. Abbiamo identificato che le cellule KellyLuc seminate a 4 × 105 cellule/scaffold hanno la finestra di proliferazione attiva più significativa tra i giorni 7 e 14. Questi dati di crescita della fase logaritmica consentiranno un'interpretazione affidabile di vari esperimenti di citotossicità cellulare. Elimina le speculazioni su qualsiasi declino della crescita o morte cellulare derivante dalla crescita soppressa sulla piattaforma porosa 3D piuttosto che dalla tossicità dei farmaci. La vitalità cellulare è anche una valutazione ampiamente utilizzata per l'idoneità delle piattaforme 3D a supportare la crescita di diversi tipi di cellule33,34. Sebbene esistano molti saggi per misurare la vitalità cellulare, tra cui la colorazione viva/morta, la misurazione dell'ATP, i saggi di proliferazione, abbiamo scoperto che l'uso del test di vitalità cellulare colorimetrica Alamar Blue è una tecnica semplice ed efficace per supportare i dati di quantificazione del DNA.
L'uso combinato della quantificazione del DNA e della vitalità cellulare ha fornito prove complementari che, in media, la densità ottimale per le cellule del seme sullo scaffold per ottenere una crescita continua per un periodo di 14 giorni è di 2-4 × 105 cellule/scaffold. Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per soddisfare diversi intervalli di tempo sperimentali, punti temporali di analisi e applicazioni a valle. Sebbene questo protocollo descriva la valutazione della crescita cellulare in monocoltura di cellule di neuroblastoma su scaffold, gli scaffold sono facilmente modificabili per l'uso come piattaforma per la co-coltura, descritta da do Amaral et al., che hanno utilizzato scaffold di collagene-GAG per co-coltivare cheratinociti e fibroblasti in un'indagine sulla guarigione delle ferite35.
Il modello 3D descritto consente la visualizzazione della crescita e dell'infiltrazione cellulare utilizzando diverse tecniche ben note, come l'immunofluorescenza e l'H&E standard. È importante visualizzare le cellule insieme alla caratterizzazione della crescita utilizzando saggi biochimici a causa della diversità della morfologia cellulare e dei modelli di crescita sugli scaffold. La comprensione del modello di crescita può fornire informazioni sul comportamento di crescita e sulla risposta futura ai farmaci antitumorali. Ad esempio, la crescita di IMR32 utilizzando la quantificazione del DNA produce modelli simili a quelli di Kelly, anche se dopo la visualizzazione utilizzando H&E, IMR32 cresce in cluster più grandi rispetto a Kelly, che ha mostrato una crescita più dispersa (Figura 9). Questi diversi modelli di crescita delle linee cellulari negli scaffold riflettono lo scenario clinico di eterogeneità tumorale. L'esame della risposta ai farmaci antitumorali utilizzando un pannello di linee cellulari con morfologie diverse in scaffold 3D aumenterà il valore predittivo per la risposta del paziente agli stessi farmaci.
Il rilevamento dell'espressione genica o proteica può essere eseguito anche utilizzando altri approcci come la RT-qPCR o l'ELISA se la proteina di interesse è secreta. Un marcatore surrogato della progressione del neuroblastoma, la cromogranina A (CgA)36, è stato utilizzato per caratterizzare ulteriormente la crescita delle cellule di neuroblastoma in 3D. Come descritto nel precedente lavoro17, la secrezione di CgA aumentava con la proliferazione delle cellule (Figura 10). Mentre la coltura cellulare monostrato non è stata in grado di catturare questo aumento, poiché la proliferazione ha fatto sì che le cellule raggiungessero la piena confluenza nelle piastre di coltura, l'uso degli scaffold di collagene 3D ha permesso una valutazione prolungata della secrezione di CgA.
Questo modello 3D in vitro potrebbe non essere adatto a tutte le domande di ricerca per studiare la biologia del neuroblastoma e la risposta alle terapie. Una delle limitazioni è la penetrazione irregolare delle cellule all'interno degli scaffold e la formazione di gruppi cellulari di dimensioni variabili, che dipende da una determinata linea cellulare e può portare a una diffusione incontrollabile di nutrienti e farmaci testati. Questa caratteristica influisce sulla robustezza nello screening terapeutico. Tuttavia, nonostante questa limitazione, è importante considerare che i tumori nativi sono anche eterogenei per dimensioni e distribuzione delle cellule tumorali e contengono molti altri tipi di cellule all'interno del tessuto tumorale. Per superare questa limitazione, proponiamo l'uso di ogni scaffold popolato da cellule come un singolo microtessuto per il quale saranno ottimizzati i seguenti parametri: (a) tempi di incubazione affinché il reagente di vitalità cellulare raggiunga le cellule e i cluster cellulari, e (b) lisatura delle cellule nel tampone Triton X-100 mediante preprocessamento delle cellule su scaffold con un liser tissutale per rilasciare il DNA delle cellule contenute in profondità nello scaffold.
Un'altra limitazione tecnica di questo protocollo è la mancanza di test meccanici di ogni lotto di scaffold di nuova fabbricazione per questo modello. Tuttavia, l'utilizzo del robusto processo di produzione degli scaffold, che sono stati ampiamente caratterizzati in relazione alle proprietà fisiche e chimiche degli scaffold, come il modulo di compressione e trazione, la porosità e la struttura visiva dei pori e l'omogeneità, garantisce che le qualità dell'impalcatura siano mantenute attraverso i lotti 21,24,27,30,37.
