Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
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Este trabajo contó con el apoyo del Centro Nacional de Investigación Infantil (NCRC), el Consejo de Investigación Irlandés (IRC) y Neuroblastoma UK. Las ilustraciones fueron creadas con BioRender.

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El modelo 3D de células cancerosas de andamio ha demostrado ser una herramienta valiosa y versátil para obtener información mecanicista sobre el crecimiento, la viabilidad y la infiltración de células de neuroblastoma en un TME32 simplificado. El modelo de neuroblastoma 3D descrito aquí imita la EMT mínima y proporciona datos fisiológicamente más relevantes que un cultivo monocapa 2D. Uno de los principales inconvenientes del cultivo celular en 3D es el aumento de la complejidad experimental y los plazos más largos. Aquí se describe un protocolo optimizado para la siembra, el crecimiento y el mantenimiento de células de neuroblastoma en andamios basados en colágeno, seguido de análisis y aplicaciones posteriores, lo que produce una caracterización sólida del crecimiento celular. Nuestro objetivo era obtener información sobre la densidad óptima de siembra celular para los andamios con el fin de crear un entorno predecible y controlable para evaluar los tratamientos farmacológicos contra el cáncer en una ventana experimental expedita de 14 días. La combinación de todos estos protocolos simples descritos proporciona una evaluación completa del crecimiento de células de neuroblastoma en el sistema de cultivo in vitro basado en andamios.
Se ha hecho hincapié en los puntos críticos en la configuración del protocolo para permitir a los científicos establecer lo mismo en sus laboratorios rápidamente. Por ejemplo, los tiempos de incubación indicados para un mejor rendimiento del ensayo colorimétrico de viabilidad celular permiten una penetración más profunda del reactivo en los poros del andamio para llegar a todas las células. Además, la técnica de tinción fluorescente de dsDNA es robusta y sencilla; sin embargo, la liberación de ADN de los andamios requiere una lisis celular vigorosa, ya que las células están "atrapadas" dentro de las fibras de colágeno.
Utilizando el ensayo simple de cuantificación de ADN descrito, podemos identificar la fase de crecimiento logarítmico en andamios basados en colágeno para el cribado de fármacos anticancerígenos utilizando este modelo. En el entorno experimental descrito, se utilizaron 4 densidades iniciales de siembra celular con un período general de 14 días y puntos de tiempo de análisis en los días 1, 7 y 14. Identificamos que las células KellyLuc sembradas a las 4 × 105 células/andamio tienen la ventana de proliferación más activa entre los días 7 y 14. Estos datos de crecimiento de la fase logarítmica permitirán una interpretación fiable de varios experimentos de citotoxicidad celular. Elimina la especulación sobre cualquier disminución en el crecimiento o la muerte celular como resultado del crecimiento suprimido en la plataforma porosa 3D en lugar de las toxicidades de los medicamentos. La viabilidad celular también es una evaluación ampliamente utilizada para la idoneidad de las plataformas 3D para apoyar el crecimiento de diferentes tipos de células33,34. Si bien existen muchos ensayos para medir la viabilidad celular, incluida la tinción de células vivas/muertas, la medición de ATP y los ensayos de proliferación, encontramos que el uso del ensayo colorimétrico de viabilidad celular Alamar Blue es una técnica simple y efectiva para respaldar los datos de cuantificación de ADN.
El uso combinado de la cuantificación del ADN y la viabilidad celular proporcionó evidencia complementaria de que, en promedio, la densidad óptima de las células semilla en el andamio para lograr un crecimiento continuo durante un período de 14 días es de 2 a 4 × 105 células/andamio. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar fácilmente para satisfacer diferentes marcos temporales experimentales, puntos temporales de análisis y aplicaciones posteriores. Aunque este protocolo describe la evaluación del crecimiento celular de monocultivo de células de neuroblastoma en andamios, los andamios son fácilmente modificables para su uso como plataforma para el cocultivo, descrito por do Amaral et al., quienes utilizaron andamios de colágeno-GAG para cocultivar queratinocitos y fibroblastos en una investigación de cicatrización de heridas35.
El modelo 3D descrito permite la visualización del crecimiento y la infiltración celular utilizando diferentes técnicas bien conocidas, como la inmunofluorescencia y la H&E estándar. Es importante visualizar las células junto con la caracterización del crecimiento mediante ensayos bioquímicos debido a la diversidad de la morfología celular y los patrones de crecimiento en los andamios. Comprender el patrón de crecimiento puede proporcionar información sobre el comportamiento de crecimiento y la respuesta futura a los medicamentos contra el cáncer. Por ejemplo, el crecimiento de IMR32 mediante la cuantificación del ADN produce patrones similares a los de Kelly, aunque tras la visualización mediante H&E, IMR32 crece en grupos más grandes que Kelly, que mostró un crecimiento más disperso (Figura 9). Estos variados patrones de crecimiento de las líneas celulares en andamios reflejan el escenario clínico de la heterogeneidad tumoral. El examen de la respuesta a los medicamentos contra el cáncer mediante un panel de líneas celulares con diferentes morfologías en andamios 3D aumentará el valor predictivo de la respuesta del paciente a los mismos fármacos.
