Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo National Children's Research Centre (NCRC), Irish Research Council (IRC) e Neuroblastoma UK. As ilustrações foram criadas utilizando o BioRender.

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O modelo de células de câncer em arcabouço 3D provou ser uma ferramenta valiosa e versátil para obter informações mecanicistas sobre o crescimento, viabilidade e infiltração de células de neuroblastoma em uma TME simplificada32. O modelo de neuroblastoma 3D descrito aqui mimetiza a ETM mínima e fornece dados fisiologicamente mais relevantes do que uma cultura de monocamada 2D. Uma grande desvantagem da cultura de células 3D é o aumento da complexidade experimental e prazos mais longos. Descrito aqui é um protocolo otimizado para semeadura, crescimento e manutenção de células de neuroblastoma em arcabouços à base de colágeno, seguido por análises e aplicações a jusante, produzindo uma caracterização robusta do crescimento celular. Nosso objetivo foi obter informações sobre a densidade ideal de semeadura celular para os scaffolds para criar um ambiente previsível e controlável para avaliar tratamentos de drogas anticâncer em uma janela experimental rápida de 14 dias. A combinação de todos esses protocolos simples descritos fornece uma avaliação completa do crescimento celular de neuroblastoma no sistema de cultura in vitro baseado em scaffold.
Os pontos críticos na configuração do protocolo foram enfatizados para permitir que os cientistas estabeleçam o mesmo em seus laboratórios rapidamente. Por exemplo, os tempos de incubação indicados para melhor desempenho do ensaio de viabilidade celular colorimétrica permitem uma penetração mais profunda do reagente nos poros do arcabouço para atingir todas as células. Além disso, a técnica de coloração fluorescente de dsDNA é robusta e direta; no entanto, a liberação de DNA dos scaffolds requer lise celular vigorosa, pois as células estão "presas" dentro das fibras de colágeno.
Usando o ensaio simples de quantificação de DNA descrito, podemos identificar a fase de crescimento logarítmica em scaffolds à base de colágeno para rastreamento de drogas anticâncer usando este modelo. No cenário experimental descrito, foram utilizadas 4 densidades iniciais de semeadura celular com um período total de 14 dias e pontos de tempo de análise nos Dias 1, 7 e 14. Identificamos que as células KellyLuc semeadas em 4 × 105 células/arcabouço têm a janela de proliferação mais significativamente ativa entre os dias 7 e 14. Estes dados de crescimento em fase logarítmica permitirão uma interpretação confiável de vários experimentos de citotoxicidade celular. Ele elimina a especulação sobre qualquer declínio no crescimento ou morte celular resultante do crescimento suprimido na plataforma porosa 3D, em vez de toxicidades de drogas. A viabilidade celular também é uma avaliação amplamente utilizada para a adequação de plataformas 3D para suportar o crescimento de diferentes tipos celulares33,34. Embora existam muitos ensaios para medir a viabilidade celular, incluindo coloração viva/morta, medição de ATP, ensaios de proliferação, descobrimos que o uso do ensaio de viabilidade celular colorimétrica Alamar Blue é uma técnica simples e eficaz para apoiar dados de quantificação de DNA.
O uso combinado da quantificação do DNA e da viabilidade celular forneceu evidências complementares de que, em média, a densidade ideal para semear células no arcabouço para alcançar o crescimento contínuo durante um período de 14 dias é de 2-4 × 105 células/arcabouço. No entanto, este protocolo pode ser facilmente adaptado para satisfazer diferentes períodos de tempo experimentais, pontos de tempo de análise e aplicações a jusante. Embora este protocolo descreva a avaliação do crescimento celular em monocultura de células de neuroblastoma em scaffolds, os scaffolds são facilmente alteráveis para uso como plataforma para co-cultura, descrito por do Amaral et al., que utilizaram scaffolds de colágeno-GAG para co-cultura de queratinócitos e fibroblastos em uma investigação de cicatrização deferidas35.
O modelo 3D descrito permite a visualização do crescimento e infiltração celular utilizando diferentes técnicas bem conhecidas, como a imunofluorescência e o padrão H&E. É importante visualizar as células juntamente com a caracterização do crescimento usando ensaios bioquímicos devido à diversidade de morfologia celular e padrões de crescimento em scaffolds. Compreender o padrão de crescimento pode produzir insights sobre o comportamento de crescimento e a resposta futura a drogas anticâncer. Por exemplo, o crescimento de IMR32 usando quantificação de DNA produz padrões semelhantes aos de Kelly, embora na visualização usando H&E, IMR32 cresça em grupos maiores do que Kelly, que apresentou crescimento mais disperso (Figura 9). Esses variados padrões de crescimento de linhagens celulares em scaffolds refletem o cenário clínico de heterogeneidade tumoral. Examinar a resposta a drogas anticâncer usando um painel de linhagens celulares com diferentes morfologias em scaffolds 3D aumentará o valor preditivo para a resposta do paciente às mesmas drogas.