In sintesi, questo articolo presenta una serie di semplici metodi per l'analisi della crescita cellulare su scaffold a base di collagene. Sia la timeline sperimentale che i punti di analisi possono essere scambiati a seconda delle specifiche domande di ricerca. Questo protocollo è adattabile anche ad altri tipi di cellule. I risultati mostrati sopra forniscono prove su come questa raccolta di metodi abbia fornito informazioni sulla densità di semina ottimale per varie linee cellulari di neuroblastoma per creare una crescita continua nell'arco di 14 giorni. L'amalgama dei risultati ottenuti da tutti i metodi di questo protocollo produce una comprensione superiore della crescita cellulare all'interno della matrice di collagene 3D. L'utilizzo futuro di questo modello comporterà probabilmente sistemi di co-coltura specifici per il neuroblastoma TME e la sperimentazione di vari nuovi farmaci antitumorali.

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Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

Il neuroblastoma è un tumore pediatrico del sistema nervoso simpatico che insorge durante lo sviluppo embrionale o nei primi anni di vita post-natale a causa della trasformazione delle cellule della cresta neurale1. È il tumore extracranico solido più comune nei bambini, rappresenta l'8% delle neoplasie maligne diagnosticate nei pazienti sotto i 15 anni ed è responsabile del 15% di tutti i decessi per cancro infantile. La malattia mostra comportamenti clinici altamente eterogenei a causa di specifiche alterazioni cromosomiche, genetiche ed epigenetiche e di caratteristiche istopatologiche.
Queste alterazioni contribuiscono all'aggressività del neuroblastoma e agli scarsi esiti nei pazienti pediatrici. Pertanto, le attuali terapie si rivelano inefficaci a lungo termine per quasi l'80% dei pazienti con la malattia clinicamente aggressiva2, evidenziando il fatto che il trattamento per questo gruppo di pazienti rimane impegnativo. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che i meccanismi dell'eterogeneità del neuroblastoma e delle metastasi non sono ancora del tutto compresi. Tuttavia, si ritiene che il microambiente tumorale (TME) svolga un ruolo nella progressione di molti tumori; Eppure rimane poco studiato nel neuroblastoma 3,4.
La TME nativa è un complesso microambiente 3D che coinvolge cellule cancerose e non cancerose circondate da una ECM. L'ECM si riferisce alla componente acellulare di un tessuto che fornisce supporto strutturale e biochimico ai suoi residenti cellulari e contribuisce alla progressione della malattia, alla prognosi del paziente e alla risposta terapeutica5. Questa promozione della progressione della malattia è dovuta alla "reciprocità dinamica" o comunicazione bidirezionale in corso tra le cellule e l'ECM 6,7,8. Man mano che il cancro progredisce, il collagene stromale viene spesso riorganizzato in schemi lineari perpendicolari all'interfaccia stroma-cancro, che le cellule tumorali usano come via migratoria verso le metastasi 9,10,11.
I componenti principali di questa impalcatura biologica funzionale nativa includono una rete fibrosa di collageni di tipo I e II e altre proteine, tra cui elastina, glicoproteine come la laminina, nonché una serie di proteoglicani e altri componenti solubili12,13. Queste proteine dell'ECM nativa sono ora diventate interessanti biomolecole naturali per lo sviluppo di modelli 3D in vitro 3. L'applicazione di scaffold 3D per la coltura cellulare in vitro sta diventando sempre più popolare grazie alla sua maggiore rappresentazione fisiologica della TME rispetto alla tradizionale coltura monostrato 2D. Gli scaffold 3D prodotti assistono l'attaccamento, la proliferazione, la migrazione, il metabolismo e la risposta delle cellule agli stimoli osservati nei sistemi biologici in vivo.
Il componente principale di queste impalcature 3D è il collagene, che è un attore chiave in molti normali processi biologici tra cui la riparazione dei tessuti, l'angiogenesi, la morfogenesi dei tessuti, l'adesione cellulare e la migrazione11. Le matrici 3D a base di collagene hanno dimostrato la loro robusta funzionalità per modellare l'ECM, fungendo da microambiente biomimetico in vitro e consentendo al contempo interazioni cellula-ECM, nonché la migrazione e l'invasione cellulare. Queste matrici 3D forniscono anche un'analisi più accurata della risposta cellulare ai farmaci chemioterapici rispetto alla tradizionale coltura 2D o "piatta" in molti modelli di cancro 14,15,16, incluso il neuroblastoma 17,18. L'analisi genetica delle colture cellulari 3D ha riportato una maggiore correlazione con il profilo tissutale umano anche rispetto ai modelli animali19. Nel complesso, la pietra angolare di questi scaffold 3D è quella di fornire alle cellule un ambiente in vitro adatto, che ricapitola l'architettura tissutale nativa e facilita la diafonia molecolare bidirezionale8.