La detección de la expresión génica o proteica también se puede realizar mediante otros enfoques, como RT-qPCR o ELISA, si se secreta la proteína de interés. Se utilizó un marcador sustituto de la progresión del neuroblastoma, la cromogranina A (CgA)36, para caracterizar adicionalmente el crecimiento de células de neuroblastoma en 3D. Como se describió en trabajos anteriores17, la secreción de CgA aumentó a medida que proliferaban las células (Figura 10). Si bien el cultivo celular monocapa no pudo capturar este aumento, ya que la proliferación significó que las células alcanzaron la confluencia completa en las placas de cultivo, el uso de los andamios de colágeno 3D permitió una evaluación prolongada de la secreción de CgA.
Es posible que este modelo in vitro 3D no sea adecuado para todas las preguntas de investigación para estudiar la biología del neuroblastoma y la respuesta a la terapéutica. Una de las limitaciones es la penetración desigual de las células dentro de los andamios y la formación de grupos celulares de tamaño variable, lo que depende de una línea celular determinada y puede conducir a una difusión incontrolable de nutrientes y fármacos de prueba. Esta característica afecta a la robustez en el cribado terapéutico. Sin embargo, a pesar de esta limitación, es importante tener en cuenta que los tumores nativos también son heterogéneos en tamaño y distribución de células cancerosas y contienen muchos otros tipos de células dentro del tejido tumoral. Para superar esta limitación, proponemos el uso de cada andamio poblado de células como un único microtejido para el que se optimizarán los siguientes parámetros: (a) tiempos de incubación para que el reactivo de viabilidad celular llegue a las células y grupos celulares, y (b) lisis de las células en tampón Triton X-100 mediante el preprocesamiento de células en andamios con un lisador de tejidos para liberar el ADN de las células contenidas en las profundidades del andamio.
Otra limitación técnica de este protocolo es la falta de pruebas mecánicas de cada lote de andamios de nueva fabricación para este modelo. Sin embargo, el uso del robusto proceso de fabricación de los andamios, que se han caracterizado ampliamente en relación con las propiedades físicas y químicas de los andamios, como el módulo de compresión y tracción, la porosidad y la estructura visual de los poros, y la homogeneidad, garantiza que las cualidades de los andamios se mantengan a través de los lotes 21,24,27,30,37.
En resumen, este trabajo presenta una serie de métodos sencillos para el análisis del crecimiento celular en andamios basados en colágeno. Tanto la línea de tiempo experimental como los puntos de análisis pueden intercambiarse en función de las preguntas de investigación específicas. Este protocolo también es adaptable a otros tipos de células. Los resultados mostrados anteriormente proporcionan evidencia sobre cómo esta compilación de métodos dio una idea de la densidad de siembra óptima para varias líneas celulares de neuroblastoma para crear un crecimiento continuo durante 14 días. La amalgama de resultados obtenidos de todos los métodos de este protocolo proporciona una comprensión superior del crecimiento celular dentro de la matriz de colágeno 3D. Es probable que la utilización futura de este modelo incluya sistemas de cocultivo específicos para el neuroblastoma TME y la prueba de varios medicamentos nuevos contra el cáncer.

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The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

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Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

El neuroblastoma es un cáncer pediátrico del sistema nervioso simpático que surge durante el desarrollo embrionario o en las primeras etapas de la vida postnatal debido a la transformación de las células de la cresta neural1. Es el tumor extracraneal sólido más frecuente en niños, representa el 8% de las neoplasias malignas diagnosticadas en pacientes menores de 15 años y es responsable del 15% de todas las muertes por cáncer infantil. La enfermedad muestra comportamientos clínicos muy heterogéneos debido a alteraciones cromosómicas, genéticas y epigenéticas específicas, y características histopatológicas.
Estas alteraciones contribuyen a la agresividad del neuroblastoma y a los malos resultados en los pacientes pediátricos. Por lo tanto, las terapias actuales resultan ineficaces a largo plazo para casi el 80% de los pacientes con la enfermedad clínicamente agresiva2, lo que pone de manifiesto el hecho de que el tratamiento para este grupo de pacientes sigue siendo un desafío. Es probable que esto se deba a que los mecanismos de la heterogeneidad del neuroblastoma y las metástasis aún no se comprenden completamente. Sin embargo, ahora se cree ampliamente que el microambiente tumoral (TME, por sus siglas en inglés) desempeña un papel en la progresión de muchos cánceres; sin embargo, sigue siendo poco estudiado en el neuroblastoma 3,4.
El TME nativo es un microambiente 3D complejo que involucra células cancerosas y no cancerosas rodeadas por una MEC. La MEC se refiere al componente acelular de un tejido que proporciona soporte estructural y bioquímico a sus residentes celulares y contribuye a la progresión de la enfermedad, el pronóstico del paciente y la respuesta terapéutica5. Esta promoción de la progresión de la enfermedad se debe a la "reciprocidad dinámica" o comunicación bidireccional continua entre las células y la MEC 6,7,8. A medida que el cáncer progresa, el colágeno del estroma se reorganiza a menudo en patrones lineales perpendiculares a la interfaz estroma-cáncer, que las células cancerosas utilizan como ruta migratoria hacia la metástasis 9,10,11.