A detecção da expressão gênica ou proteica também pode ser realizada usando outras abordagens, como RT-qPCR ou ELISA, se a proteína de interesse for secretada. Um marcador substituto da progressão do neuroblastoma, a cromogranina A (CgA)36, foi usado para caracterizar adicionalmente o crescimento celular do neuroblastoma em 3D. Como descrito em trabalho anterior17, a secreção de CgA aumentou à medida que as células proliferavam (Figura 10). Enquanto a cultura de células monocamadas não conseguiu captar esse aumento, pois a proliferação significou que as células atingiram plena confluência nas placas de cultura, o uso dos scaffolds de colágeno 3D permitiu uma avaliação prolongada da secreção de CgA.
Este modelo 3D in vitro pode não ser adequado para todas as questões de pesquisa para estudar a biologia do neuroblastoma e a resposta à terapêutica. Uma das limitações é a penetração desigual de células dentro de arcabouços e a formação de aglomerados celulares de tamanhos variados, que dependem de uma determinada linhagem celular e podem levar à difusão incontrolável de nutrientes e fármacos. Essa característica afeta a robustez no rastreamento terapêutico. No entanto, apesar dessa limitação, é importante considerar que os tumores nativos também são heterogêneos em tamanho e distribuição de células cancerígenas e contêm muitos outros tipos celulares dentro do tecido tumoral. Para superar essa limitação, propomos o uso de cada arcabouço preenchido como um único microtecido, para o qual os seguintes parâmetros serão otimizados: (a) tempos de incubação para que o reagente de viabilidade celular atinja as células e os aglomerados celulares, e (b) lise das células em tampão Triton X-100 por pré-processamento das células em scaffolds com um lisador tecidual para liberar o DNA das células contidas profundamente no scaffold.
Outra limitação técnica deste protocolo é a falta de ensaios mecânicos de cada lote de andaimes recém-fabricados para este modelo. Entretanto, a utilização do robusto processo de fabricação dos scaffolds, que tem sido extensivamente caracterizado em relação às propriedades físicas e químicas dos scaffolds, como módulo de compressão e tração, porosidade e estrutura visual dos poros, e homogeneidade, garante que as qualidades dos andaimes sejam mantidas através de lotes 21,24,27,30,37.
Em resumo, este trabalho apresenta uma série de métodos simples para a análise do crescimento celular em arcabouços à base de colágeno. Tanto a linha do tempo experimental quanto os pontos de análise podem ser intercambiados dependendo das questões específicas de pesquisa. Este protocolo também é adaptável a outros tipos celulares. Os resultados mostrados acima fornecem evidências sobre como esta compilação de métodos forneceu informações sobre a densidade de semeadura ideal para várias linhagens celulares de neuroblastoma para criar crescimento contínuo ao longo de 14 dias. A fusão dos resultados obtidos de todos os métodos deste protocolo proporciona uma compreensão superior do crescimento celular dentro da matriz de colágeno 3D. A utilização futura deste modelo provavelmente envolverá sistemas de co-cultura específicos para o neuroblastoma TME e o teste de várias novas drogas anticâncer.

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The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

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Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

O neuroblastoma é um câncer pediátrico do sistema nervoso simpático que surge durante o desenvolvimento embrionário ou início da vida pós-natal devido à transformação das células da crista neural1. É o tumor sólido extracraniano mais comum em crianças, representando 8% das neoplasias malignas diagnosticadas em pacientes menores de 15 anos e é responsável por 15% de todas as mortes por câncer infantil. A doença apresenta comportamentos clínicos altamente heterogêneos devido a alterações cromossômicas, genéticas e epigenéticas específicas, além de características histopatológicas.
Essas alterações contribuem para a agressividade do neuroblastoma e maus resultados em pacientes pediátricos. Assim, as terapias atuais mostram-se ineficazes em longo prazo para quase 80% dos pacientes com doença clinicamenteagressiva2, ressaltando o fato de que o tratamento para esse grupo de pacientes permanece desafiador. Isso provavelmente se deve aos mecanismos de heterogeneidade e metástases do neuroblastoma ainda não totalmente compreendidos. No entanto, acredita-se que o microambiente tumoral (TME) desempenhe um papel na progressão de muitos cânceres; no entanto, permanece pouco estudada noneuroblastoma3,4.
A EMT nativa é um microambiente 3D complexo envolvendo células cancerosas e não cancerosas circundadas por uma MEC. A MEC refere-se ao componente acelular de um tecido que fornece suporte estrutural e bioquímico aos seus residentes celulares e contribui para a progressão da doença, prognóstico do paciente e resposta terapêutica5. Essa promoção da progressão da doença deve-se à "reciprocidade dinâmica" ou comunicação bidirecional contínua entre as células e a MEC 6,7,8. À medida que o câncer progride, o colágeno estromal é reorganizado, muitas vezes em padrões lineares perpendiculares à interface estroma-câncer, que as células cancerosas utilizam como rota migratória para a metástase9,10,11.
