Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
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この研究は、National Children's Research Centre(NCRC)、Irish Research Council(IRC)、およびNeuroblastoma UKの支援を受けた。イラストはBioRenderを使用して作成されました。

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著者は利益相反がないことを宣言します。

3D足場がん細胞モデルは、簡略化されたTME32における神経芽細胞腫細胞の増殖、生存率、および細胞の浸潤に関するメカニズムの洞察を得るための貴重で用途の広いツールであることが証明されています。ここで説明する3D神経芽腫モデルは、最小TMEを模倣し、2D単層培養よりも生理学的に関連性のあるデータを提供します。3D細胞培養の大きな欠点は、実験が複雑になり、時間が長くなることです。ここでは、コラーゲンベースの足場上で神経芽腫細胞の播種、増殖、および維持のための最適化されたプロトコルと、それに続く下流の分析とアプリケーションについて説明し、細胞増殖の堅牢な特性評価を実現します。私たちは、足場に最適な細胞播種密度に関する洞察を得て、抗がん剤治療を評価するための予測可能で制御可能な環境を14日間の迅速な実験ウィンドウで作成することを目指しました。これらすべての記述された簡単なプロトコルの組み合わせは、足場ベースの in vitro 培養システムにおける神経芽腫細胞増殖の包括的な評価を提供します。
プロトコール設定の重要なポイントは、科学者が研究室で迅速に確立できるように強調されています。例えば、比色細胞生存率アッセイの性能を向上させるために示されたインキュベーション時間により、足場細孔への試薬のより深い浸透がすべての細胞に到達することができます。さらに、蛍光dsDNA染色技術は頑健で簡単です。しかし、足場からのDNA放出には、細胞がコラーゲン繊維内に「閉じ込められる」ため、活発な細胞溶解が必要です。
このモデルを用いて、抗がん剤スクリーニング用のコラーゲンベースの足場の対数成長期を同定することができます。記載された実験設定では、4つの初期細胞播種密度を、全体で14日間の期間と1日目、7日目、および14日目の分析時点とともに使用しました。4×105細胞/足場に播種されたKellyLuc細胞は、7日目から14日目の間に最も有意に活発な増殖ウィンドウを持つことを特定しました。この対数相増殖データにより、さまざまな細胞毒性実験の信頼性の高い解釈が可能になります。これにより、薬物の毒性ではなく、3D多孔質プラットフォーム上での増殖の抑制に起因する増殖または細胞死の低下に関する憶測が排除されます。細胞生存率は、異なる細胞タイプの増殖をサポートするための3Dプラットフォームの適合性についても広く使用されている評価です33,34。細胞生存率を測定するには、生染色/死染色、ATP測定、増殖アッセイなど数多くのアッセイがありますが、Alamar Blue比色細胞生存率アッセイの使用は、DNA定量データをサポートするためのシンプルで効果的な手法であることがわかりました。
DNA定量と細胞生存率の併用により、14日間にわたって継続的な増殖を達成するために足場に播種する細胞の最適な密度は、平均して2〜4〜×105 細胞/足場であるという補完的な証拠が得られました。ただし、このプロトコルは、さまざまな実験時間枠、分析時間ポイント、およびダウンストリームアプリケーションを満たすように簡単に適合させることができます。このプロトコルが足場のneuroblastomaのセルの単一培養のセル成長の評価を記述するが、足場は共同培養のためのプラットホームとして使用のために容易に修正可能である、傷治療の調査のケラチノサイトそして線維芽細胞を共培養するのにコラーゲンGAGの足場を利用した等Amaralを、する35。
記載された3Dモデルは、免疫蛍光法や標準H&Eなどのさまざまなよく知られた技術を使用して、細胞の増殖と浸潤を可視化することを可能にします。細胞形態や足場上の増殖パターンの多様性により、生化学的アッセイを用いて細胞を可視化し、増殖の特性評価を行うことが重要です。増殖パターンを理解することで、成長行動や抗がん剤に対する将来の反応に関する洞察を得ることができます。例えば、DNA定量を用いたIMR32の増殖はKellyと同様のパターンをもたらしますが、H&Eを用いた可視化では、IMR32はより分散した増殖を示したKellyよりも大きなクラスターで増殖します(図9)。足場内の細胞株のこれらの多様な増殖パターンは、腫瘍の不均一性の臨床シナリオを反映している。3Dスキャフォールドで形態の異なる細胞株のパネルを使用して抗がん剤の反応を調べると、同じ薬剤に対する患者の反応の予測値が高まります。