Per aumentare la complessità dei modelli a base di collagene, altri componenti comuni dell'ECM vengono incorporati nel processo di ingegneria tissutale, creando così modelli fisiologicamente più rilevanti per riflettere le TME di nicchia di diversi tessuti. Ad esempio, i GAG, polisaccaridi caricati negativamente presenti in tutti i tessuti dei mammiferi20, facilitano l'attaccamento, la migrazione, la proliferazione e la differenziazione cellulare. Il solfato di condroitina è un tipo specifico di GAG presente nell'osso e nella cartilagine, che è stato precedentemente utilizzato in applicazioni di ingegneria tissutale per la riparazione ossea 21,22,23,24,25. La nano-idrossiapatite (nHA) è il principale costituente inorganico della composizione minerale dei tessuti ossei umani, costituendo fino al 65% dell'osso in peso26 ed è quindi ampiamente utilizzata per la sostituzione e la rigenerazione ossea27. Pertanto, GAGs e nHA sono compositi interessanti per ricostruire l'ECM del neuroblastoma primario e modellare i siti metastatici più comuni del neuroblastoma, del midollo osseo (70,5%) e dell'osso (55,7%)28.
Gli scaffold che incorporano questi componenti ECM sono stati originariamente sviluppati per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo con un'analisi approfondita della loro biocompatibilità, tossicità e caratteristiche osteoconduttive e osteoinduttive29,30. Sono matrici porose a base di collagene prodotte utilizzando tecniche di liofilizzazione per controllarne le proprietà fisiche e biologiche. Gli scaffold di collagene integrati con nHA (Coll-I-nHA) o condroitin-6-solfato (Coll-I-GAG) hanno dimostrato successo nell'imitare la TME primaria nel cancro al seno31 e le metastasi ossee nel cancro alla prostata15 e nel neuroblastoma17. La tecnica di liofilizzazione utilizzata per produrre questi scaffold compositi produce un'omogeneità riproducibile nella dimensione dei pori e nella porosità all'interno degli scaffold22,23,24. In breve, un impasto di collagene (0,5% in peso) viene fabbricato miscelando collagene fibrillare con acido acetico 0,05 M. Per Coll-I-GAG, lo 0,05% in peso di chrondoitin-6-solfato isolato dalla cartilagine di squalo viene aggiunto al liquame di collagene durante la miscelazione. Per gli scaffold compositi Coll-I-nHA, le particelle di idrossiapatite di dimensioni nanometriche vengono sintetizzate come descritto in precedenza27 e aggiunte al liquame di collagene in un rapporto di 2:1 rispetto al peso del collagene durante il processo di miscelazione. Tutti i ponteggi sono reticolati fisicamente e sterilizzati mediante trattamento deidrotermale a 105 °C per 24 h25. Gli scaffold cilindrici (6 mm di diametro, 4 mm di altezza) sono ottenuti utilizzando un punzone per biopsia e possono essere chimicamente reticolati con 3 mM di N-(3-dimetilamminopropil)-N'-etilcarbodiimmide cloridrato e 5,5 mM di N-idrossisuccinimide (EDAC/NHS) in acqua distillata (dH2O) per migliorare le proprietà meccaniche dei costrutti30. Questo processo di produzione ben ottimizzato di due scaffold di collagene crea scaffold con proprietà meccaniche riproducibili, tra cui la dimensione dei pori, la porosità e la rigidità (kPa). Sia gli scaffold Coll-I-GAG che quelli Coll-I-nHA hanno proprietà fisiche diverse, creando condizioni ambientali diverse. Le proprietà di ciascuna impalcatura sono visualizzate nella Tabella 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Coll-I-GAG</td>
			<td>Coll-I-nHA</td>
		</tr><tr><td>Dimensione dell'impalcatura (diametro [mm] x altezza [mm])</td>
			<td>6 x 4 17</td>
			<td>6 x 4 17</td>
		</tr><tr><td>Concentrazione di collagene (% in peso)</td>
			<td>0.5 17</td>
			<td>0.5 17</td>
		</tr><tr><td>Concentrazione del substrato (% in peso) [in base al peso del collagene]</td>
			<td>0.05 15,17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>Dimensione media dei pori (mm)</td>
			<td>96 22</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>Porosità (%)</td>
			<td>99.5 23</td>
			<td>98,9 – 99,4 27</td>
		</tr><tr><td>Rigidezza (kPa)</td>
			<td>1.5 27</td>
			<td>5,5 - 8,63 29</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Panoramica delle proprietà meccaniche dei due scaffold adottati per lo studio della biologia del neuroblastoma.