Os principais componentes desse arcabouço biológico funcional nativo incluem uma rede fibrosa de colágenos tipo I e II e outras proteínas, incluindo elastina, glicoproteínas como a laminina, bem como uma gama de proteoglicanos e outros componentes solúveis12,13. Essas proteínas da MEC nativa tornaram-se biomoléculas naturais atrativas para o desenvolvimento de modelos 3D in vitro3. A aplicação de scaffolds 3D para cultura celular in vitro está aumentando em popularidade devido à sua maior representação fisiológica da TME em comparação com a cultura monocamada 2D tradicional. Os arcabouços 3D fabricados auxiliam a fixação, proliferação, migração, metabolismo e resposta celular a estímulos observados em sistemas biológicos in vivo.
O principal componente desses scaffolds 3D é o colágeno, que é peça-chave em muitos processos biológicos normais, incluindo reparo tecidual, angiogênese, morfogênese tecidual, adesão celular e migração11. Matrizes 3D baseadas em colágeno têm mostrado sua funcionalidade robusta para modelar a MEC, servindo como um microambiente biomimético in vitro, permitindo interações célula-MEC, bem como migração e invasão celular. Essas matrizes 3D também fornecem uma análise mais precisa da resposta celular a drogas quimioterápicas do que a cultura 2D tradicional ou "plana" em muitos modelos de câncer 14,15,16, incluindo o neuroblastoma 17,18. A análise genética de culturas de células 3D tem relatado maior correlação com o perfil tecidual humano, mesmo quando comparada a modelosanimais19. De modo geral, a pedra angular desses scaffolds 3D é fornecer às células um ambiente in vitro adequado, que recapitule a arquitetura do tecido nativo e facilite o crosstalk molecular bidirecional8.
Para aumentar a complexidade dos modelos à base de colágeno, outros componentes comuns da MEC são incorporados no processo de engenharia tecidual, criando modelos fisiologicamente mais relevantes para refletir TMEs de nicho de diferentes tecidos. Por exemplo, os GAGs, polissacarídeos carregados negativamente presentes em todos os tecidos de mamíferos20, facilitam a acessão, migração, proliferação e diferenciação celular. O sulfato de condroitina é um tipo específico de GAG encontrado no osso e cartilagem, que tem sido previamente utilizado em aplicações de engenharia tecidual para reparo ósseo21,22,23,24,25. A nano-hidroxiapatita (nHA) é o principal constituinte inorgânico da composição mineral do tecido ósseo humano, constituindo até 65% do osso em peso26 e, portanto, é amplamente utilizada para substituição e regeneraçãoóssea27. Assim, GAGs e nHA são compostos atraentes para reconstruir o neuroblastoma primário da MEC e modelar os sítios metastáticos mais comuns de neuroblastoma, medula óssea (70,5%) e osso (55,7%)28.
Os scaffolds incorporando esses componentes da MEC foram originalmente desenvolvidos para aplicações em engenharia de tecido ósseo com extensa análise de sua biocompatibilidade, toxicidade e características osteocondutoras e osteoindutoras29,30. São matrizes porosas, à base de colágeno, produzidas por meio de técnicas de liofilização para controle de suas propriedades físicas e biológicas. Os arcabouços de colágeno suplementados com nHA (Coll-I-nHA) ou condroitina-6-sulfato (Coll-I-GAG) demonstraram sucesso em mimetizar a EMT primária no câncer de mama31 e metástase para osso no câncer de próstata15, bem como neuroblastoma17. A técnica de liofilização utilizada na confecção desses scaffolds compósitos proporciona homogeneidade reprodutível no tamanho dos poros e porosidade no interior dos scaffolds22,23,24. Resumidamente, uma lama de colágeno (0,5% em peso%) é fabricada pela mistura de colágeno fibrilar com ácido acético 0,05 M. Para Coll-I-GAG, 0,05% em peso de sulfato de crondoitina-6 isolado da cartilagem de tubarão é adicionado à lama de colágeno durante a mistura. Para os scaffolds compósitos de Coll-I-nHA, partículas nanométricas de hidroxiapatita são sintetizadas como descrito anteriormente27 e adicionadas à lama de colágeno na proporção de 2:1 em relação ao peso do colágeno durante o processo de mistura. Todos os andaimes são fisicamente reticulados e esterilizados usando um tratamento desidrotérmico a 105 °C por 24 h25. Scaffolds cilíndricos (6 mm de diâmetro, 4 mm de altura) são obtidos por meio de um punch de biópsia e podem ser quimicamente reticulados com 3 mM de cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida e 5,5 mM de N-hidroxisuccinimida (EDAC/NHS) em água destilada (dH2O) para melhorar as propriedades mecânicas dos construtos30. Este processo de fabricação bem otimizado de dois arcabouços de colágeno cria arcabouços com propriedades mecânicas reproduzíveis, incluindo tamanho de poros, porosidade e rigidez (kPa). Ambos os andaimes Coll-I-GAG e Coll-I-nHA têm propriedades físicas variadas, criando diferentes condições ambientais. As propriedades de cada andaime são exibidas na Tabela 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Coll-I-GAG</td>
			<td>Coll-I-nHA</td>
		</tr><tr><td>Tamanho do andaime (diâmetro [mm] x altura [mm])</td>
			<td>Eixo 6 x 4 17</td>
			<td>Eixo 6 x 4 17</td>
		</tr><tr><td>Concentração de colágeno (em peso)</td>
			<td>0,5 17</td>
			<td>0,5 17</td>
		</tr><tr><td>Concentração de substrato (em peso) [com base no peso do colágeno]</td>
			<td>0,05 15,17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>Tamanho médio dos poros (mm)</td>
			<td>96 22</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>Porosidade (%)</td>
			<td>99,5 23</td>
			<td>98,9 – 99,4 27</td>
		</tr><tr><td>Rigidez (kPa)</td>
			<td>1,5 27</td>
			<td>5,5 - 8,63 29</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Visão geral das propriedades mecânicas dos dois arcabouços adotados para o estudo da biologia do neuroblastoma.