遺伝子またはタンパク質発現の検出は、目的のタンパク質が分泌される場合、RT-qPCRやELISAなどの他のアプローチを使用して行うこともできます。神経芽腫進行の代理マーカーであるクロモグラニンA(CgA)36を使用して、神経芽腫細胞増殖を3Dでさらに特徴付けました。先行研究17で説明したように、細胞が増殖するにつれてCgA分泌が増加しました(図10)。単層細胞培養ではこの増加を捉えることができませんでしたが、増殖は細胞が培養皿内で完全にコンフルエントに達したことを意味するため、3Dコラーゲンスキャフォールドを使用することで、CgA分泌の長期評価が可能になりました。
この3D in vitro モデルは、神経芽腫の生物学と治療薬への反応を研究するためのすべての研究課題に適しているとは限りません。制限の1つは、足場内の不均一な細胞浸透と、特定の細胞株に依存するさまざまなサイズの細胞クラスターの形成であり、栄養素と試験薬の制御不能な拡散につながる可能性があります。この特徴は、治療スクリーニングにおける頑健性に影響を与えます。しかしながら、この限界にもかかわらず、天然腫瘍はサイズおよびがん細胞の分布においても不均一であり、腫瘍組織内に他の多くの細胞型を含むことを考慮することが重要である。この制限を克服するために、各細胞が投入された足場を単一の微小組織として使用し、次のパラメーターを最適化することを提案します:(a)細胞生存率試薬が細胞および細胞クラスターに到達するためのインキュベーション時間、および(b)足場上の細胞を組織ライザーで前処理することにより、Triton X-100バッファーで細胞を溶解し、足場の奥深くに含まれる細胞のDNAを放出します。
このプロトコルのもう一つの技術的制限は、このモデル用に新しく製造された足場の各バッチの機械的テストの欠如です。しかし、足場の物理的および化学的特性(圧縮弾性率および引張弾性率、気孔率および視覚的細孔構造、および均質性)に関連して広範囲に特徴付けられている足場の堅牢な製造プロセスを使用することで、足場の品質がバッチ21、24、27、30、37を通じて維持されることが保証されます。
要約すると、この論文は、コラーゲンベースの足場上の細胞増殖を分析するための一連の簡単な方法を提示します。実験のタイムラインと分析ポイントは、特定の研究課題に応じて入れ替えることができます。このプロトコルは他の細胞タイプにも適応可能です。上記の結果は、この方法の編集により、さまざまな神経芽腫細胞株が14日間にわたって連続的に増殖するための最適な播種密度に関する洞察がどのように得られたかについての証拠を提供します。このプロトコルのすべての方法から得られる結果の合併は3Dコラーゲンのマトリックス内のセル成長の優秀な理解をもたらします。このモデルの将来の利用には、神経芽細胞腫TMEに特異的な共培養システムや、さまざまな新規抗がん剤の試験が含まれる可能性があります。

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Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

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Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

神経芽細胞腫は、神経堤細胞の形質転換により、胚発生期または出生後早期に発生する交感神経系の小児がんである1。小児に最も多くみられる固形頭蓋外腫瘍であり、15歳未満の患者で診断される悪性腫瘍の8%を占め、小児がんによる死亡全体の15%の原因となっている。この疾患は、特定の染色体、遺伝的およびエピジェネティックな変化、および組織病理学的特徴により、非常に不均一な臨床行動を示します。
これらの変化は、神経芽腫の侵攻性および小児患者の転帰不良に寄与する。したがって、現在の治療法は、臨床的に侵攻性疾患の患者のほぼ80%に対して長期的には効果がないことが証明されており2、このグループの患者に対する治療が依然として困難であるという事実を浮き彫りにしています。これは、神経芽腫の不均一性と転移のメカニズムがまだ完全に理解されていないことが原因である可能性があります。しかし、腫瘍微小環境(TME)は現在、多くのがんの進行に関与していると広く信じられています。しかし、神経芽細胞腫では研究が不十分なままです3,4。
ネイティブTMEは、ECMに囲まれたがん細胞と非がん細胞を含む複雑な3D微小環境です。ECMとは、組織の無細胞成分を指し、細胞の常在員に構造的および生化学的サポートを提供し、疾患の進行、患者の予後、および治療反応に寄与します5。この疾患進行の促進は、細胞とECMとの間の「動的互恵性」または継続的な双方向通信によるものです6,7,8。がんが進行するにつれて、間質コラーゲンはしばしば間質とがんの界面に垂直な線状に再編成され、がん細胞はこれを転移への移動経路として利用します9,10,11。
この天然の機能的生物学的足場の主成分には、I型およびII型コラーゲンの繊維状ネットワーク、およびエラスチン、ラミニンなどの糖タンパク質、ならびにさまざまなプロテオグリカンおよびその他の可溶性成分が含まれます12,13。天然ECMのこれらのタンパク質は、現在、3D in vitroモデルを開発するための魅力的な天然生体分子となっています3。in vitro細胞培養用の3Dスキャフォールドの用途は、従来の2D単層培養と比較してTMEの生理学的表現が優れているため、人気が高まっています。製造された3Dスキャフォールドは、細胞の接着、増殖、遊走、代謝、およびin vivoの生物学的システムに見られる刺激への応答を支援します。