Questo documento descrive un protocollo di assemblaggio di un sistema basato su scaffold 3D per imitare meglio il microambiente del neuroblastoma utilizzando linee cellulari di neuroblastoma e scaffold a base di collagene precedentemente descritti integrati con nHA (Coll-I-nHA) o condroitin-6-solfato (Coll-I-GAG). Il protocollo include metodi a valle per analizzare i meccanismi di crescita delle cellule di neuroblastoma in un ambiente fisiologicamente più rilevante, utilizzando metodi precedentemente ottimizzati e poco costosi adattati dalla coltura monostrato 2D Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro complessivo del protocollo. (A) Le cellule vengono cresciute fino a raggiungere un numero sufficiente, divise, contate e risospese in un volume appropriato di terreno. (B) Questo stock di cellule viene quindi sottoposto a diluizione seriale per preparare un totale di 4 sospensioni cellulari di diversa densità. (C) Gli scaffold a base di collagene sono placcati sterilmente in piastre a 24 pozzetti non aderenti e (D) 20 μL di sospensione cellulare vengono aggiunti al centro di ogni scaffold e lasciati incubare a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità per 3-5 ore. (E) Il terreno di crescita completo (1 mL) viene quindi aggiunto lentamente a ciascuna impalcatura e le piastre vengono rimesse nell'incubatore per consentire la crescita cellulare per il periodo di tempo desiderato. (F) In ogni momento predeterminato, vengono recuperati diversi scaffold per la valutazione della vitalità e della crescita cellulare, l'analisi dell'espressione genica e la colorazione istologica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

Il neuroblastoma è il tumore solido extracranico più comune nei bambini, rappresentando il 15% dei decessi complessivi per cancro pediatrico. Il tessuto tumorale nativo è un complesso microambiente tridimensionale (3D) che coinvolge strati di cellule cancerose e non cancerose circondate da una matrice extracellulare (ECM). L'ECM fornisce supporto fisico e biologico e contribuisce alla progressione della malattia, alla prognosi del paziente e alla risposta terapeutica.
Questo documento descrive un protocollo per l'assemblaggio di un sistema basato su scaffold 3D per imitare il microambiente del neuroblastoma utilizzando linee cellulari di neuroblastoma e scaffold a base di collagene. Gli scaffold sono integrati con nanoidrossiapatite (nHA) o glicosaminoglicani (GAG), che si trovano naturalmente ad alte concentrazioni nell'osso e nel midollo osseo, i siti metastatici più comuni del neuroblastoma. La struttura porosa 3D di questi scaffold consente l'attaccamento, la proliferazione e la migrazione delle cellule di neuroblastoma e la formazione di cluster cellulari. In questa matrice 3D, la risposta cellulare alle terapie riflette maggiormente la situazione in vivo .
Il sistema di coltura basato su scaffold è in grado di mantenere densità cellulari più elevate rispetto alle colture cellulari bidimensionali (2D) convenzionali. Pertanto, i protocolli di ottimizzazione per il numero di celle di semina iniziali dipendono dai tempi sperimentali desiderati. Il modello viene monitorato valutando la crescita cellulare tramite la quantificazione del DNA, la vitalità cellulare tramite saggi metabolici e la distribuzione cellulare all'interno degli scaffold tramite colorazione istologica.
Le applicazioni di questo modello includono la valutazione dei profili di espressione genica e proteica, nonché i test di citotossicità utilizzando farmaci convenzionali e miRNA. Il sistema di coltura 3D consente la manipolazione precisa dei componenti cellulari e dell'ECM, creando un ambiente fisiologicamente più simile al tessuto tumorale nativo. Pertanto, questo modello 3D in vitro farà progredire la comprensione della patogenesi della malattia e migliorerà la correlazione tra i risultati ottenuti in vitro, in vivo in modelli animali e soggetti umani.

Il modello di scaffold a base di collagene qui descritto ha molte applicazioni che vanno dallo studio della biologia del neuroblastoma allo screening di terapie antitumorali in un ambiente che è fisiologicamente più simile ai tumori nativi rispetto alla coltura cellulare 2D convenzionale. Prima di testare una determinata domanda di ricerca, è fondamentale ottenere una caratterizzazione completa dell'attaccamento, della proliferazione e dell'infiltrazione cellulare entro il periodo di tempo sperimentale desiderato. Le condizioni di crescita dipenderanno dalla biologia di ogni specifica linea cellulare. È importante sottolineare che devono essere implementati diversi metodi di valutazione della crescita cellulare per determinare le condizioni ottimali e le prestazioni robuste.
Qui, la vitalità delle cellule di neuroblastoma cresciute su scaffold è stata valutata utilizzando un test colorimetrico di vitalità cellulare. Questo test può essere eseguito con la frequenza desiderata durante tutto il periodo sperimentale. Per l'esperimento descritto, la valutazione della vitalità cellulare è stata eseguita nei giorni 1, 7 e 14 per due linee cellulari di neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cresciute su scaffold Coll-I-nHA a 4 diverse densità (Figura 6). La vitalità del giorno 1 è stata impostata come linea di base per confrontare tutte le misurazioni successive. Il tasso di riduzione del reagente di vitalità cellulare riflette la biologia cellulare e le caratteristiche di crescita delle singole linee cellulari, compresi i loro tassi di proliferazione e il metabolismo. Ci si aspettava una correlazione tra il numero di cellule seminate sugli scaffold e il livello di riduzione. In questo esperimento, la riduzione del reagente di vitalità cellulare è generalmente aumentata con ogni punto temporale per entrambe le linee cellulari a tutte le densità, come previsto.
Ogni densità è stata quindi valutata individualmente per entrambe le linee cellulari per confrontare la riduzione in diversi punti temporali. È stata eseguita un'ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey per rilevare differenze significative nella riduzione tra i punti temporali (Figura 7). Sia per le linee cellulari che per tutte le densità di semina, c'è stato un aumento significativo (P<0,05) nella riduzione del reagente di vitalità cellulare confrontando il giorno 1 e il giorno 14. Ciò ha indicato un aumento significativo delle cellule metabolicamente attive presenti sugli scaffold. Questo aumento non è stato significativo in tutti i casi quando si valutano gli intervalli di 7 giorni (giorno 1 vs. giorno 7, giorno 7 vs. giorno 14), dimostrando l'importanza dell'ottimizzazione della densità di semina per raggiungere la finestra di crescita desiderata.
