Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Children's Research Center (NCRC), Irish Research Council (IRC) og Neuroblastoma UK. Illustrasjonene ble laget ved hjelp av BioRender.

<ol>
	<li>Davidoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).</li><li>Matthay, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).</li><li>Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+the+3D+microenvironment+on+cancer+cell+behaviour+and+treatment+responsiveness:+a+recent+update+on+lung,+breast+and+prostate+cancer+models.">Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models.</a> Acta Biomaterialia. , (2021).</li><li>Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+the+genes,+the+tumor+microenvironment+in+neuroblastoma.">More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma.</a> Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).</li><li>Walker, C., Mojares, E., Del R&#237;o Hern&#225;ndez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+matrix+in+development+and+cancer+progression.">Role of extracellular matrix in development and cancer progression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).</li><li>Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+extracellular+matrix+direct+gene+expression.">How does the extracellular matrix direct gene expression.</a> Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).</li><li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reciprocity+in+the+wound+microenvironment.">Dynamic reciprocity in the wound microenvironment.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Medicine. 6, 11 (2008).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Medicine. 4, 38 (2006).</li><li>Ouellette, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+collagen+jungle:+The+biomedical+potential+of+fiber+organization+in+cancer.">Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer.</a> Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Hume, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell+invasiveness+and+response+to+chemotherapeutics+in+adipocyte+invested+3D+engineered+anisotropic+collagen+scaffolds.">Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).</li><li>Fitzgerald, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+collagen-based+scaffolds+to+simulate+prostate+cancer+bone+metastases+with+potential+for+evaluating+delivery+of+nanoparticulate+gene+therapeutics.">The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics.</a> Biomaterials. 66, 53-66 (2015).</li><li>Sapudom, J., Pompe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+tumor+microenvironments+based+on+collagen+matrices.">Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices.</a> Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).</li><li>Curtin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+relevant+3D+collagen-based+scaffold-neuroblastoma+cell+system+exhibits+chemosensitivity+similar+to+orthotopic+xenograft+models.">A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models.</a> Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).</li><li>Gavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+invasion+strategies+are+regulated+by+the+extracellular+matrix.">Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix.</a> Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).</li><li>Casal, e. J., Crane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry, Glycosaminoglycans. , (2019).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+freezing+rate+on+pore+structure+in+freeze-dried+collagen-GAG+scaffolds.">Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).</li><li>Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinking+and+mechanical+properties+significantly+influence+cell+attachment,+proliferation,+and+migration+within+collagen+glycosaminoglycan+scaffolds.">Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).</li><li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment,+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).</li><li>Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+dehydrothermal+treatment+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).</li><li>Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nanohydroxyapatite+nanocomposites+for+bone+tissue+engineering.">Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering.</a> ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).</li><li>Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterisation+of+a+collagen+nano-hydroxyapatite+composite+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering.</a> Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+hydroxyapatite+incorporation+methods+on+the+structural+and+biological+properties+of+porous+collagen+scaffolds+for+bone+repair.">Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).</li><li>Tierney, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+collagen+concentration+and+crosslink+density+on+the+biological,+structural+and+mechanical+properties+of+collagen-GAG+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).</li><li>Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteomimicry+of+mammary+adenocarcinoma+cells+in+vitro;+increased+expression+of+bone+matrix+proteins+and+proliferation+within+a+3D+collagen+environment.">Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment.</a> PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).</li><li>Nolan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+neuroblastoma:+advances+and+challenges.">Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges.</a> Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).</li><li>Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+cell+responses+in+threedimensional+conductive+collagen+gel+scaffolds+with+conductive+polymer+nanofibres+for+tissue+regeneration.">Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration.</a> Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).</li><li>Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+analyze+three-dimensional+cell+distribution+and+infiltration+in+degradable+scaffolds.">Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).</li><li>do Amaral, R. J. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalising+collagen-based+scaffolds+with+platelet-rich+plasma+for+enhanced+skin+wound+healing+potential.">Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).</li><li>Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogranin+A+as+a+valid+marker+in+oncology:+Clinical+application+or+false+hopes.">Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes.</a> World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).</li><li>O'Brien, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+permeability+and+cell+attachment+in+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering.">The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).</li></ol>

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

3D-stillas-kreftcellemodellen har vist seg å være et verdifullt og allsidig verktøy for å få mekanistisk innsikt i nevroblastomcellevekst, levedyktighet og infiltrasjon av celler i en forenklet TME32. 3D-neuroblastommodellen beskrevet her etterligner minimal TME og gir mer fysiologisk relevante data enn en 2D monolagskultur. En stor ulempe med 3D-cellekultur er økt eksperimentell kompleksitet og lengre tidsrammer. Beskrevet her er en optimalisert protokoll for såing, vekst og vedlikehold av neuroblastomceller på kollagenbaserte stillaser etterfulgt av nedstrøms analyser og applikasjoner, noe som gir robust karakterisering av cellevekst. Vi hadde som mål å få innsikt i den optimale cellesåtettheten for stillasene for å skape et forutsigbart og kontrollerbart miljø for å vurdere behandling mot kreft i et raskt 14-dagers eksperimentelt vindu. Kombinasjonen av alle disse beskrevne enkle protokollene gir en godt avrundet vurdering av nevroblastomcellevekst i stillasbasert in vitro-kultursystem .
De kritiske punktene i protokolloppsettet har blitt vektlagt for å tillate forskere å etablere det samme i sine laboratorier raskt. For eksempel tillater de angitte inkubasjonstidene for bedre ytelse av den kolorimetriske cellelevedyktighetsanalysen dypere penetrasjon av reagenset i stillasporene for å nå alle celler. Dessuten er den fluorescerende dsDNA-fargeteknikken robust og grei; DNA-frigjøring fra stillasene krever imidlertid kraftig cellelyse da cellene er "fanget" i kollagenfibre.