これらの3D足場の主成分はコラーゲンであり、組織修復、血管新生、組織形態形成、細胞接着、遊走など、多くの正常な生物学的プロセスにおいて重要な役割を担っています11。コラーゲンベースの3Dマトリックスは、ECMをモデル化する堅牢な機能を示しており、in vitroの生体模倣微小環境として機能し、細胞とECMの相互作用、および細胞の遊走と浸潤を可能にします。また、これらの3Dマトリックスは、神経芽細胞腫17,18を含む多くのがんモデルにおいて、従来の2Dまたは「フラット」培養よりも、化学療法薬に対する細胞応答のより正確な分析を提供します14,15,16。3D細胞培養の遺伝子解析では、動物モデルと比較しても、ヒト組織プロファイルとの相関が高いことが報告されています19。全体として、これらの3Dスキャフォールドの基礎となるのは、細胞に適切なin vitro環境を提供することであり、これは天然の組織構造を再現し、双方向の分子クロストークを促進します8。
コラーゲンベースのモデルの複雑さを増すために、他の一般的なECMコンポーネントが組織工学プロセスに組み込まれているため、さまざまな組織のニッチなTMEを反映する、より生理学的に関連性のあるモデルが作成されます。例えば、すべての哺乳類組織に存在する負に帯電した多糖類であるGAGは20、細胞の接着、遊走、増殖、および分化を促進する。コンドロイチン硫酸は、骨や軟骨に見られる特定のタイプのGAGであり、以前は骨修復のための組織工学用途で使用されてきました21,22,23,24,25。ナノハイドロキシアパタイト(nHA)は、人間の骨組織のミネラル組成の主要な無機成分であり、骨の重量で最大65%を構成する26ため、骨の置換と再生に広く使用されています27。したがって、GAGとnHAは、原発性神経芽腫ECMを再建し、神経芽腫、骨髄(70.5%)、および骨(55.7%)の最も一般的な転移部位をモデル化するための魅力的な複合材料です28。
これらのECMコンポーネントを組み込んだ足場は、もともと骨組織工学アプリケーション向けに開発され、それらの生体適合性、毒性、および骨伝導性および骨誘導性の特徴を広範囲に分析しました29,30。これらは、凍結乾燥技術を使用して製造された多孔質のコラーゲンベースのマトリックスであり、物理的および生物学的特性を制御します。nHA(Coll-I-nHA)またはコンドロイチン-6-硫酸(Coll-I-GAG)のいずれかを添加したコラーゲン足場は、乳がん31の原発性TMEを模倣することに成功し、前立腺がん15および神経芽細胞腫17の骨への転移を模倣することに成功しました。これらの複合足場を製造するために使用される凍結乾燥技術は、足場内の細孔サイズと気孔率に再現可能な均質性をもたらします22,23,24。簡単に説明すると、線維性コラーゲンと0.05M酢酸をブレンドしてコラーゲンスラリー(0.5重量%)を作製します。Coll-I-GAGでは、サメの軟骨から単離された0.05wt%のクロノイチン-6-硫酸塩をコラーゲンスラリーに添加しながらブレンドします。複合Coll-I-nHAスキャフォールドでは、ナノサイズのハイドロキシアパタイト粒子が前述のように合成され27、ブレンドプロセス中にコラーゲンの重量に対して2:1の比率でコラーゲンスラリーに添加されます。すべての足場は物理的に架橋され、105°Cで24時間25分の脱水熱処理を使用して滅菌されます。円筒形の足場(直径6mm、高さ4mm)は、生検パンチを用いて得られ、3mMのN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩および5.5mMのN-ヒドロキシコハク酸イミド(EDAC/NHS)で化学的に架橋して、構築物の機械的特性を改善することができる30。2つのコラーゲン足場のこの最適化された製造プロセスにより、細孔径、気孔率、剛性(kPa)などの再現性のある機械的特性を備えた足場が作成されます。Coll-I-GAGとColl-I-nHAの足場はどちらも物理的特性が異なるため、環境条件も異なります。各スキャフォールドの特性を表1に示す。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Coll-I-GAGの</td>
			<td>Coll-I-nHA(コリ・イ・インハ)</td>
		</tr><tr><td>足場サイズ (直径[mm]×高さ[mm])</td>
			<td>6×4 17</td>
			<td>6×4 17</td>
		</tr><tr><td>コラーゲン濃度(wt. %)</td>
			<td>0.5 17</td>
			<td>0.5 17</td>
		</tr><tr><td>基質濃度(wt. %) [コラーゲンの重量に基づく]</td>
			<td>0.05 15.17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>平均細孔径(mm)</td>
			<td>96歳22歳</td>
			<td>96 - 120 29</td>
		</tr><tr><td>気孔率(%)</td>
			<td>99.5 23</td>