Per supportare i risultati del saggio di vitalità cellulare, la crescita cellulare sugli scaffold può anche essere misurata indirettamente tramite la quantificazione del dsDNA estratto dagli scaffold utilizzando un colorante fluorescente di dsDNA (Figura 8A). Come la vitalità cellulare, la quantificazione del DNA può essere eseguita con la frequenza desiderata all'interno della linea temporale sperimentale. Tuttavia, questa analisi richiede il recupero completo degli scaffold e la cessazione della crescita cellulare e quindi deve essere presa in considerazione nella pianificazione sperimentale come discusso nella sezione 1. Per questo esperimento, il DNA è stato quantificato nei giorni 1, 7 e 14 per due linee cellulari di neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cresciute su scaffold Coll-I-nHA a 4 diverse densità. Poiché la concentrazione media di dsDNA per cellula è nota per queste linee cellulari, è stato possibile ricavare il numero di cellule per campione dal DNA quantificato (Figura 8B).
La quantificazione del DNA ha dato luogo a una maggiore variabilità tra le repliche biologiche rispetto alla valutazione della vitalità cellulare, ma generalmente è aumentata per ogni punto temporale, con i livelli più alti quantificati il giorno 14. Le cellule IMR32 sembrano raggiungere un numero di cellule più elevato sugli scaffold Coll-I-nHA, come indicato dalla concentrazione di DNA, rispetto alle cellule KellyLuc. Ogni densità è stata quindi valutata individualmente per le due linee cellulari per confrontare la riduzione in tutti i punti temporali. È stata eseguita un'ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey per rilevare differenze significative nella riduzione tra i punti temporali (Figura 8B).
Per entrambe le linee cellulari e per tutte le densità di semina, c'è stato un aumento significativo (P<0,05) del numero di cellule quando si confrontano il giorno 1 e il giorno 14, con l'eccezione di KellyLuc alla densità di semina 4 (1 × 105 cellule/scaffold), che non ha prodotto aumenti significativi in nessuno dei punti temporali. Analogamente ai risultati di vitalità cellulare, gli aumenti non sono stati significativi in tutti i casi durante la valutazione degli intervalli di 7 giorni (giorno 1 vs giorno 7, giorno 7 vs giorno 14). Quando si confrontano le tendenze temporali per la vitalità cellulare e la quantificazione del DNA, sono emerse alcune lievi differenze tra le due analisi. Tuttavia, nel complesso sono state osservate tendenze simili, con valori medi in aumento tra intervalli di 7 giorni per la maggior parte delle densità. Ciò dimostra l'importanza di monitorare la crescita cellulare utilizzando più di un metodo.
Successivamente è stata implementata una valutazione visiva della morfologia e della distribuzione della crescita cellulare sugli scaffold, che comprende la colorazione tradizionale dell'ematossilina e dell'eosina (H&E) e l'IHC. Si prevede che i diversi modelli di crescita delle singole linee cellulari porteranno a varie disposizioni spaziali sugli scaffold, compresi diversi gradi di penetrazione nello scaffold e il raggruppamento cellulare. Gli scaffold sono stati fissati in formalina, inclusi in paraffina e tagliati in sezioni di 5 mm (Figura 9A), preparando gli scaffold per molteplici tecniche di visualizzazione, tra cui la colorazione istologica e l'IHC.
La colorazione di routine H&E è stata applicata alle cellule Kelly, KellyCis83 e IMR32 cresciute su scaffold a base di collagene nei giorni 1, 7 e 14 (Figura 9B). Ciò ha permesso di visualizzare l'orientamento spaziale delle cellule su due scaffold a base di collagene per un periodo di 14 giorni. Le cellule Kelly sensibili al cisplatino e le cellule resistenti KellyCis83 sono state coltivate su scaffold Coll-I-nHA (Figura 9B, i) e scaffold Coll-I-GAG (Figura 9B, ii). Coerentemente con i dati pubblicati in precedenza, le cellule KellyCis83 sono cresciute a un tasso più elevato e si sono infiltrate più in profondità in entrambe le composizioni dell'impalcatura rispetto alla linea cellulare Kelly meno invasiva. La colorazione H&E di un'altra linea cellulare di neuroblastoma, IMR32, coltivata su Coll-I-nHA mostra un modello di crescita contrastante (Figura 9B, iii). Questa linea cellulare è cresciuta in grandi grappoli densamente impacchettati sugli scaffold di collagene durante il periodo di 14 giorni. La microscopia confocale in campo chiaro può essere utilizzata per visualizzare l'architettura porosa degli scaffold a base di collagene (Figura 9C) grazie all'autofluorescenza delle fibre di collagene.
Abbiamo colorato le cellule con falloidina mirata all'actina del citoscheletro e al controcolorante nucleare, 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), per monitorare tratti cellulari specifici durante la linea temporale sperimentale. Un'abbondanza di actina è stata osservata nelle cellule Kelly e KellyCis83 sugli scaffold Coll-I-GAG utilizzando questa tecnica (Figura 9D). Questi risultati dimostrano come più tecniche di imaging possano essere utilizzate per derivare informazioni spazialmente risolte da cellule di neuroblastoma cresciute su scaffold utilizzando questo protocollo. Questa caratterizzazione dei modelli di crescita cellulare su scaffold a base di collagene in un determinato periodo migliorerà la comprensione e l'interpretazione di qualsiasi saggio biochimico a valle.