Este trabalho descreve um protocolo de montagem de um sistema baseado em arcabouço 3D para melhor mimetizar o microambiente do neuroblastoma usando linhagens celulares de neuroblastoma e arcabouços à base de colágeno previamente descritos suplementados com nHA (Coll-I-nHA) ou condroitina-6-sulfato (Coll-I-GAG). O protocolo inclui métodos a jusante para analisar os mecanismos de crescimento das células do neuroblastoma em um ambiente fisiologicamente mais relevante, usando métodos de baixo custo previamente otimizados adaptados da cultura 2D monocamada Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho geral do protocolo. (A) As células são cultivadas em número suficiente, divididas, contadas e ressuspensas em um volume apropriado de meio. (B) Esse estoque de células passa então por diluição em série para preparar um total de 4 suspensões celulares de diferentes densidades. (C) Os arcabouços à base de colágeno são esterilizados em placas não aderentes de 24 poços, e (D) 20 μL de suspensão celular são adicionados ao centro de cada arcabouço e deixados para incubar a 37 °C, 5% de CO2 e 95% de umidade por 3-5 h. (E) O meio de crescimento completo (1 mL) é então adicionado lentamente a cada arcabouço, e as placas são colocadas de volta na incubadora para permitir o crescimento celular pelo tempo desejado. (F) Em cada momento pré-determinado, vários scaffolds são recuperados para avaliação da viabilidade e crescimento celular, análise da expressão gênica e coloração histológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

O neuroblastoma é o tumor sólido extracraniano mais comum em crianças, sendo responsável por 15% das mortes totais por câncer pediátrico. O tecido tumoral nativo é um microambiente tridimensional (3D) complexo envolvendo camadas de células cancerosas e não cancerosas circundadas por uma matriz extracelular (MEC). A MEC fornece suporte físico e biológico e contribui para a progressão da doença, prognóstico do paciente e resposta terapêutica.
Este trabalho descreve um protocolo para a montagem de um sistema baseado em arcabouço 3D para mimetizar o microambiente do neuroblastoma usando linhagens celulares de neuroblastoma e scaffolds à base de colágeno. Os scaffolds são suplementados com nanohidroxiapatita (nHA) ou glicosaminoglicanos (GAGs), naturalmente encontrados em altas concentrações no osso e na medula óssea, os sítios metastáticos mais comuns do neuroblastoma. A estrutura porosa 3D desses arcabouços permite a fixação, proliferação e migração de células do neuroblastoma e a formação de aglomerados celulares. Nessa matriz 3D, a resposta celular à terapêutica é mais reflexiva da situação in vivo .
O sistema de cultura baseado em scaffold pode manter densidades celulares mais altas do que a cultura celular bidimensional (2D) convencional. Portanto, os protocolos de otimização para números iniciais de células de semeadura são dependentes dos prazos experimentais desejados. O modelo é monitorado avaliando-se o crescimento celular via quantificação de DNA, a viabilidade celular via ensaios metabólicos e a distribuição celular dentro dos scaffolds via coloração histológica.
As aplicações deste modelo incluem a avaliação de perfis de expressão gênica e proteica, bem como testes de citotoxicidade usando drogas convencionais e miRNAs. O sistema de cultura 3D permite a manipulação precisa de componentes celulares e da MEC, criando um ambiente fisiologicamente mais semelhante ao tecido tumoral nativo. Portanto, este modelo 3D in vitro irá avançar no entendimento da patogênese da doença e melhorar a correlação entre os resultados obtidos in vitro, in vivo em modelos animais, e os seres humanos.

O modelo de arcabouço à base de colágeno descrito aqui tem muitas aplicações, desde o estudo da biologia do neuroblastoma até o rastreamento da terapêutica anticâncer em um ambiente fisiologicamente mais semelhante aos tumores nativos do que a cultura de células 2D convencional. Antes de testar uma determinada questão de pesquisa, é crucial obter uma caracterização completa da adesão, proliferação e infiltração celular dentro do prazo experimental desejado. As condições de crescimento dependerão da biologia de cada linhagem celular específica. É importante ressaltar que vários métodos de avaliação do crescimento celular devem ser implementados para determinar condições ótimas e desempenho robusto.