			<td>98.9 - 99.4 27</td>
		</tr><tr><td>剛性(kPa)</td>
			<td>1.5°C 27°C</td>
			<td>5.5〜8.63 29</td>
		</tr></tbody></table>表1:神経芽腫生物学の研究に採用された2つの足場の機械的特性の概要。
この論文では、神経芽細胞腫細胞株と、nHA(Coll-I-nHA)またはコンドロイチン-6-硫酸塩(Coll-I-GAG)のいずれかを添加した以前に説明したコラーゲンベースの足場を使用して、神経芽細胞腫の微小環境をよりよく模倣するために3D足場ベースのシステムを組み立てるプロトコルについて説明します。プロトコルには、2D単層培養 図1から適応された以前に最適化された安価な方法を使用して、より生理学的に関連する環境で神経芽腫細胞の成長メカニズムを分析する下流の方法が含まれています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> 図1:プロトコルの全体的なワークフロー (A)細胞を十分な数まで増殖させ、分割し、計数し、適切な量の培地に再懸濁します。(B)次に、この細胞ストックを段階希釈して、密度の異なる合計4つの細胞懸濁液を調製します。(C)コラーゲンベースの足場を非接着性の24ウェルプレートに無菌播種し、(D)20μLの細胞懸濁液を各足場の中央に添加し、37°C、5%CO2、湿度95%で3〜5時間インキュベートします。 (E)次に、完全な増殖培地(1 mL)を各足場にゆっくりと添加し、プレートをインキュベーターに戻して、目的の時間枠で細胞増殖できるようにします。(f)所定の各時点で、細胞生存率および増殖評価、遺伝子発現解析、および組織学的染色のために、いくつかの足場を回収する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

神経芽腫は小児に最も多くみられる頭蓋外固形腫瘍であり、小児がんによる死亡全体の15%を占める。天然腫瘍組織は、細胞外マトリックス(ECM)に囲まれたがん細胞と非がん細胞の層を含む複雑な3次元(3D)微小環境です。ECMは、物理的および生物学的なサポートを提供し、疾患の進行、患者の予後、および治療反応に貢献します。
この論文では、神経芽腫細胞株とコラーゲンベースの足場を使用して、神経芽腫微小環境を模倣する3D足場ベースのシステムを組み立てるためのプロトコルについて説明します。足場には、神経芽腫の最も一般的な転移部位である骨および骨髄に高濃度で自然に見られるナノヒドロキシアパタイト(nHA)またはグリコサミノグリカン(GAG)のいずれかが添加されています。これらの足場の3D多孔質構造は、神経芽細胞腫細胞の接着、増殖および遊走、および細胞クラスターの形成を可能にする。この3Dマトリックスでは、治療薬に対する細胞応答は、 in vivo の状況をより反映しています。
足場ベースの培養システムは、従来の2次元(2D)細胞培養よりも高い細胞密度を維持できます。したがって、初期播種細胞数の最適化プロトコルは、目的の実験時間枠に依存します。このモデルは、DNA定量による細胞増殖、代謝アッセイによる細胞生存率、組織学的染色による足場内の細胞分布を評価することによってモニターされます。
このモデルのアプリケーションには、遺伝子およびタンパク質発現プロファイルの評価、および従来の薬剤およびmiRNAを使用した細胞毒性試験が含まれます。3D培養システムにより、細胞およびECMコンポーネントの正確な操作が可能になり、生理学的に天然の腫瘍組織に近い環境を作り出します。したがって、この3D in vitroモデルは、疾患の病因の理解を深め、in vitro 、 in vivo の動物モデル、およびヒト被験者で得られた結果との相関を改善します。

ここで説明するコラーゲンベースのスキャフォールドモデルは、神経芽腫生物学の研究から、従来の2D細胞培養よりも生理学的に天然腫瘍に類似した環境での抗がん治療薬のスクリーニングまで、多くの用途があります。特定の研究課題をテストする前に、目的の実験時間枠内で細胞の接着、増殖、および浸潤の完全な特性評価を得ることが重要です。増殖条件は、特定の各細胞株の生物学によって異なります。重要なことは、最適な条件と頑健な性能を決定するために、細胞増殖評価のいくつかの方法を実施する必要があるということです。
ここでは、足場上で増殖した神経芽腫細胞の生存率を比色細胞生存率アッセイを用いて評価した。このアッセイは、実験時間枠全体を通して必要な頻度で実行できます。記載された実験では、1日目、7日目、および14日目に、4つの異なる密度でColl-I-nHAスキャフォールド上で増殖させた2つの神経芽腫細胞株KellyLucおよびIMR32について細胞生存率評価を実施しました(図6)。1日目の生存率は、その後のすべての測定値を比較するためのベースラインとして設定されました。細胞生存率試薬の減少速度は、細胞生物学と個々の細胞株の増殖速度や代謝などの増殖特性を反映しています。足場に播種された細胞の数と減少のレベルとの間に相関関係があると予想されました。この実験では、細胞生存率試薬の減少は、予想通り、すべての密度で両方の細胞株について、各時点で概ね増加しました。