L'espressione proteica da parte di cellule cresciute su scaffold a base di collagene può essere analizzata per confrontare l'attività cellulare con scenari in vivo . I dati pubblicati in precedenza hanno esaminato l'espressione della cromogranina A (CgA) come marcatore surrogato secreto di neuroblastoma da parte di cellule KellyLuc e KellyCis83Luc cresciute in monostrati cellulari e su scaffold Coll-I-nHA e Coll-I-GAG (Figura 10). La CgA è stata valutata nei terreni condizionati utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) (Figura 10A). La CgA è secreta a un tasso più elevato nella linea cellulare KellyCis83 chemio-resistente più aggressiva rispetto a Kelly (Figura 10B,C). Ciò è stato significativo il giorno 7 su entrambi gli scaffold Coll-I-GAG e Coll-I-nHA (P<0,05), mentre non c'era alcuna differenza significativa in questo momento per le cellule cresciute come monostrato da colture 2D convenzionali.
Questi risultati evidenziano anche la tempistica sperimentale ristretta quando si coltivano le cellule in un monostrato, con soli 7 giorni di crescita che si rivelano fattibili prima che le cellule raggiungano la confluenza. La crescita delle cellule sugli scaffold supera questa limitazione in quanto possono essere mantenute per un periodo più lungo in condizioni fisiologicamente più rilevanti. La suddetta combinazione di tecniche per acquisire informazioni sulla vitalità cellulare, sul contenuto di DNA, sulla morfologia cellulare e sulla disposizione spaziale e sui profili di espressione facilita la valutazione della crescita delle cellule di neuroblastoma su una serie di scaffold a base di collagene. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per soddisfare specifiche esigenze sperimentali e applicazioni desiderate.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig06.jpg"> Figura 6: Analisi della vitalità cellulare. (A) Procedura generale per misurare la vitalità delle cellule di neuroblastoma su scaffold a base di collagene utilizzando un saggio colorimetrico di vitalità cellulare. Il periodo di incubazione deve essere ottimizzato per ogni nuova linea cellulare, facendo riferimento alle linee guida del produttore. (B) Riduzione percentuale del reagente di vitalità cellulare da parte di cellule KellyLuc e IMR32 cresciute su scaffold Coll-I-nHA a quattro diverse densità di semina iniziali, misurate nei giorni 1, 7 e 14. I campioni sono stati valutati in triplice copia biologica con barre di errore che rappresentano la deviazione standard. Abbreviazioni: nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig07.jpg"> Figura 7: Vitalità cellulare per densità di semina per cellule cresciute su Coll-I-nHA in un periodo di 14 giorni. (A) KellyLuc; (B) IMR32. I numeri di cella titolati si riferiscono alla densità iniziale di semina delle cellule sugli scaffold il giorno 0. I campioni sono stati valutati in triplice copia biologica, indicata da punti triplicati, con barre che rappresentano la media. L'ANOVA unidirezionale con confronti multipli è stata utilizzata per rilevare differenze significative nella riduzione della percentuale di reagenti di vitalità cellulare nei tre punti temporali, annotati sui grafici (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abbreviazioni: nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA; ANOVA = analisi della varianza; ns = non significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig08.jpg"> Figura 8: Quantificazione del DNA estratto da cellule in scaffold. (A) Processo di quantificazione del dsDNA da cellule cresciute su scaffold a base di collagene utilizzando una colorazione fluorescente di dsDNA. (B) Numero di cellule dall'analisi di quantificazione del DNA per densità di semina per cellule KellyLuc e IMR32 cresciute su Coll-I-nHA per un periodo di 14 giorni. I numeri di cella titolati si riferiscono alla densità iniziale di semina delle cellule sugli scaffold il giorno 0. I campioni sono stati valutati in triplice copia biologica, indicata da punti triplicati, con barre che rappresentano la media. L'ANOVA unidirezionale con confronti multipli è stata utilizzata per rilevare differenze significative nel numero di cellule nei tre punti temporali, annotate sui grafici (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abbreviazioni: nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA; dsDNA = DNA a doppio filamento; TE = Tris-EDTA; ANOVA = analisi della varianza; ns = non significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig09.jpg"> Figura 9: Fasi di processamento tissutale per l'analisi immunoistochimica degli scaffold . (A) Rappresentazione schematica del protocollo per l'elaborazione degli scaffold per l'analisi delle immagini. Questo processo consente la colorazione istologica di routine e il sondaggio di anticorpi specifici utilizzando anticorpi primari e anticorpi secondari marcati con fluorescenza. (B) Immagini rappresentative di tre linee cellulari di neuroblastoma sottoposte a colorazione H&E. Le immagini H&E vengono scattate nei giorni 1, 7, 14 per monitorare i modelli di crescita nel corso dell'esperimento. Barra della scala = 200 μm. I quadrati tratteggiati rappresentano l'area scelta per le immagini ingrandite 20x sul bordo inferiore sinistro. Barra della scala = 20 μm. (i e ii) H&E delle linee cellulari di neuroblastoma Kelly e KellyCis83 (pannelli superiore e inferiore, rispettivamente) su due tipi di scaffold a base di collagene. (iii) H&E della linea cellulare IMR32, che rappresenta la crescita