Aqui, a viabilidade de células de neuroblastoma cultivadas em scaffolds foi avaliada usando um ensaio colorimétrico de viabilidade celular. Este ensaio pode ser realizado com a frequência desejada durante todo o período experimental. Para o experimento descrito, a avaliação da viabilidade celular foi realizada nos dias 1, 7 e 14 para duas linhagens celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas em scaffolds Coll-I-nHA em 4 densidades diferentes (Figura 6). A viabilidade no Dia 1 foi definida como linha de base para comparar todas as medidas subsequentes. A taxa de redução do reagente de viabilidade celular é reflexo da biologia celular e das características de crescimento de linhagens celulares individuais, incluindo suas taxas de proliferação e metabolismo. Uma correlação entre o número de células semeadas nos scaffolds e o nível de redução era esperada. Neste experimento, a redução do reagente de viabilidade celular geralmente aumentou a cada momento para ambas as linhagens celulares em todas as densidades, como esperado.
Cada densidade foi então avaliada individualmente para ambas as linhagens celulares para comparar a redução ao longo dos tempos. ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Tukey foi realizada para detectar diferenças significativas na redução entre os momentos (Figura 7). Para ambas as linhagens celulares e todas as densidades de semeadura, houve um aumento significativo (P<0,05) na redução do reagente de viabilidade celular quando comparados o dia 1 e o dia 14. Isso indicou um aumento significativo de células metabolicamente ativas presentes nos scaffolds. Esse aumento não foi significativo em todos os casos quando avaliados os intervalos de 7 dias (dia 1 vs. dia 7, dia 7 vs. dia 14), demonstrando a importância da otimização da densidade de semeadura para atingir a janela de crescimento desejada.
Para apoiar os resultados do ensaio de viabilidade celular, o crescimento celular em scaffolds também pode ser medido indiretamente através da quantificação de dsDNA extraído de scaffolds usando uma coloração fluorescente de dsDNA (Figura 8A). Assim como a viabilidade celular, a quantificação do DNA pode ser feita com a frequência desejada dentro da linha do tempo experimental. No entanto, essa análise requer a recuperação completa dos arcabouços e o término do crescimento celular e, portanto, deve ser levada em consideração no planejamento experimental, como discutido na seção 1. Para este experimento, o DNA foi quantificado nos dias 1, 7 e 14 para duas linhagens celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas em scaffolds Coll-I-nHA em 4 densidades diferentes. Como a concentração média de dsDNA por célula é conhecida para essas linhagens, foi possível derivar o número de células por amostra a partir do DNA quantificado (Figura 8B).
A quantificação de DNA deu origem a uma maior variabilidade entre as réplicas biológicas do que a avaliação da viabilidade celular, mas geralmente aumentou para cada ponto de tempo, com os níveis mais altos quantificados no dia 14. As células IMR32 parecem atingir maior número de células em scaffolds de Coll-I-nHA, como indicado pela concentração de DNA, do que as células KellyLuc. Cada densidade foi então avaliada individualmente para as duas linhagens celulares para comparar a redução ao longo dos tempos. ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Tukey foi realizada para detectar diferenças significativas na redução entre os momentos (Figura 8B).
Para ambas as linhagens e todas as densidades de semeadura, houve um aumento significativo (P<0,05) no número de células quando comparado o dia 1 e o dia 14, com exceção de KellyLuc na densidade de semeadura 4 (1 × 105 células/scaffold), que não produziu aumentos significativos em nenhum dos momentos. Semelhante aos resultados de viabilidade celular, os aumentos não foram significativos em todos os casos quando avaliados os intervalos de 7 dias (dia 1 vs. dia 7, dia 7 vs. dia 14). Ao comparar as tendências de tempo para viabilidade celular e quantificação de DNA, houve algumas pequenas diferenças entre as duas análises. No entanto, tendências gerais semelhantes foram observadas, com valores médios aumentando entre intervalos de 7 dias para a maioria das densidades. Isso demonstra a importância do monitoramento do crescimento celular por meio de mais de um método.
Uma avaliação visual da morfologia e distribuição do crescimento celular nos scaffolds foi implementada em seguida, englobando as colorações tradicionais de hematoxilina e eosina (H&E), bem como IHQ. Espera-se que os diferentes padrões de crescimento de linhagens celulares individuais levem a arranjos espaciais variados em scaffolds, incluindo diferentes graus de penetração no arcabouço e agrupamento celular. Os scaffolds foram fixados em formalina, embebidos em parafina e cortados em cortes de 5 mm (Figura 9A), preparando-os para múltiplas técnicas de visualização, incluindo coloração histológica e IHQ.
A coloração H&E de rotina foi aplicada em células Kelly, KellyCis83 e IMR32 cultivadas em arcabouços à base de colágeno nos dias 1, 7 e 14 (Figura 9B). Isso permitiu a visualização da orientação espacial das células em dois arcabouços à base de colágeno durante um período de 14 dias. Células Kelly sensíveis à cisplatina e células KellyCis83 resistentes foram cultivadas em ambos os scaffolds Coll-I-nHA (Figura 9B, i) e Coll-I-GAG (Figura 9B, ii). Consistente com dados publicados anteriormente, as células KellyCis83 cresceram a uma taxa mais alta e se infiltraram mais profundamente em ambas as composições de andaimes do que a linhagem celular Kelly menos invasiva. A coloração H&E de outra linhagem celular de neuroblastoma, IMR32, cultivada em Coll-I-nHA demonstra um padrão de crescimento contrastante (Figura 9B, iii). Essa linhagem celular cresceu em grandes aglomerados densamente compactados nos arcabouços de colágeno durante o período de 14 dias. A microscopia confocal de campo claro pode ser usada para visualizar a arquitetura porosa dos arcabouços à base de colágeno (Figura 9C) devido à autofluorescência das fibras colágenas.