次に、各密度を両方の細胞株について個別に評価し、各時点間の減少を比較しました。テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析を実施して、時点間の減少の有意差を検出しました(図7)。細胞株とすべての播種密度の両方について、1日目と14日目を比較すると、細胞生存率試薬の減少に有意な増加(P<0.05)が見られました。これは、足場上に存在する代謝活性細胞の有意な増加を示しました。この増加は、7日間隔(1日目と7日目、7日目と14日目)を評価すると、すべてのケースで有意ではなく、望ましい成長ウィンドウを達成するための播種密度の最適化の重要性を示しています。
細胞生存率アッセイの結果を裏付けるために、蛍光dsDNA染色剤を用いて足場から抽出したdsDNAを定量することで、足場上の細胞増殖を間接的に測定することもできます(図8A)。細胞の生存率と同様に、DNAの定量は実験のタイムライン内で必要な頻度で行うことができます。ただし、この分析では、足場の完全な回収と細胞増殖の停止が必要なため、セクション1で説明したように実験計画に織り込む必要があります。この実験では、1日目、7日目、14日目に、Coll-I-nHAスキャフォールド上で4つの異なる密度で増殖させた2つの神経芽腫細胞株、KellyLucおよびIMR32のDNAを定量しました。これらの細胞株では、細胞あたりのdsDNAの平均濃度がわかっているため、定量されたDNAからサンプルあたりの細胞数を導き出すことができました(図8B)。
DNA定量では、細胞生存率評価よりも生物学的複製間のばらつきが大きくなりましたが、一般的には各時点で増加し、14日目に最高レベルが定量されました。IMR32細胞は、DNA濃度で示されているように、Coll-I-nHAスキャフォールド上でKellyLuc細胞よりも高い細胞数に達するようです。次に、2つの細胞株について各密度を個別に評価し、各時点にわたる減少を比較しました。テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析を実施して、時点間の減少の有意差を検出しました(図8B)。
細胞株とすべての播種密度の両方について、1日目と14日目を比較すると、播種密度4(1 × 105 細胞/足場)のKellyLucを除いて、細胞数に有意な増加(<P0.05)が見られ、どの時点でも有意な増加は見られませんでした。細胞生存率の結果と同様に、7日間隔(1日目と7日目、7日目と14日目)を評価した場合、すべての症例で増加が有意であったわけではありません。細胞生存率とDNA定量の時点の傾向を比較すると、2つの分析の間に若干の違いがありました。しかし、全体的には同様の傾向が観察され、ほとんどの密度で7日間隔で平均値が増加しました。これは、複数の方法を用いて細胞増殖をモニタリングすることの重要性を示しています。
次に、足場上の細胞増殖形態と分布の目視評価を実施し、従来のヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色、およびIHCを網羅しました。個々の細胞株の異なる増殖パターンは、足場への浸透度の違いや細胞のクラスタリングなど、足場上のさまざまな空間配置につながると予想されます。足場をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、5 mmの切片に切断し(図9A)、組織学的染色やIHCなどの複数の可視化技術のために足場を準備しました。
1日目、7日目、14日目にコラーゲンベースの足場で増殖したKelly、KellyCis83、およびIMR32細胞にルーチンH&E染色を適用しました(図9B)。これにより、2つのコラーゲンベースの足場上の細胞の空間配向を14日間にわたって可視化することができました。シスプラチン感受性Kelly細胞および耐性KellyCis83細胞を、Coll-I-nHA足場(図9B、i)とColl-I-GAG足場(図9B、ii)の両方で増殖させました。以前に発表されたデータと一致して、KellyCis83細胞は、侵襲性の低いKelly細胞株よりも高い速度で増殖し、両方の足場組成物に深く浸透しました。Coll-I-nHAで増殖した別の神経芽腫細胞株IMR32のH&E染色は、対照的な増殖パターンを示しています(図9B、iii)。この細胞株は、14日間にわたってコラーゲン足場上に大きく密集したクラスターで増殖しました。明視野共焦点顕微鏡は、コラーゲン繊維の自家蛍光によるコラーゲンベースの足場の多孔質構造を可視化するために使用できます(図9C)。
細胞骨格アクチンを標的とするファロイジンと核対比染色剤である4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で細胞を染色し、実験タイムライン全体にわたって特定の細胞形質をモニターしました。この手法を用いて、Coll-I-GAGスキャフォールド上のKellyおよびKellyCis83細胞に豊富なアクチンが観察されました(図9D)。これらの結果は、このプロトコルを使用して足場上で増殖した神経芽腫細胞から空間的に分解された情報を得るために、複数のイメージング技術をどのように使用できるかを示しています。一定期間におけるコラーゲンベースの足場上の細胞増殖パターンの特性評価は、下流の生化学的アッセイの理解と解釈を改善します。