Ved hjelp av den enkle DNA-kvantifiseringsanalysen som er beskrevet, kan vi identifisere loggvekstfasen på kollagenbaserte stillaser for screening av kreftmedisiner ved hjelp av denne modellen. I den beskrevne eksperimentelle settingen ble 4 innledende cellesåingstettheter brukt med en samlet 14-dagers periode og analysetidspunkter på dag 1, 7 og 14. Vi identifiserte at KellyLuc-celler sådd ved 4 × 105 celler/stillas har det mest signifikante aktive spredningsvinduet mellom dag 7 og 14. Disse loggfasevekstdataene vil muliggjøre pålitelig tolkning av forskjellige cellecytotoksisitetseksperimenter. Det eliminerer spekulasjoner om enhver nedgang i vekst eller celledød som følge av undertrykt vekst på den porøse 3D-plattformen i stedet for fra legemiddeltoksisitet. Cell levedyktighet er også en mye brukt vurdering for egnetheten til 3D-plattformer for å støtte veksten av forskjellige celletyper33,34. Mens det er mange analyser for å måle cellenes levedyktighet, inkludert levende / død farging, ATP-måling, spredningsanalyser, fant vi bruken av Alamar Blue kolorimetrisk celle levedyktighetsanalyse for å være en enkel og effektiv teknikk for å støtte DNA-kvantifiseringsdata.
Den kombinerte bruken av DNA-kvantifisering og celle levedyktighet ga komplementære bevis på at den optimale tettheten til frøceller på stillaset for å oppnå fortsatt vekst over en 14-dagers periode i gjennomsnitt er 2-4 × 105 celler / stillas. Denne protokollen kan imidlertid enkelt tilpasses for å tilfredsstille forskjellige eksperimentelle tidsrammer, analysetidspunkter og nedstrømsapplikasjoner. Selv om denne protokollen beskriver evalueringen av monokulturcellevekst av neuroblastomceller på stillas, er stillasene lett å endre for bruk som en plattform for samkultur, beskrevet av Amaral et al., som benyttet kollagen-GAG-stillas til å dyrke keratinocytter og fibroblaster i en undersøkelse av sårheling35.
Den beskrevne 3D-modellen muliggjør visualisering av cellevekst og infiltrasjon ved hjelp av forskjellige kjente teknikker, for eksempel immunfluorescens og standard H&E. Det er viktig å visualisere cellene sammen med karakterisering av vekst ved hjelp av biokjemiske analyser på grunn av mangfoldet av cellemorfologi og vekstmønstre på stillas. Å forstå vekstmønsteret kan gi innsikt i vekstatferd og fremtidig respons på kreftmedisiner. For eksempel gir IMR32-vekst ved hjelp av DNA-kvantifisering lignende mønstre som Kelly, men ved visualisering ved hjelp av H&E vokser IMR32 i større klynger enn Kelly, som viste mer spredt vekst (figur 9). Disse varierte vekstmønstrene av cellelinjer i stillas gjenspeiler det kliniske scenariet for tumorheterogenitet. Undersøkelse av legemiddelrespons mot kreft ved hjelp av et panel av cellelinjer med ulik morfologi i 3D-stillas vil øke den prediktive verdien for pasientrespons på de samme legemidlene.
Deteksjon av gen- eller proteinuttrykk kan også utføres ved hjelp av andre tilnærminger som RT-qPCR eller ELISA hvis proteinet av interesse utskilles. En surrogatmarkør for nevroblastomprogresjon, kromogranin A (CgA)36, ble brukt til å i tillegg karakterisere nevroblastomcellevekst i 3D. Som beskrevet i tidligere arbeid17, økte CgA-sekresjonen etter hvert som cellene prolifererte (figur 10). Mens monolags cellekultur ikke kunne fange denne økningen, da spredning betydde at celler nådde full samløp i kulturskålene, tillot bruken av 3D-kollagenstillasene langvarig vurdering av CgA-sekresjon.
Denne 3D in vitro-modellen er kanskje ikke egnet for alle forskningsspørsmål for å studere neuroblastombiologi og respons på terapi. En av begrensningene er ujevn cellepenetrasjon i stillas og dannelse av celleklynger av varierende størrelse, som avhenger av en gitt cellelinje og kan føre til ukontrollerbar diffusjon av næringsstoffer og testmedisiner. Denne funksjonen påvirker robustheten i terapeutisk screening. Til tross for denne begrensningen er det imidlertid viktig å vurdere at innfødte svulster også er heterogene i størrelse og kreftcellefordeling og inneholder mange andre celletyper i tumorvevet. For å overvinne denne begrensningen foreslår vi bruk av hvert cellebefolket stillas som et enkelt mikrovev for hvilket følgende parametere vil bli optimalisert: (a) inkubasjonstider for cellens levedyktighetsreagens for å nå cellene og celleklyngene, og (b) lysering av cellene i Triton X-100-buffer ved forbehandling av celler på stillaser med en vevslyser for å frigjøre DNA fra cellene som finnes dypt i stillaset.
En annen teknisk begrensning av denne protokollen er mangelen på mekanisk testing av hver batch av nyproduserte stillaser for denne modellen. Bruk av stillasets robuste produksjonsprosess, som har blitt omfattende karakterisert i forhold til fysiske og kjemiske egenskaper til stillasene, som kompresjons- og strekkmodul, porøsitet og visuell porestruktur og homogenitet, sikrer imidlertid at stillasegenskapene opprettholdes gjennom partiene 21,24,27,30,37.