Nós coramos células com faloidina visando a actina citoesquelética e a contracoloração nuclear, 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), para monitorar características celulares específicas ao longo da linha do tempo experimental. Uma abundância de actina foi observada em células Kelly e KellyCis83 em scaffolds Coll-I-GAG usando esta técnica (Figura 9D). Estes resultados demonstram como múltiplas técnicas de imagem podem ser usadas para derivar informações espacialmente resolvidas de células de neuroblastoma cultivadas em scaffolds usando este protocolo. Esta caracterização dos padrões de crescimento celular em arcabouços à base de colágeno durante um determinado período melhorará a compreensão e interpretação de quaisquer ensaios bioquímicos a jusante.
A expressão de proteínas por células cultivadas em arcabouços à base de colágeno pode ser analisada para comparar a atividade celular com cenários in vivo . Dados publicados anteriormente examinaram a expressão da cromogranina A (CgA) como marcador secretado substituto de neuroblastoma por células KellyLuc e KellyCis83Luc cultivadas em monocamadas celulares, bem como em scaffolds Coll-I-nHA e Coll-I-GAG (Figura 10). A CgA foi avaliada no meio condicionado por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA) (Figura 10A). A CgA é secretada em uma taxa maior na linhagem celular KellyCis83, mais agressiva e quimio-resistente, do que na linhagem Kelly (Figura 10B,C). Isso foi significativo no dia 7 em ambos os scaffolds Coll-I-GAG e Coll-I-nHA (P<0,05), enquanto não houve diferença significativa neste momento para células cultivadas como monocamada por cultura 2D convencional.
Esses resultados também destacam o tempo restrito do crescimento de células em monocamada, com apenas 7 dias de crescimento se mostrando viável antes que as células atinjam a confluência. O crescimento de células em arcabouços supera essa limitação, pois elas podem ser mantidas por um período mais longo em condições fisiologicamente mais relevantes. A combinação de técnicas acima para adquirir informações sobre viabilidade celular, conteúdo de DNA, morfologia celular e arranjo espacial, e perfis de expressão facilita a avaliação do crescimento de células de neuroblastoma em uma variedade de arcabouços à base de colágeno. Este protocolo também pode ser facilmente adaptado para satisfazer requisitos experimentais específicos e aplicações desejadas.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig06.jpg"> Figura 6: Análise de viabilidade celular. (A) Procedimento geral para medir a viabilidade de células de neuroblastoma em arcabouços à base de colágeno usando um ensaio colorimétrico de viabilidade celular. O período de incubação deve ser otimizado para cada nova linhagem celular, seguindo as orientações do fabricante. (B) Redução percentual do reagente de viabilidade celular por células KellyLuc e IMR32 cultivadas em scaffolds Coll-I-nHA em quatro diferentes densidades iniciais de semeadura, medidas nos dias 1, 7 e 14. As amostras foram avaliadas em triplicata biológica com barras de erro representando o desvio padrão. Abreviações: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = arcabouços de colágeno suplementados com nHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig07.jpg"> Figura 7: Viabilidade celular por densidade de semeadura para células cultivadas em Coll-I-nHA durante um período de 14 dias. (A) KellyLuc; (B) IMR32. Os números de célula intitulados referem-se à densidade inicial de semeadura de células nos andaimes no Dia 0. As amostras foram avaliadas em triplicata biológica, indicada por pontos triplicata, com barras representando a média. A ANOVA One-Way com Comparações Múltiplas foi utilizada para detectar diferenças significativas na % de redução do reagente de viabilidade celular ao longo dos três momentos, observadas nos gráficos (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abreviações: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = arcabouços de colágeno suplementados com nHA; ANOVA = análise de variância; ns = não significante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig08.jpg"> Figura 8: Quantificação do DNA extraído das células em scaffolds . (A) Processo de quantificação de dsDNA de células cultivadas em arcabouços à base de colágeno utilizando coloração fluorescente de dsDNA. (B) Números celulares da análise de quantificação de DNA por densidade de semeadura para células KellyLuc e IMR32 cultivadas em Coll-I-nHA durante um período de 14 dias. Os números de célula intitulados referem-se à densidade inicial de semeadura de células em andaimes no Dia 0. As amostras foram avaliadas em triplicata biológica, indicada por pontos triplicata, com barras representando a média. A ANOVA One-Way com Comparações Múltiplas foi utilizada para detectar diferenças significativas no número de células ao longo dos três momentos, observadas nos gráficos (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abreviações: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = arcabouços de colágeno suplementados com nHA; dsDNA = DNA de fita dupla; TE = Tris-EDTA; ANOVA = análise de variância; ns = não significante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig09.jpg"> Figura 9: Etapas do processamento tecidual para análise imunoistoquímica dos scaffolds. (A) Representação esquemática do protocolo de processamento de scaffolds para análise de imagens. Esse processo permite a coloração histológica