コラーゲンベースの足場で増殖した細胞によるタンパク質発現を解析して、細胞活性を in vivo シナリオと比較することができます。以前に発表されたデータでは、細胞単層で増殖したKellyLuc細胞およびKellyCis83Luc細胞、ならびにColl-I-nHAおよびColl-I-GAGスキャフォールド上で、神経芽細胞腫の代理分泌マーカーとしてのクロモグラニンA(CgA)の発現を調べました(図10)。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて、コンディショニング培地中の CgA を評価しました(図 10A)。CgAは、より侵攻性の化学療法抵抗性KellyCis83細胞株では、Kellyよりも高い速度で分泌されます(図10B、C)。これは、Coll-I-GAGおよびColl-I-nHAスキャフォールド(P<0.05)の両方で7日目に有意であったが、従来の2D培養で単層として増殖した細胞では、この時点で有意差は認められなかった。
また、これらの結果は、単層で細胞を増殖させる場合、細胞がコンフルエントに達するまでにわずか7日間の増殖しか実行できないという、実験のタイムラインが限られていることも浮き彫りにしています。足場上での細胞の増殖は、より生理学的に適切な条件でより長い期間にわたって維持できるため、この制限を克服します。細胞生存率、DNA含量、細胞形態および空間配置、および発現プロファイルに関する情報を取得するための上記の技術の組み合わせは、さまざまなコラーゲンベースの足場における神経芽腫細胞の増殖の評価を容易にします。また、このプロトコルは、特定の実験要件や目的のアプリケーションを満たすように簡単に適合させることができます。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig06.jpg"> 図6:細胞生存率分析。 (A)比色細胞生存率アッセイを使用して、コラーゲンベースの足場上の神経芽腫細胞の生存率を測定するための一般的な手順。インキュベーション期間は、メーカーのガイドラインを参照して、新しい細胞株ごとに最適化する必要があります。(B)1日目、7日目、14日目に測定した、4つの異なる初期播種密度でColl-I-nHAスキャフォールド上で増殖したKellyLucおよびIMR32細胞による細胞生存率試薬の減少率。サンプルは、標準偏差を表すエラーバーを使用して生物学的に3回評価されました。略語:nHA =ナノヒドロキシアパタイト;Coll-I-nHA = nHAを添加したコラーゲン足場。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig07.jpg"> 図7:Coll-I-nHAで増殖した細胞の播種密度による細胞生存率(14日間)。 (A)ケリーリュック;(B)IMR32。タイトル付きセル番号は、0日目のスキャフォールド上の初期セル播種密度を示します。サンプルは生物学的に三重で評価され、三重点で示され、棒は平均を表しています。多重比較による一元配置分散分析を使用して、グラフに示されている3つの時点における細胞生存率試薬の減少率の有意差を検出しました(ns P > 0.05、* P ≤ 0.05、** P ≤ 0.01、*** P ≤ 0.001、**** P ≤ 0.0001)。略語:nHA =ナノヒドロキシアパタイト;Coll-I-nHA = nHAを添加したコラーゲン足場。ANOVA = 分散分析ns = 有意ではない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig08.jpg"> 図8:足場内の細胞から抽出したDNAの定量。 (A)蛍光dsDNA染色を用いて、コラーゲンベースの足場上で増殖した細胞のdsDNAを定量するプロセス。(B)Coll-I-nHAで14日間培養したKellyLucおよびIMR32細胞の播種密度によるDNA定量分析からの細胞数。タイトルの付いた細胞番号は、0日目の足場への初期細胞播種密度を示す。サンプルは生物学的に三重で評価され、三重点で示され、棒は平均を表しています。多重比較による一元配置分散分析を使用して、グラフに示された3つの時点における細胞数の有意差を検出しました(ns P > 0.05、* P ≤ 0.05、** P ≤ 0.01、*** P ≤ 0.001、**** P ≤ 0.0001)。略語:nHA =ナノヒドロキシアパタイト;Coll-I-nHA = nHAを添加したコラーゲン足場。dsDNA = 二本鎖DNA;TE = トリス-EDTA;ANOVA = 分散分析ns = 有意ではない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig09.jpg"> 図9:足場の免疫組織化学分析のための組織処理ステップ 。 (A)画像解析用の足場を処理するためのプロトコルの概略図。このプロセスにより、一次抗体と蛍光標識二次抗体を用いたルーチンの組織学的染色と特異的抗体プロービングが可能になります。(B)H&E染色した3つの神経芽腫細胞株の代表的な画像。H&E画像は、実験の経時的な成長パターンを監視するために、1日目、7日目、14日目に撮影されます。