Oppsummert presenterer denne artikkelen en rekke enkle metoder for analyse av cellulær vekst på kollagenbaserte stillas. Både den eksperimentelle tidslinjen og analysepunktene kan byttes ut avhengig av de spesifikke forskningsspørsmålene. Denne protokollen kan også tilpasses andre celletyper. Resultatene vist ovenfor gir bevis på hvordan denne sammenstillingen av metoder ga innsikt i den optimale såtettheten for forskjellige neuroblastomcellelinjer for å skape kontinuerlig vekst over 14 dager. Sammenslåingen av resultater oppnådd fra alle metodene i denne protokollen gir en overlegen forståelse av cellevekst i 3D-kollagenmatrisen. Fremtidig utnyttelse av denne modellen vil trolig innebære kokultursystemer som er spesifikke for neuroblastom TME og testing av ulike nye kreftmedisiner.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

Neuroblastom er en pediatrisk kreft i det sympatiske nervesystemet som oppstår under embryonisk utvikling eller tidlig postnatalt liv på grunn av transformasjon av nevrale kamceller1. Det er den vanligste solide ekstrakranielle svulsten hos barn, som representerer 8% av malignitetene diagnostisert hos pasienter under 15 år, og er ansvarlig for 15% av alle dødsfall i barndomskreft. Sykdommen viser svært heterogen klinisk atferd på grunn av spesifikke kromosomale, genetiske og epigenetiske endringer og histopatologiske egenskaper.
Disse endringene bidrar til aggressiviteten til neuroblastom og dårlige resultater hos pediatriske pasienter. Derfor viser dagens behandlinger seg å være ineffektive på lang sikt for nesten 80% av pasientene med den klinisk aggressive sykdommen2, noe som understreker det faktum at behandling for denne gruppen pasienter fortsatt er utfordrende. Dette skyldes sannsynligvis at mekanismene for neuroblastom, heterogenitet og metastaser fortsatt ikke er fullt ut forstått. Imidlertid er tumormikromiljøet (TME) nå allment antatt å spille en rolle i utviklingen av mange kreftformer; Likevel er det fortsatt understudert i neuroblastom 3,4.
Den opprinnelige TME er et komplekst 3D-mikromiljø som involverer kreft- og ikke-kreftceller omgitt av en ECM. ECM refererer til den acellulære komponenten i et vev som gir strukturell og biokjemisk støtte til sine cellulære beboere og bidrar til sykdomsprogresjon, pasientprognose og terapeutisk respons5. Denne fremmelsen av sykdomsprogresjon skyldes "dynamisk gjensidighet" eller pågående toveis kommunikasjon mellom celler og ECM 6,7,8. Etter hvert som kreft utvikler seg, blir stromalkollagen omorganisert ofte i lineære mønstre vinkelrett på stroma-kreftgrensesnittet, som kreftceller bruker som en migrerende rute til metastase 9,10,11.
Hovedkomponentene i dette opprinnelige funksjonelle biologiske stillaset inkluderer et fibrøst nettverk av kollagen type I og II og andre proteiner, inkludert elastin, glykoproteiner som laminin, samt en rekke proteoglykaner og andre løselige komponenter12,13. Disse proteinene fra den opprinnelige ECM har nå blitt attraktive naturlige biomolekyler for å utvikle 3D in vitro-modeller 3. Anvendelsen av 3D-stillas for in vitro cellekultur øker i popularitet på grunn av sin større fysiologiske representasjon av TME sammenlignet med tradisjonell 2D monolagskultur. De produserte 3D-stillasene hjelper cellefeste, spredning, migrasjon, metabolisme og respons på stimuli sett i in vivo biologiske systemer.
Hovedkomponenten i disse 3D-stillasene er kollagen, som er en nøkkelspiller i mange normale biologiske prosesser, inkludert vevsreparasjon, angiogenese, vevsmorfogenese, celleadhesjon og migrasjon11. Kollagenbaserte 3D-matriser har vist sin robuste funksjonalitet for å modellere ECM, og fungerer som et in vitro biomimetisk mikromiljø samtidig som det muliggjør celle-ECM-interaksjoner samt cellemigrasjon og invasjon. Disse 3D-matrisene gir også en mer nøyaktig analyse av cellerespons på kjemoterapeutiske legemidler enn tradisjonell 2D eller "flat" kultur i mange kreftmodeller 14,15,16, inkludert neuroblastom 17,18. Genetisk analyse av 3D-cellekulturer har rapportert en høyere korrelasjon med den menneskelige vevsprofilen selv sammenlignet med dyremodeller19. Samlet sett er hjørnesteinen i disse 3D-stillasene å gi cellene et egnet in vitro-miljø, som rekapitulerer den opprinnelige vevsarkitekturen og muliggjør toveis molekylær crosstalk8.
For å øke kompleksiteten til kollagenbaserte modeller, er andre vanlige ECM-komponenter innlemmet i vevsteknikkprosessen, og skaper dermed mer fysiologisk relevante modeller for å gjenspeile nisje-TME i forskjellige vev. For eksempel letter GAGs, negativt ladede polysakkarider som finnes i alle pattedyrvev20, cellevedlegg, migrasjon, spredning og differensiering. Chondroitinsulfat er en spesifikk type GAG som finnes i bein og brusk, som tidligere har blitt brukt i vevstekniske applikasjoner for beinreparasjon 21,22,23,24,25. Nanohydroksyapatitt (nHA) er den viktigste uorganiske bestanddelen av mineralsammensetningen av humant beinvev, som utgjør opptil 65 vekt% bein26 og brukes derfor mye til beinutskifting og regenerering27. Dermed er GAGs og nHA attraktive kompositter for å rekonstruere det primære neuroblastomet ECM og modellere de vanligste metastatiske stedene for neuroblastom, benmarg (70,5%) og bein (55,7%)28.