cellulare raggruppata sullo scaffold Coll-I-nHA. (C) Immagine rappresentativa della linea cellulare di Kelly, sottoposta a microscopia confocale in campo chiaro. L'autofluorescenza del collagene consente la visualizzazione dell'impalcatura porosa. Barra della scala 10x = 200 μm, barra della scala 20x = 20 μm. (D) Immagine rappresentativa degli scaffold incorporati seguita da analisi mediante IHC con falloidina e DAPI a ingrandimento 10x, barra della scala = 200 μm. I quadrati interni più piccoli rappresentano le immagini ingrandite (20x), la barra della scala = 20 μm. Abbreviazioni: nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = scaffold di collagene integrati con condroitina-6-solfato; H&E = ematossilina ed eosina; IHC = immunoistochimica; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig10.jpg"> Figura 10: Espressione proteica da parte di cellule di neuroblastoma cresciute su scaffold a base di collagene 3D rispetto alla plastica 2D. (A) Uno schema di come l'ELISA CgA è stato eseguito su terreni condizionati di cellule cresciute su scaffold plastici 2D o a base di collagene 3D. (B) Livelli di espressione della proteina CgA prelevati da terreni condizionati di cellule cresciute su un monostrato plastico 2D. Poiché le cellule hanno raggiunto la confluenza dopo 7 giorni, il punto temporale di 14 giorni non era leggibile. Al giorno 7 sulla plastica, non c'era alcuna differenza significativa nei livelli di CgA tra le linee cellulari Kelly e KellyCis83. (C) L'ELISA CgA è stato eseguito utilizzando terreni condizionati di cellule cresciute su scaffold a base di collagene per 14 giorni consecutivi. Il giorno 7, su entrambi gli scaffold di collagene, i livelli di CgA sono più alti nella linea cellulare KellyCis83 più aggressiva, evidenziando livelli più rilevanti fisiologici di CgA nella matrice 3D rispetto al monostrato 2D. Questa figura è stata modificata da Curtin et al.17. Abbreviazioni: 3D = tridimensionale; 2D = bidimensionale; CgA = cromogranina A; ELISA = saggio di immunoassorbimento enzimatico; nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = scaffold di collagene integrati con condroitina-6-solfato; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; HRP = perossidasi di rafano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig10large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Questo documento elenca i passaggi necessari per seminare linee cellulari di neuroblastoma su scaffold tridimensionali a base di collagene precedentemente descritti, mantenere la crescita cellulare per un periodo di tempo predeterminato e recuperare scaffold per diverse analisi della crescita cellulare e del comportamento cellulare e applicazioni a valle, adattabili per soddisfare una serie di obiettivi sperimentali.

Modello biomimetico tridimensionale in vitro di neuroblastoma utilizzando scaffold a base di collagene

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Il nostro protocollo offre un modello 3D bio-ingegnerizzato che interessa da vicino il tessuto nativo. Questo può potenzialmente essere utilizzato per scoprire nuove terapie e biomarcatori per il trattamento e la diagnosi del neuroblastoma. Il vantaggio principale è che crea condizioni sperimentali più rilevanti dal punto di vista fisiologico per studiare il microambiente tumorale utilizzando una tecnica riproducibile che raggiunge la coerenza da lotto a lotto.Il nostro metodo scaffold può essere utilizzato in primo luogo per identificare nuove terapie per il neuroblastoma e, in secondo luogo, per incorporare cellule derivate dal paziente per una migliore previsione della risposta individuale del paziente. Per iniziare, posizionare l'impalcatura immagazzinata in PBS nella cappa a flusso laminare. Utilizzare una pinzetta sterile per sollevare delicatamente l'impalcatura dall'angolo e premere contro la parete laterale per rimuovere il PBS in eccesso.Quindi posizionare l'impalcatura con lo strato lucido rivolto verso il basso al centro del pozzetto di una piastra a 24 pozzetti non aderente. Etichettare la piastra con i dettagli della linea cellulare, della densità di semina e dei punti temporali. Lavorare con le cellule di una densità di semina alla volta e mantenere le cellule rimanenti a 37 gradi Celsius nell'incubatrice, fino al momento dell'uso.Per il fissaggio delle cellule nello scaffold, utilizzare una pipetta P20 con puntali sterili per miscelare accuratamente la sospensione cellulare e aggiungere 20 microlitri della sospensione cellulare pertinente al centro di ciascuna impalcatura, assicurandosi che la sospensione cellulare rimanga sopra l'impalcatura e non sulla parete laterale o sulla base del pozzetto. Lascia che le cellule si attacchino per tre o cinque ore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica e al 95% di umidità. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere lentamente un millilitro di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto, evitando lo spostamento degli scaffold, e incubare la piastra durante la notte.Osservare gli scaffold, inizialmente, ogni due o tre giorni per i cambiamenti di colore del mezzo di crescita man mano che le cellule proliferano all'interno dell'impalcatura. Utilizzare una pistola per pipette da 10 millilitri con modalità lenta per rimuovere ed eliminare un millilitro del mezzo esausto dal pozzetto. Quando il terreno condizionato viene utilizzato per l'esperimento, raccogliere il terreno esausto delle repliche biologiche in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione.Trasferire il surnatante in una provetta nuova e conservare la provetta a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver impostato la pistola per pipette in modalità gocciolante, aggiungere delicatamente due millilitri di terreno di coltura preriscaldato agli scaffold. Incubare la piastra contenente l'impalcatura e reintegrare il terreno fresco per la durata del periodo di crescita desiderato, come dimostrato.Nella cappa a flusso laminare, sterilizzare il reagente appropriato per il saggio di vitalità cellulare mediante filtrazione attraverso un filtro sterile da 0,2 micrometri in una provetta da centrifuga. Preriscaldare la soluzione sterile, il terreno di coltura completo e il PBS sterile a bagnomaria, a 37 gradi Celsius. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire gli scaffold da analizzare in una nuova piastra a 24 pozzetti ed etichettare la piastra con tutti i dettagli pertinenti.Aggiungere 900 microlitri di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto. Quindi aggiungere 100 microlitri del reagente sterile per la vitalità cellulare a ciascun pozzetto. Per un controllo negativo, aggiungere 900 microlitri di terreno e 100 microlitri di reagente sterile per la vitalità cellulare in un pozzetto senza scaffold.Riposizionare il coperchio sulla piastra e far oscillare delicatamente la piastra per circa tre minuti per distribuire il reagente di vitalità cellulare diluito in tutto il pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità. Dopo aver tolto la piastra dall'incubatrice, scuotetela delicatamente per alcuni secondi e generate le triplicate, come dimostrato nel manoscritto del testo.Generare le triplicate tecniche trasferendo 100 microlitri del terreno incubato e del reagente da un pozzetto della piastra a 24 pozzetti in un pozzetto della piastra traslucida a 96 pozzetti ed eseguire questo passaggio per un totale di tre volte per un pozzetto. Coprire la piastra a 96 pozzetti con un foglio di alluminio per proteggere il reagente di vitalità cellulare dalla luce. Rimuovere ed eliminare i restanti 700 microlitri di terreno e reagente dagli scaffold nella piastra a 24 pozzetti.Lavare ogni impalcatura due volte con un millilitro di PBS sterile. Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 570 e 600 nanometri e calcolare la riduzione percentuale dei reagenti di vitalità cellulare secondo le raccomandazioni del produttore. Analizzare statisticamente i risultati di vitalità cellulare, utilizzando un software appropriato.Inserire i valori biologici triplicati per produrre barre di errore e indicare la variabilità del saggio. Eseguire un'analisi unidirezionale del test di varianza per esaminare i cambiamenti nella vitalità cellulare nell'arco di tempo sperimentale utilizzando un software biostatistico appropriato. Indicare le differenze significative tra i punti temporali sui grafici, come descritto nel manoscritto del testo.È stata valutata la vitalità di due linee cellulari di neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, coltivate sugli scaffold. L'aumento della densità cellulare ha comportato una maggiore riduzione del reagente di vitalità cellulare nel tempo. La crescita cellulare sugli scaffold è stata misurata indirettamente quantificando il DNA estratto dagli scaffold e sono state calcolate le cellule per campione.Le cellule IMR32 hanno mostrato un aumento della crescita, quindi le cellule KellyLuc, con il tempo. La morfologia di crescita e la distribuzione delle cellule sugli scaffold sono state valutate visivamente mediante ematossilina, eosina e colorazione immunoistochimica. Le cellule KellyCis83 sono cresciute più velocemente e si sono infiltrate più in profondità in entrambe le composizioni di scaffold rispetto alla linea cellulare Kelly meno invasiva.IMR32 coltivato su nano-idrossiapatite ha dimostrato un modello di crescita contrastante con grappoli grandi e densamente impacchettati, nell'arco di 14 giorni. I tratti cellulo-specifici sono stati monitorati mediante colorazione immunoistochimica, seguita da colorazione falloidina e DAPI, e l'abbondanza di actina è stata osservata nelle cellule Kelly e KellyCis83 su scaffold di collagene-glicosaminoglicani. Per la valutazione dell'attività cellulare in vitro, sono stati misurati i livelli secreti di cromogranina A e le cellule cresciute su scaffold di collagene-glicosaminoglicani e nano-idrossiapatite di collagene hanno prodotto più cromogranina A rispetto alla crescita su coltura 2D convenzionale.La linea cellulare KellyCis83 resistente alla chemio ha secreto più cromogranina A rispetto alla linea cellulare Kelly. Dopo l'attacco cellulare, le cellule possono essere trattate con varie terapie. Ciò fornirebbe risultati fisiologicamente più rilevanti per la risposta delle cellule ai farmaci rispetto alla coltura 2D convenzionale.Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare meglio come le cellule tumorali si comportano e reagiscono a uno stimolo all'interno del microambiente tumorale, che va dalla risposta alle terapie o alle interazioni con altri tipi di cellule.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studio di vettori virali in un tridimensionale fegato Modello ripopolata con l&#39;Umano carcinoma epatocellulare Linea cellulare HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Ricerca

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Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

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