de rotina e a sondagem de anticorpos específicos usando anticorpos primários e anticorpos secundários marcados fluorescentemente. (B) Imagens representativas de três linhagens celulares de neuroblastoma submetidas à coloração H&E. As imagens H&E são tiradas nos dias 1, 7, 14 para monitorar os padrões de crescimento ao longo do tempo do experimento. Barra de escala = 200 μm. Os quadrados tracejados representam a área escolhida para imagens ampliadas em 20x na borda inferior esquerda. Barra de escala = 20 μm. (i e ii) H&E de linhagens celulares de neuroblastoma Kelly e KellyCis83 (painéis superior e inferior, respectivamente) em dois tipos de arcabouços à base de colágeno. (iii) H&E da linhagem celular IMR32, representando o crescimento celular agrupado no arcabouço Coll-I-nHA. (C) Imagem representativa da linhagem celular de Kelly, submetida à microscopia confocal de campo claro. A autofluorescência do colágeno permite a visualização do arcabouço poroso. 10x Scale bar = 200 μm, 20x scale bar = 20 μm. (D) Imagem representativa dos scaffolds embutidos seguida de análise por IHQ com faloidina e DAPI em aumento de 10x, barra de escala = 200 μm. Quadrados internos menores representam imagens ampliadas (20x), barra de escala = 20 μm. Abreviações: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = arcabouços de colágeno suplementados com nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = arcabouços de colágeno suplementados com condroitina-6-sulfato; H&E = hematoxilina e eosina; IHQ = imuno-histoquímica; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig10.jpg"> Figura 10: Expressão de proteínas por células de neuroblastoma cultivadas em arcabouços 3D à base de colágeno em comparação com o plástico 2D. (A) Um esquema de como o ELISA CgA foi realizado em meios condicionados de células cultivadas em scaffolds à base de colágeno 2D ou plástico. (B) Níveis de expressão da proteína CgA obtidos de meios condicionados de células cultivadas em monocamada plástica 2D. Como as células atingiram confluência após 7 dias, o tempo de 14 dias não foi legível. No dia 7 no plástico, não houve diferença significativa nos níveis de CgA entre as linhagens celulares Kelly e KellyCis83. (C) CgA ELISA realizada utilizando meios condicionados de células cultivadas em arcabouços à base de colágeno por 14 dias consecutivos. No dia 7, em ambos os arcabouços de colágeno, os níveis de CgA são mais elevados na linhagem celular KellyCis83, mais agressiva, destacando níveis mais relevantes fisiológicos de CgA na matriz 3D em comparação com a monocamada 2D. Esse valor foi modificado de Curtin et al.17. Abreviações: 3D = tridimensional; 2D = bidimensional; CgA = cromogranina A; ELISA = ensaio imunoenzimático; nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = arcabouços de colágeno suplementados com nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = arcabouços de colágeno suplementados com condroitina-6-sulfato; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; HRP = peroxidase de raiz forte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Este artigo lista as etapas necessárias para semear linhagens celulares de neuroblastoma em arcabouços tridimensionais à base de colágeno previamente descritos, manter o crescimento celular por um período de tempo pré-determinado e recuperar arcabouços para várias análises de crescimento e comportamento celular e aplicações a jusante, adaptáveis para satisfazer uma variedade de objetivos experimentais.

Modelo Biomimético Tridimensional In Vitro de Neuroblastoma Utilizando Arcabouços à Base de Colágeno

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Nosso protocolo oferece um modelo de bioengenharia 3D que afeta de perto o tecido nativo. Isso pode ser potencialmente usado para descobrir novas terapêuticas e biomarcadores para o tratamento e diagnóstico do neuroblastoma. A principal vantagem é que cria condições experimentais fisiologicamente mais relevantes para estudar o microambiente tumoral usando uma técnica reprodutível que atinge a consistência lote a lote.Nosso método de andaime pode ser utilizado, em primeiro lugar, para identificar novas terapêuticas para o neuroblastoma e, em segundo lugar, para incorporar células derivadas do paciente para melhor predição da resposta individual do paciente. Para começar, coloque o andaime armazenado em PBS na capela de fluxo laminar. Use pinças estéreis para levantar suavemente o andaime do canto e pressione contra a parede lateral para remover o excesso de PBS.Em seguida, coloque o andaime com a camada brilhante voltada para baixo no centro do poço de uma placa de 24 poços não aderente. Rotule a placa com detalhes da linha celular, densidade de semeadura e pontos de tempo. Trabalhe com as células de uma densidade de semeadura de cada vez e mantenha as células restantes a 37 graus Celsius na incubadora, até que estejam prontas para uso.Para a fixação da célula no andaime, use uma pipeta P20 com pontas estéreis para misturar completamente a suspensão celular e adicione 20 microlitros da suspensão celular relevante no centro de cada andaime, garantindo que a suspensão da célula permaneça no topo do andaime e não na parede lateral ou base do poço. Deixe as células se ligarem por três a cinco horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. No final da incubação, use uma pipeta P1000 para adicionar lentamente um mililitro de meio de crescimento pré-aquecido a cada poço, evitando o deslocamento