Stillas som inneholder disse ECM-komponentene ble opprinnelig utviklet for beinvevstekniske applikasjoner med omfattende analyse av deres biokompatibilitet, toksisitet og osteoledende og osteoinduktive egenskaper29,30. De er porøse, kollagenbaserte matriser produsert ved hjelp av frysetørkingsteknikker for å kontrollere deres fysiske og biologiske egenskaper. Kollagenstillasene supplert med enten nHA (Coll-I-nHA) eller kondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG) viste suksess i å etterligne den primære TME i brystkreft31 og metastase til bein i prostatakreft15 samt neuroblastom17. Frysetørkingsteknikken som brukes til å produsere disse sammensatte stillasene gir reproduserbar homogenitet i porestørrelse og porøsitet i stillasene22,23,24. Kort fortalt fremstilles en kollagenoppslemming (0,5 vekt%) ved å blande fibrillært kollagen med 0,05 M eddiksyre. For Coll-I-GAG tilsettes 0,05 vekt% av krondoitin-6-sulfat isolert fra haibrusk til kollagenoppslemmingen mens den blandes. For de sammensatte Coll-I-nHA-stillasene syntetiseres hydroksyapatitt partikler i nanostørrelse som tidligere beskrevet27 og tilsettes kollagenoppslemmingen i forholdet 2: 1 til vekten av kollagenet under blandingsprosessen. Alle stillas er fysisk tverrbundet og sterilisert ved hjelp av en dehydrotermisk behandling ved 105 °C i 24 timerog 25. Sylindriske stillaser (6 mm diameter, 4 mm høyde) oppnås ved hjelp av en biopsistans og kan kjemisk kryssbindes med 3 mM N-(3-dimetylaminopropyl)-N'-etylkarbodiimidhydroklorid og 5,5 mM N-hydroksysuccinimid (EDAC / NHS) i destillert vann (dH2O) for å forbedre de mekaniske egenskapene til konstruksjonene30. Denne veloptimaliserte produksjonsprosessen av to kollagenstillas skaper stillas med reproduserbare mekaniske egenskaper, inkludert porestørrelse, porøsitet og stivhet (kPa). Både Coll-I-GAG og Coll-I-nHA stillas har varierende fysiske egenskaper, noe som skaper forskjellige miljøforhold. Egenskapene til hvert stillas er vist i tabell 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Coll-I-GAG</td>
			<td>Coll-I-nHA</td>
		</tr><tr><td>Stillas størrelse (diameter [mm] x høyde [mm])</td>
			<td>6 x 4 17</td>
			<td>6 x 4 17</td>
		</tr><tr><td>Kollagenkonsentrasjon (vekt%)</td>
			<td>0,5 17</td>
			<td>0,5 17</td>
		</tr><tr><td>Substratkonsentrasjon (vekt%) [Basert på vekten av kollagen]</td>
			<td>0,05 15,17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>Gjennomsnittlig porestørrelse (mm)</td>
			<td>96 22</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>Porøsitet (%)</td>
			<td>99,5 23</td>
			<td>98,9 til 99,4 27</td>
		</tr><tr><td>Stivhet (kPa)</td>
			<td>1.5 27</td>
			<td>5,5 til 8,63 29</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Oversikt over de mekaniske egenskapene til de to stillasene som er tatt i bruk for å studere nevroblastombiologi.
Dette papiret beskriver en protokoll for montering av et 3D-stillasbasert system for bedre å etterligne neuroblastommikromiljøet ved hjelp av neuroblastomcellelinjer og tidligere beskrevne kollagenbaserte stillaser supplert med enten nHA (Coll-I-nHA) eller kondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG). Protokollen inkluderer nedstrømsmetoder for å analysere vekstmekanismene til neuroblastomcellene i et mer fysiologisk relevant miljø ved hjelp av tidligere optimaliserte billige metoder tilpasset 2D monolagskultur Figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> Figur 1: Samlet protokollarbeidsflyt. (A) Celler dyrkes til tilstrekkelig antall, splittes, telles og resuspenderes i et passende volum av medium. (B) Denne cellemassen gjennomgår deretter seriefortynning for å fremstille totalt 4 cellesuspensjoner med forskjellige tettheter. (C) Kollagenbaserte stillaser er sterilt belagt i ikke-klebende 24-brønnsplater, og (D) 20 μL cellesuspensjon tilsettes midten av hvert stillas og får inkubere ved 37 °C, 5% CO2 og 95% fuktighet i 3-5 timer. (E) Komplett vekstmedium (1 ml) tilsettes deretter sakte til hvert stillas, og platene plasseres tilbake i inkubatoren for å tillate cellevekst i ønsket tidsramme. (F) Ved hvert forhåndsbestemt tidspunkt hentes flere stillas for celle levedyktighet og vekstvurdering, genuttrykksanalyse og histologisk farging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

Neuroblastom er den vanligste ekstrakranielle solide svulsten hos barn, og står for 15% av de totale dødsfallene i barnekreft. Det opprinnelige tumorvevet er et komplekst tredimensjonalt (3D) mikromiljø som involverer lag av kreft- og ikke-kreftceller omgitt av en ekstracellulær matrise (ECM). ECM gir fysisk og biologisk støtte og bidrar til sykdomsprogresjon, pasientprognose og terapeutisk respons.
Dette papiret beskriver en protokoll for montering av et 3D-stillasbasert system for å etterligne neuroblastommikromiljøet ved hjelp av neuroblastomcellelinjer og kollagenbaserte stillas. Stillasene er supplert med enten nanohydroksyapatitt (nHA) eller glykosaminoglykaner (GAGs), naturlig funnet i høye konsentrasjoner i bein og benmarg, de vanligste metastatiske stedene for neuroblastom. Den 3D porøse strukturen til disse stillasene tillater neuroblastomcellefeste, spredning og migrasjon, og dannelsen av celleklynger. I denne 3D-matrisen reflekterer celleresponsen på terapeutika mer in vivo-situasjonen .
Det stillasbaserte kultursystemet kan opprettholde høyere celletetthet enn konvensjonell todimensjonal (2D) cellekultur. Derfor er optimaliseringsprotokoller for innledende såcellenumre avhengig av de ønskede eksperimentelle tidsrammene. Modellen overvåkes ved å vurdere cellevekst via DNA-kvantifisering, cellenes levedyktighet via metabolske analyser og cellefordeling i stillasene via histologisk farging.