スケールバー = 200 μm。破線の四角形は、左下端の 20 倍画像にズームインするために選択された領域を表します。スケールバー = 20 μm。 (i および ii) 2 種類のコラーゲンベースの足場上の Kelly および KellyCis83 神経芽腫細胞株 (それぞれ上段と下段) の H&E。(iii)IMR32細胞株のH&E、Coll-I-nHAスキャフォールド上のクラスター化された細胞増殖を表す。(C)明視野共焦点顕微鏡にかけたKelly細胞株の代表画像。コラーゲン自家蛍光により、多孔質の足場を可視化することができます。10倍スケールバー = 200 μm、20倍スケールバー = 20 μm。 (D)埋め込みスキャフォールドの代表画像と、ファロイジンとDAPIを用いたIHCによる分析を10倍倍の倍率で行ったもの、スケールバー=200μm。内側の小さい正方形は拡大画像(20倍)を表し、スケールバー = 20 μm。略語:nHA =ナノヒドロキシアパタイト;Coll-I-nHA = nHAを添加したコラーゲン足場。GAG = グリコサミノグリカン;Coll-I-GAG = コンドロイチン-6-硫酸を添加したコラーゲン足場。H&E = ヘマトキシリンおよびエオシン;IHC = 免疫組織化学;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig10.jpg"> 図10:3Dコラーゲンベースの足場で増殖した神経芽腫細胞によるタンパク質発現と2Dプラスチックの比較 。 (A)2Dプラスチックまたは3Dコラーゲンベースの足場で増殖した細胞の馴化培地でCgA ELISAをどのように実施したかの概略図。(B)2Dプラスチック単分子膜上で増殖した細胞の馴化培地から採取したCgAタンパク質発現レベル。細胞は7日後にコンフルエントに達したため、14日の時点は読み取れませんでした。プラスチックの7日目までに、Kelly細胞株とKellyCis83細胞株の間でCgAレベルに有意差はありませんでした。(C)コラーゲンベースの足場で増殖した細胞の馴化培地を用いて14日間連続して実施したCgA ELISA。7日目には、両方のコラーゲン足場において、より攻撃的なKellyCis83細胞株でCgAレベルが高く、2D単層と比較して3DマトリックスのCgAの生理学的関連性レベルがより高くなっています。この図は Curtin et al.17 から修正されたものです。略語:3D =3次元。2D = 2次元。CgA = クロモグラニン A;ELISA = 酵素結合免疫吸着アッセイ;nHA =ナノヒドロキシアパタイト;Coll-I-nHA = nHAを添加したコラーゲン足場。GAG = グリコサミノグリカン;Coll-I-GAG = コンドロイチン-6-硫酸を添加したコラーゲン足場。TMB = 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン;HRP = 西洋ワサビペルオキシダーゼ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

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Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

この論文では、神経芽腫細胞株を以前に説明した3次元コラーゲンベースの足場に播種し、所定の時間枠で細胞増殖を維持し、さまざまな実験目的を満たすために適応可能な、いくつかの細胞増殖および細胞挙動分析およびダウンストリームアプリケーション用の足場を回収するために必要な手順をリストしています。

コラーゲンベースの足場を用いた神経芽細胞腫の3次元 in vitro 生体模倣モデル

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

私たちのプロトコルは、天然組織に密接に影響を与える3Dバイオエンジニアリングモデルを提供します。これは、神経芽細胞腫の治療と診断のための新しい治療法とバイオマーカーの発見に利用できる可能性があります。主な利点は、バッチ間の一貫性を実現する再現性のある技術を使用して腫瘍微小環境を研究するために、より生理学的に関連する実験条件を作成することです。私たちの足場法は、第一に神経芽細胞腫の新規治療法を特定するために利用することができ、第二に、個々の患者の反応をより正確に予測するために患者由来の細胞を組み込むために利用することができます。まず、PBSに保存されている足場を層流フードに入れます。滅菌ピンセットを使用して足場をコーナーからそっと持ち上げ、側壁を押して余分なPBSを取り除きます。次に、光沢のある層を下に向けて、非接着性の24ウェルプレートのウェルの中央に足場を置きます。プレートに細胞株、播種密度、および時点の詳細をラベル付けします。一度に1つの播種密度の細胞を操作し、残りの細胞をインキュベーター内で37°Cに保ちます。足場への細胞付着については、滅菌チップ付きのP20ピペットを使用して細胞懸濁液を完全に混合し、各足場の中央に20マイクロリットルの関連する細胞懸濁液を加えて、細胞懸濁液がウェルの側壁や底部ではなく、足場の上に残るようにします。