dos andaimes, e incube a placa durante a noite.Observe os scaffolds, inicialmente, a cada dois ou três dias para mudanças de cor do meio de crescimento à medida que as células proliferam dentro do scaffold. Use uma pistola de pipeta de 10 mililitros com modo lento para remover e descartar um mililitro do meio gasto do poço. Quando o meio condicionado for usado para o experimento, colete o meio gasto das réplicas biológicas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e espalhe os detritos celulares por centrifugação.Transfira o sobrenadante para um tubo fresco e armazene o tubo a menos 80 graus Celsius. Depois de colocar a pistola de pipeta no modo de gotejamento, adicione suavemente dois mililitros de meio de crescimento pré-aquecido aos andaimes. Incubar a placa contendo o andaime e reabastecer o meio fresco durante o período de crescimento desejado, conforme demonstrado.Na capela de fluxo laminar, esterilize o reagente apropriado do ensaio de viabilidade celular por filtração através de um filtro estéril de 0,2 micrômetro em um tubo de centrífuga. Pré-aqueça a solução estéril, o meio de crescimento completo e o PBS estéril em banho-maria, a 37 graus Celsius. Usando pinças estéreis, transfira os andaimes a serem analisados em uma placa fresca de 24 poços e rotule a placa com todos os detalhes relevantes.Adicione 900 microlitros do meio de crescimento pré-aquecido a cada poço. Em seguida, adicione 100 microlitros do reagente de viabilidade celular estéril a cada poço. Para um controle negativo, adicionar 900 microlitros de meio e 100 microlitros do reagente de viabilidade celular estéril em um poço sem arcabouço.Substitua a tampa da placa e agite suavemente a placa por aproximadamente três minutos para distribuir o reagente de viabilidade celular diluída por todo o poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Após retirar a placa da incubadora, agite-a suavemente por alguns segundos e gere as triplicatas, conforme demonstrado no manuscrito do texto.Gere as triplicatas técnicas transferindo 100 microlitros do meio incubado e reagente de um poço da placa de 24 poços para um poço da placa translúcida de 96 poços, e execute esta etapa um total de três vezes para um poço. Cubra a placa de 96 poços com folha de alumínio para proteger o reagente de viabilidade celular da luz. Retire e descarte os 700 microlitros restantes de meio e reagente dos andaimes na placa de 24 poços.Lave cada andaime duas vezes com um mililitro de PBS estéril. Use um leitor de microplacas para medir a absorbância em 570 e 600 nanômetros e calcular a redução percentual dos reagentes de viabilidade celular de acordo com as recomendações do fabricante. Analisar estatisticamente os resultados de viabilidade celular, utilizando software apropriado.Insira os valores de triplicata biológica para produzir barras de erro e indicar a variabilidade do ensaio. Realizar um teste de análise de variância unidirecional para examinar as mudanças na viabilidade celular ao longo do período experimental usando software bioestatístico apropriado. Indicar diferenças significativas entre os pontos de tempo nos gráficos, conforme descrito no texto manuscrito.A viabilidade de duas linhagens celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas nos scaffolds, foi avaliada. O aumento da densidade celular resultou em maior redução da viabilidade celular reagente com o tempo. O crescimento celular nos scaffolds foi medido indiretamente pela quantificação do DNA extraído dos scaffolds, e as células por amostra foram calculadas.As células IMR32 apresentaram aumento do crescimento, depois as células KellyLuc, com o tempo. A morfologia de crescimento e a distribuição das células nos scaffolds foram avaliadas visualmente pela coloração de hematoxilina, eosina e imunohistoquímica. As células KellyCis83 cresceram mais rápido e infiltraram-se mais profundamente em ambas as composições do andaime do que a linhagem celular Kelly menos invasiva.IMR32 cultivado em nano-hidroxiapatita demonstrou um padrão de crescimento contrastante com grandes aglomerados densamente compactados, ao longo de 14 dias. As características célula-específicas foram monitoradas por coloração imunoistoquímica, seguida de faloidina e DAPI, e a abundância de actina foi observada em células Kelly e KellyCis83 em scaffolds de colágeno-glicosaminoglicanos. Para a avaliação da atividade celular in vitro, os níveis secretados de cromogranina A foram medidos, e as células cultivadas em scaffolds de colágeno-glicosaminoglicano e nano-hidroxiapatita produziram mais cromogranina A em comparação com o crescimento em cultura 2D convencional.A linhagem celular KellyCis83 quimio-resistente secretou mais cromogranina A do que a linhagem celular Kelly. Após a fixação celular, as células podem ser tratadas com várias terapêuticas. Isso forneceria resultados fisiologicamente mais relevantes para a resposta das células a drogas do que a cultura 2D convencional.Essa técnica permite que os pesquisadores explorem melhor como as células cancerosas se comportam e reagem a um estímulo dentro do microambiente tumoral, variando de resposta a terapêutica ou interações com outros tipos celulares.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

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This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Pesquisa do câncer

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

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