Denne modellens applikasjoner inkluderer vurdering av gen- og proteinuttrykksprofiler samt cytotoksisitetstesting ved bruk av konvensjonelle legemidler og miRNA. 3D-kultursystemet muliggjør presis manipulering av celle- og ECM-komponenter, og skaper et miljø som er mer fysiologisk lik naturlig tumorvev. Derfor vil denne 3D in vitro-modellen fremme forståelsen av sykdomspatogenesen og forbedre korrelasjonen mellom resultater oppnådd in vitro, in vivo i dyremodeller og mennesker.

Den kollagenbaserte stillasmodellen beskrevet her har mange bruksområder som spenner fra å studere neuroblastombiologi til screening av kreftbehandling i et miljø som er mer fysiologisk lik innfødte svulster enn konvensjonell 2D-cellekultur. Før du tester et gitt forskningsspørsmål, er det avgjørende å oppnå en fullstendig karakterisering av cellefeste, proliferasjon og infiltrasjon innen ønsket eksperimentell tidsramme. Vekstbetingelsene vil avhenge av biologien til hver enkelt cellelinje. Det er viktig at flere metoder for vurdering av cellevekst må implementeres for å bestemme optimale forhold og robust ytelse.
Her ble levedyktigheten til nevroblastomceller dyrket på stillaser vurdert ved hjelp av en kolorimetrisk cellelevedyktighetsanalyse. Denne analysen kan utføres så ofte som ønsket gjennom hele den eksperimentelle tidsrammen. For det beskrevne eksperimentet ble det utført cellelevedyktighetsvurdering på dag 1, 7 og 14 for to neuroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på Coll-I-nHA-stillas ved 4 forskjellige tettheter (figur 6). Levedyktighet på dag 1 ble satt som en basislinje for å sammenligne alle påfølgende målinger. Reduksjonshastigheten av cellens levedyktighetsreagens reflekterer cellebiologien og vekstegenskapene til individuelle cellelinjer, inkludert deres proliferasjonshastigheter og metabolisme. En sammenheng mellom antall celler sådd på stillasene og graden av reduksjon var forventet. I dette eksperimentet økte reduksjonen av cellens levedyktighetsreagens generelt med hvert tidspunkt for begge cellelinjer ved alle tettheter, som forventet.
Hver tetthet ble deretter vurdert individuelt for begge cellelinjene for å sammenligne reduksjonen over tidspunkter. Enveis ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest ble utført for å oppdage signifikante forskjeller i reduksjon mellom tidspunkter (figur 7). For både cellelinjer og alle såtettheter var det en signifikant økning (P<0,05) i reduksjonen av cellens levedyktighetsreagens ved sammenligning av dag 1 og dag 14. Dette indikerte en signifikant økning i metabolsk aktive celler tilstede på stillasene. Denne økningen var ikke signifikant i alle tilfeller ved vurdering av 7-dagers intervaller (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14), noe som viser viktigheten av optimalisering av såtettheten for å oppnå ønsket vekstvindu.
For å støtte resultatene av cellelevedyktighetsanalysen, kan cellevekst på stillaser også måles indirekte via kvantifisering av dsDNA ekstrahert fra stillas ved hjelp av en fluorescerende dsDNA-flekk (figur 8A). Som celle levedyktighet, kan DNA-kvantifisering gjøres så ofte som ønsket innenfor den eksperimentelle tidslinjen. Imidlertid krever denne analysen fullstendig gjenfinning av stillas og avslutning av cellevekst, og må derfor tas med i eksperimentell planlegging som diskutert i avsnitt 1. For dette eksperimentet ble DNA kvantifisert på dag 1, 7 og 14 for to neuroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på Coll-I-nHA-stillas ved 4 forskjellige tettheter. Siden den gjennomsnittlige konsentrasjonen av dsDNA per celle er kjent for disse cellelinjene, var det mulig å utlede antall celler per prøve fra det kvantifiserte DNA (figur 8B).
DNA-kvantifisering ga opphav til høyere variabilitet mellom biologiske replikater enn cellelevedyktighetsvurdering, men økte generelt for hvert tidspunkt, med de høyeste nivåene kvantifisert på dag 14. IMR32-celler ser ut til å nå høyere celletall på Coll-I-nHA-stillas, som indikert ved DNA-konsentrasjon, enn KellyLuc-celler. Hver tetthet ble deretter vurdert individuelt for de to cellelinjene for å sammenligne reduksjonen over tidspunkter. Enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest ble utført for å oppdage signifikante forskjeller i reduksjon mellom tidspunkter (figur 8B).
For både cellelinjer og alle såtettheter var det en signifikant økning (P<0,05) i celletall ved sammenligning av dag 1 og dag 14, med unntak av KellyLuc ved såtetthet 4 (1 × 105 celler/stillas), som ikke ga signifikante økninger over noen av tidspunktene. I likhet med cellenes levedyktighetsresultater var økningene ikke signifikante i alle tilfeller ved vurdering av 7-dagers intervallene (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14). Ved sammenligning av tidspunkttrender for cellelevedyktighet og DNA-kvantifisering var det noen små forskjeller mellom de to analysene. Imidlertid ble generelt lignende trender observert, med gjennomsnittlige verdier som øker mellom 7-dagers intervaller for de fleste tettheter. Dette demonstrerer viktigheten av å overvåke cellevekst ved hjelp av mer enn én metode.
Deretter ble det gjennomført en visuell vurdering av cellevekstmorfologi og fordeling på stillasene, som omfattet tradisjonell hematoksylin- og eosinfarging (H&E) samt IHC. Det forventes at de forskjellige vekstmønstrene til individuelle cellelinjer vil føre til varierte romlige arrangementer på stillas, inkludert forskjellige grader av penetrasjon i stillaset og celleklynger. Stillasene ble formalinfiksert, parafininnstøpt og kuttet i 5 mm seksjoner (figur 9A), og forberedte stillasene for flere visualiseringsteknikker, inkludert histologisk farging og IHC.