細胞を3〜5時間、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%で3〜5時間付着させます。インキュベーションの最後に、P1000ピペットを使用して、足場のずれを防ぐために、予熱した増殖培地1ミリリットルを各ウェルにゆっくりと加え、プレートを一晩インキュベートします。最初は、2〜3日ごとに足場を観察し、細胞が足場内で増殖するにつれて増殖培地の色が変化します。スローモードの10ミリリットルのピペットガンを使用して、使用済みの培地1ミリリットルをウェルから取り出して廃棄します。馴化培地を実験に使用する場合は、使用済みの培地を15ミリリットルの遠心チューブに回収し、遠心分離によって細胞破片をペレット化します。上澄み液を新しいチューブに移し、マイナス80°Cで保管します。ピペットガンをドリップモードにした後、2ミリリットルの予熱した増殖培地を足場にそっと加えます。骨格含有プレートをインキュベートし、示されているように、所望の増殖期間の間、新鮮な培地を補充する。層流フードで、0.2マイクロメートルの滅菌フィルターを遠心分離管にろ過することにより、適切な細胞生存率アッセイ試薬を滅菌します。滅菌溶液、完全増殖培地、および滅菌PBSをウォーターバスで摂氏37度に予熱します。滅菌ピンセットを使用して、分析する足場を新しい24ウェルプレートに移し、関連するすべての詳細をプレートにラベル付けします。予熱した増殖培地900マイクロリットルを各ウェルに加える。次に、100マイクロリットルの無菌細胞生存率試薬を各ウェルに加えます。ネガティブコントロールの場合は、900マイクロリットルの培地と100マイクロリットルの無菌細胞生存率試薬を足場のないウェルに加えます。プレートの蓋を元に戻し、プレートを約3分間静かに揺らして、希釈した細胞生存率試薬をウェル全体に分配します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%でインキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出した後、プレートを数秒間静かに揺らし、テキスト原稿に示されているようにトリプリケートを生成します。100マイクロリットルのインキュベート培地と試薬を24ウェルプレートの1ウェルから半透明の96ウェルプレートの1ウェルに移し替えてテクニカルトリプリケートを生成し、このステップを1ウェルに対して合計3回実行します。96ウェルプレートをアルミホイルで覆い、細胞生存率試薬を光から保護します。残りの700マイクロリットルの培地と試薬を24ウェルプレートの足場から取り出し、廃棄します。各足場を1ミリリットルの滅菌PBSで2回洗浄します。マイクロプレートリーダーを使用して、570ナノメートルと600ナノメートルの吸光度を測定し、メーカーの推奨に従って細胞生存率試薬の減少率を計算します。適切なソフトウェアを使用して、細胞生存率の結果を統計的に解析します。生物学的三重値を入力してエラーバーを生成し、アッセイのばらつきを示します。適切な生物統計学的ソフトウェアを使用して、実験期間における細胞生存率の変化を調べるために、一元配置分散検定を実行します。テキスト原稿に記載されているように、グラフ上の時点間の有意差を示します。足場上で増殖させた2つの神経芽腫細胞株、KellyLucおよびIMR32の生存率を評価した。細胞密度の増加により、時間の経過とともに細胞生存率試薬がさらに減少しました。足場から抽出したDNAを定量することで、足場上の細胞増殖を間接的に測定し、サンプルあたりの細胞数を算出した。IMR32細胞は時間の経過とともに増殖が増加し、次にKellyLuc細胞が増加しました。足場上の細胞の増殖形態と分布は、ヘマトキシリン、エオシン、および免疫組織化学染色によって視覚的に評価されました。KellyCis83細胞は、侵襲性の低いKelly細胞株よりも速く成長し、両方の足場組成物に深く浸透しました。ナノハイドロキシアパタイト上に成長したIMR32は、14日間にわたって、大きくて密集したクラスターと対照的な成長パターンを示しました。細胞特異的な形質は、免疫組織化学染色、続いてファロイジンおよびDAPI染色によってモニターされ、コラーゲン-グリコサミノグリカンスキャフォールド上のKellyおよびKellyCis83細胞でアクチンの存在量が観察されました。in vitroでの細胞活性評価では、クロモグラニンAの分泌レベルを測定し、コラーゲン-グリコサミノグリカンおよびコラーゲンナノハイドロキシアパタイト足場で増殖した細胞は、従来の2D培養で増殖した細胞と比較して、より多くのクロモグラニンAを産生しました。化学療法抵抗性のKellyCis83細胞株は、Kelly細胞株よりも多くのクロモグラニンAを分泌しました。細胞接着後、細胞は様々な治療薬で処理することができる。これにより、従来の2D培養よりも、薬物に対する細胞の反応について、より生理学的に関連性のある結果が得られます。この技術により、研究者は、がん細胞が腫瘍微小環境内でどのように振る舞い、刺激に反応するか(治療への反応や他の細胞タイプとの相互作用など)をよりよく調べることができます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...