Rutinemessig H&E-farging ble brukt på Kelly-, KellyCis83- og IMR32-celler dyrket på kollagenbaserte stillaser på dag 1, 7 og 14 (figur 9B). Dette tillot visualisering av cellenes romlige orientering på to kollagenbaserte stillaser over en 14-dagers periode. Cisplatinfølsomme Kelly-celler og resistente KellyCis83-celler ble dyrket på både Coll-I-nHA-stillas (figur 9B, i) og Coll-I-GAG-stillas (figur 9B, ii). I samsvar med tidligere publiserte data vokste KellyCis83-celler med høyere hastighet og infiltrerte dypere inn i begge stillassammensetningene enn den mindre invasive Kelly-cellelinjen. H&E-flekken på en annen nevroblastomcellelinje, IMR32, dyrket på Coll-I-nHA viser et kontrasterende vekstmønster (figur 9B, iii). Denne cellelinjen vokste i store, tettpakkede klynger på kollagenstillasene i løpet av 14-dagersperioden. Brightfield konfokalmikroskopi kan brukes til å visualisere den porøse arkitekturen til kollagenbaserte stillaser (figur 9C) på grunn av autofluorescens av kollagenfibre.
Vi farget celler med falloidin rettet mot cytoskeletal aktin og kjernefysisk motflekk, 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), for å overvåke spesifikke celleegenskaper gjennom hele den eksperimentelle tidslinjen. En overflod av aktin ble observert i Kelly- og KellyCis83-celler på Coll-I-GAG-stillas ved bruk av denne teknikken (figur 9D). Disse resultatene demonstrerer hvordan flere bildebehandlingsteknikker kan brukes til å utlede romlig løst informasjon fra neuroblastomceller dyrket på stillaser ved hjelp av denne protokollen. Denne karakteriseringen av cellevekstmønstre på kollagenbaserte stillaser over en gitt periode vil forbedre forståelsen og tolkningen av eventuelle nedstrøms biokjemiske analyser.
Proteinuttrykk av celler dyrket på kollagenbaserte stillaser kan analyseres for å sammenligne cellulær aktivitet med in vivo-scenarier. Tidligere publiserte data undersøkte ekspresjonen av kromogranin A (CgA) som en surrogatutskilt markør for nevroblastom av KellyLuc og KellyCis83Luc-celler dyrket i cellemonolag samt på Coll-I-nHA og Coll-I-GAG-stillas (figur 10). CgA ble vurdert i det kondisjonerte mediet ved hjelp av en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) (figur 10A). CgA utskilles med høyere hastighet i den mer aggressive kjemoresistente KellyCis83-cellelinjen enn i Kelly (figur 10B,C). Dette var signifikant på dag 7 på både Coll-I-GAG og Coll-I-nHA stillas (P<0.05), mens det ikke var noen signifikant forskjell på dette tidspunktet for celler dyrket som et monolag ved konvensjonell 2D-kultur.
Disse resultatene fremhever også den begrensede eksperimentelle tidslinjen når man vokser celler i et monolag, med bare 7 dager med vekst som viser seg mulig før cellene når samløp. Veksten av celler på stillaser overvinner denne begrensningen, da de kan opprettholdes over en lengre periode under mer fysiologisk relevante forhold. Ovennevnte kombinasjon av teknikker for å skaffe seg informasjon om cellelevedyktighet, DNA-innhold, cellulær morfologi og romlig arrangement og ekspresjonsprofiler letter vurderingen av veksten av neuroblastomceller på en rekke kollagenbaserte stillas. Denne protokollen kan også enkelt tilpasses for å tilfredsstille spesifikke eksperimentelle krav og ønskede applikasjoner.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig06.jpg"> Figur 6: Celle levedyktighetsanalyse. (A) Generell prosedyre for måling av levedyktigheten til nevroblastomceller på kollagenbaserte stillaser ved bruk av en kolorimetrisk celle levedyktighetsanalyse. Inkubasjonsperioden må optimaliseres for hver ny cellelinje, med henvisning til produsentens retningslinjer. (B) Prosentvis reduksjon av cellelevedyktighetsreagens av KellyLuc- og IMR32-celler dyrket på Coll-I-nHA-stillas ved fire forskjellige innledende såtettheter, målt på dag 1, 7 og 14. Prøvene ble vurdert i biologisk triplikat med feilfelt som representerte standardavviket. Forkortelser: nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig07.jpg"> Figur 7: Cellens levedyktighet ved såtetthet for celler dyrket på Coll-I-nHA over en 14-dagers periode. (A) KellyLuc; (B) IMR32. Tittelcellenumre refererer til den opprinnelige cellesåtettheten på stillasene på dag 0. Prøvene ble vurdert i biologisk triplikat, indikert med triplikate punkter, med stolper som representerte gjennomsnittet. One-Way ANOVA with Multiple Comparisons ble brukt til å oppdage signifikante forskjeller i % celle levedyktighet reagensreduksjon over de tre tidspunktene, notert på grafene (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Forkortelser: nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA; ANOVA = variansanalyse; NS = ikke signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig08.jpg"> Figur 8: Kvantifisering av DNA ekstrahert fra celler i stillas . (A) Prosess for å kvantifisere dsDNA fra celler dyrket på kollagenbaserte stillaser ved hjelp av en fluorescerende dsDNA-flekk. (B) Celletall fra DNA-kvantifiseringsanalyse ved såtetthet for KellyLuc- og IMR32-celler dyrket på Coll-I-nHA over en 14-dagers periode. Tittelcellenumre refererer til den opprinnelige cellesåingstettheten på stillas på dag 0. Prøvene ble vurdert i biologisk triplikat, indikert med triplikate punkter, med stolper som representerte gjennomsnittet. One-Way ANOVA with Multiple Comparisons ble brukt til å oppdage signifikante forskjeller i celletall over de tre tidspunktene, notert på grafene (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Forkortelser: nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA; dsDNA = dobbeltstrenget DNA; TE = Tris-EDTA; ANOVA = variansanalyse; NS = ikke signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig09.jpg"> Figur 9: Vevsbehandlingstrinn for immunhistokjemianalyse av stillas . (A) Skjematisk fremstilling av protokollen for behandling av stillas for bildeanalyse. Denne prosessen tillater rutinemessig histologisk farging og spesifikk antistoffprobing ved bruk av primære antistoffer og fluorescerende merkede sekundære antistoffer. (B) Representative bilder av tre neuroblastomcellelinjer utsatt for H&E-farging. H&E-bilder tas på dag 1, 7, 14 for å overvåke vekstmønstre i løpet av eksperimentet. Skala bar = 200 μm. Stiplede firkanter representerer området som ble valgt for zoomede 20x-bilder nederst til venstre. Skala bar = 20 μm. (i og ii) H&E av Kelly og KellyCis83 neuroblastomcellelinjer (henholdsvis øvre og nedre paneler) på to typer kollagenbaserte stillas. (iii) H&E av IMR32-cellelinje, som representerer gruppert cellulær vekst på Coll-I-nHA-stillaset. (C) Representativt bilde av Kelly-cellelinjen, utsatt for lysefelt konfokalmikroskopi. Kollagenautofluorescensen tillater visualisering av det porøse stillaset. 10x skala bar = 200 μm, 20x skala bar = 20 μm. (D) Representativt bilde av innebygde stillas etterfulgt av analyse av IHC med falloidin og DAPI ved 10x forstørrelse, skala bar = 200 μm. Mindre innvendige firkanter representerer innzoomede bilder (20x), skalalinje = 20 μm. Forkortelser: nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA; GAG = glykosaminoglykan; Coll-I-GAG = kollagen stillas supplert med kondroitin-6-sulfat; H&E = hematoksylin og eosin; IHC = immunhistokjemi; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig09large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig10.jpg"> Figur 10: Proteinuttrykk fra nevroblastomceller dyrket på 3D-kollagenbaserte stillaser sammenlignet med 2D-plast . (A) Et skjema over hvordan CgA ELISA ble utført på betingede medier av celler dyrket på 2D-plast eller 3D-kollagenbaserte stillas. (B) CgA-proteinuttrykksnivåer tatt fra betingede medier av celler dyrket på et 2D-plastmonolag. Da cellene nådde sammenløp etter 7 dager, var 14-dagers tidspunktet ikke lesbart. Ved dag 7 på plast var det ingen signifikant forskjell i CgA-nivåer mellom Kelly og KellyCis83 cellelinjer. (C) CgA ELISA utført ved bruk av betingede medier av celler dyrket på kollagenbaserte stillaser i 14 påfølgende dager. På dag 7, på begge kollagenstillasene, er CgA-nivåene høyere i den mer aggressive KellyCis83-cellelinjen, noe som fremhever mer fysiologiske relevante nivåer av CgA i 3D-matrise sammenlignet med 2D monolayer. Denne figuren er modifisert fra Curtin et al.17. Forkortelser: 3D = tredimensjonal; 2D = todimensjonal; CgA = kromogranin A; ELISA = enzymbundet immunosorbentanalyse; nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA; GAG = glykosaminoglykan; Coll-I-GAG = kollagen stillas supplert med kondroitin-6-sulfat; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin; HRP = pepperrotperoksidase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig10large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Dette papiret viser trinnene som kreves for å frø neuroblastomcellelinjer på tidligere beskrevne tredimensjonale kollagenbaserte stillas, opprettholde cellevekst for en forhåndsbestemt tidsramme og hente stillas for flere cellevekst- og celleadferdsanalyser og nedstrømsapplikasjoner, tilpasningsdyktige for å tilfredsstille en rekke eksperimentelle mål.

Tredimensjonal in vitro biomimetisk modell av neuroblastom ved bruk av kollagenbaserte stillas

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Vår protokoll tilbyr en 3D bio-konstruert modell som nært påvirker det opprinnelige vevet. Dette kan potensielt brukes til å oppdage nye terapier og biomarkører for neuroblastombehandling og diagnose. Den største fordelen er at den skaper mer fysiologisk relevante eksperimentelle forhold for å studere tumormikromiljøet ved hjelp av en reproduserbar teknikk som oppnår batch til batch-konsistens.Vår stillasmetode kan for det første brukes til å identifisere nye terapier for nevroblastom, og for det andre å innlemme pasientavledede celler for bedre prediksjon av individuell pasientrespons. For å begynne, plasser stillaset som er lagret i PBS i den laminære strømningshetten. Bruk steril pinsett til å løfte stillaset forsiktig fra hjørnet, og trykk mot sideveggen for å fjerne overflødig PBS.Plasser deretter stillaset med det skinnende laget vendt ned i midten av brønnen på en ikke-vedheftende 24-brønnsplate. Merk platen med detaljer om cellelinjen, såtetthet og tidspunkter. Arbeid med cellene med en såtetthet om gangen, og hold de resterende cellene ved 37 grader Celsius i inkubatoren, til de er klare til bruk.For cellefestet i stillaset, bruk en P20-pipette med sterile spisser for å blande celleopphenget grundig, og tilsett 20 mikroliter av den relevante celleopphenget i midten av hvert stillas, slik at celleopphenget forblir på toppen av stillaset og ikke på sideveggen eller bunnen av brønnen. La cellene feste seg i tre til fem timer ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid og 95% fuktighet. På slutten av inkubasjonen, bruk en P1000-pipette for sakte å legge til en milliliter forvarmet vekstmedium til hver brønn, forhindre forskyvning av stillasene og inkubere platen over natten.Observer stillasene, i utgangspunktet, hver to til tre dager for fargeendringer i vekstmediet som cellene sprer seg i stillaset. Bruk en 10 milliliter pipettepistol med sakte modus for å fjerne og kaste en milliliter av det brukte mediet fra brønnen. Når det kondisjonerte mediet brukes til forsøket, samler du det brukte mediet av de biologiske replikatene i et 15 milliliter sentrifugerør og pellet ned det cellulære rusket ved sentrifugering.Overfør supernatanten til en ny tube og oppbevar tuben ved minus 80 grader Celsius. Etter å ha satt pipettepistolen i dryppmodus, tilsett forsiktig to milliliter forvarmet vekstmedium til stillasene. Inkuber den stillasholdige platen og fyll på det friske mediet i løpet av ønsket vekstperiode, som demonstrert.I den laminære strømningshetten, steriliser det aktuelle cellelevedyktighetsanalysereagenset ved filtrering gjennom et 0,2 mikrometer sterilt filter i et sentrifugerør. Forvarm den sterile løsningen, fullstendig vekstmedium og steril PBS i vannbadet, ved 37 grader Celsius. Bruk steril pinsett, overfør stillasene som skal analyseres i en ny 24-brønns plate, og merk platen med alle relevante detaljer.Tilsett 900 mikroliter av det forvarmede vekstmediet til hver brønn. Deretter tilsettes 100 mikroliter av den sterile cellens levedyktighetsreagens til hver brønn. For en negativ kontroll, tilsett 900 mikroliter medium og 100 mikroliter av den sterile celle levedyktighetsreagenset i en brønn uten stillas.Sett lokket på platen igjen, og gyng platen forsiktig i ca. tre minutter for å fordele det fortynnede cellelevedyktighetsreagenset gjennom brønnen. Inkuber platen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid og 95% fuktighet. Etter å ha fjernet platen fra inkubatoren, gyng forsiktig platen i noen sekunder og generer triplikatene, som vist i tekstmanuskriptet.Generer de tekniske triplikatene ved å overføre 100 mikroliter av det inkuberte mediet og reagenset fra en brønn på 24-brønnsplaten til en brønn i den gjennomsiktige 96-brønnplaten, og utfør dette trinnet totalt tre ganger for en brønn. Dekk 96-brønnsplaten med aluminiumsfolie for å beskytte cellens levedyktighetsreagens mot lys. Fjern og kast de resterende 700 mikroliter medium og reagens fra stillasene i 24-brønnplaten.Vask hvert stillas to ganger med en milliliter steril PBS. Bruk en mikroplateleser til å måle absorbansen ved 570 og 600 nanometer, og beregne prosentvis reduksjon av cellens levedyktighetsreagenser i henhold til produsentens anbefalinger. Statistisk analysere cellens levedyktighetsresultater ved hjelp av passende programvare.Skriv inn de biologiske triplikate verdiene for å produsere feilfelt og angi analysevariabiliteten. Utfør en enveisanalyse av varianstest for å undersøke endringene i cellens levedyktighet over den eksperimentelle tidsrammen ved hjelp av passende biostatistisk programvare. Angi signifikante forskjeller mellom tidspunktene på grafene, som beskrevet i tekstmanuskriptet.Levedyktigheten til to nevroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på stillasene, ble vurdert. Den økte celletettheten resulterte i mer reduksjon av cellens levedyktighetsreagens med tiden. Celleveksten på stillasene ble indirekte målt ved å kvantifisere DNA hentet fra stillasene, og cellene per prøve ble beregnet.IMR32-cellene viste økt vekst, deretter KellyLuc-celler, med tiden. Vekstmorfologien og fordelingen av celler på stillasene ble visuelt vurdert ved hematoksylin, eosin og immunhistokjemifarging. KellyCis83-celler vokste raskere og infiltrerte dypere inn i begge stillassammensetningene enn den mindre invasive Kelly-cellelinjen.IMR32 dyrket på nanohydroksyapatitt viste et kontrasterende vekstmønster med store, tettpakkede klynger, over 14 dager. De cellespesifikke egenskapene ble overvåket ved immunhistokjemifarging, etterfulgt av falloidin- og DAPI-farging, og forekomsten av aktin ble observert i Kelly- og KellyCis83-celler på kollagen-glykosaminoglykanstillas. For in vitro cellulær aktivitetsvurdering ble utskilte nivåer av kromogranin A målt, og cellene dyrket på kollagen-glykosaminoglykan og kollagen nanohydroksyapatitt stillas produserte mer kromogranin A sammenlignet med veksten på konvensjonell 2D-kultur.Den kjemoresistente KellyCis83-cellelinjen utskilte mer kromogranin A enn Kelly-cellelinjen. Etter cellevedlegg kan celler behandles med ulike terapier. Dette vil gi mer fysiologisk relevante resultater for cellenes respons på legemidler enn konvensjonell 2D-kultur.Denne teknikken gjør det mulig for forskere å bedre utforske hvordan kreftceller oppfører seg og reagerer på en stimulus i tumormikromiljøet, alt fra respons på terapi eller interaksjoner med andre celletyper.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studier av virale vektorer i et tredimensjonalt Liver Modell repopulated med Human leverkreft cellelinje HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvåking av tredimensjonale svulst Spheroids bruker Optical Coherence tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensjonale bein ekstracellulær Matrix modell for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Fullt Human tumor-baserte Matrix i tredimensjonale spheroid Invasion analysen

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tredimensjonal modell av sfæroider for å studere kolonkreft stamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Sebrafisk modell av Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

En tredimensjonal sfæroidmodell for å undersøke tumor-stromal interaksjon i hepatocellulært karsinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...