Los principales componentes de este andamio biológico funcional nativo incluyen una red fibrosa de colágenos tipo I y II y otras proteínas, incluyendo elastina, glicoproteínas como la laminina, así como una serie de proteoglicanos y otros componentes solubles12,13. Estas proteínas de la MEC nativa se han convertido en biomoléculas naturales atractivas para el desarrollo de modelos in vitro 3D 3D3. La aplicación de andamios 3D para el cultivo celular in vitro es cada vez más popular debido a su mayor representación fisiológica de la EMT en comparación con el cultivo tradicional de monocapa 2D. Los andamios 3D fabricados ayudan a la adhesión, proliferación, migración, metabolismo y respuesta celular a los estímulos observados en los sistemas biológicos in vivo.
El componente principal de estos andamios 3D es el colágeno, que es un actor clave en muchos procesos biológicos normales, incluida la reparación de tejidos, la angiogénesis, la morfogénesis de tejidos, la adhesión celular y la migración11. Las matrices 3D basadas en colágeno han demostrado su robusta funcionalidad para modelar la MEC, sirviendo como un microambiente biomimético in vitro al tiempo que permite las interacciones célula-MEC, así como la migración e invasión celular. Estas matrices 3D también proporcionan un análisis más preciso de la respuesta celular a los fármacos quimioterapéuticos que el cultivo tradicional 2D o "plano" en muchos modelos de cáncer 14,15,16, incluido el neuroblastoma 17,18. El análisis genético de cultivos celulares 3D ha reportado una mayor correlación con el perfil de tejido humano, incluso en comparación con modelos animales19. En general, la piedra angular de estos andamios 3D es proporcionar a las células un entorno in vitro adecuado, que recapitule la arquitectura del tejido nativo y facilite la diafonía molecular bidireccional8.
Para aumentar la complejidad de los modelos basados en colágeno, se incorporan otros componentes comunes de la MEC en el proceso de ingeniería de tejidos, creando así modelos más relevantes desde el punto de vista fisiológico para reflejar las TME de nicho de diferentes tejidos. Por ejemplo, los GAG, polisacáridos cargados negativamente presentes en todos los tejidos de los mamíferos20, facilitan la adhesión, migración, proliferación y diferenciación celular. El sulfato de condroitina es un tipo específico de GAG que se encuentra en el hueso y el cartílago, que se ha utilizado anteriormente en aplicaciones de ingeniería de tejidos para la reparación ósea 21,22,23,24,25. La nanohidroxiapatita (nHA) es el principal constituyente inorgánico de la composición mineral de los tejidos óseos humanos, constituyendo hasta el 65% del hueso en peso26 y, por lo tanto, se utiliza ampliamente para el reemplazo y la regeneración ósea27. Por lo tanto, los GAG y la nHA son compuestos atractivos para reconstruir la MEC del neuroblastoma primario y modelar los sitios metastásicos más comunes de neuroblastoma, médula ósea (70,5%) y hueso (55,7%)28.
Los andamios que incorporan estos componentes de ECM se desarrollaron originalmente para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos con un análisis exhaustivo de su biocompatibilidad, toxicidad y características osteoconductoras y osteoinductivas29,30. Son matrices porosas a base de colágeno producidas mediante técnicas de liofilización para controlar sus propiedades físicas y biológicas. Los andamios de colágeno suplementados con nHA (Coll-I-nHA) o condroitina-6-sulfato (Coll-I-GAG) demostraron tener éxito en la imitación de la EMT primaria en el cáncer de mama31 y la metástasis ósea en el cáncer de próstata15, así como en el neuroblastoma17. La técnica de liofilización utilizada para fabricar estos andamios compuestos produce una homogeneidad reproducible en el tamaño de los poros y la porosidad dentro de los andamios22,23,24. Brevemente, se fabrica una suspensión de colágeno (0,5% en peso) mezclando colágeno fibrilar con ácido acético 0,05 M. En el caso de Coll-I-GAG, se añade un 0,05% en peso de condoitina-6-sulfato aislado del cartílago de tiburón a la suspensión de colágeno durante la mezcla. Para los andamios compuestos Coll-I-nHA, las partículas de hidroxiapatita de tamaño nanométrico se sintetizan como se describió anteriormente27 y se agregan a la suspensión de colágeno en una proporción de 2:1 con respecto al peso del colágeno durante el proceso de mezcla. Todos los andamios se reticulan físicamente y se esterilizan mediante un tratamiento deshidrotérmico a 105 °C durante 24 h25. Los andamios cilíndricos (6 mm de diámetro, 4 mm de altura) se obtienen utilizando un punzón de biopsia y pueden ser reticulados químicamente con 3 mM de Clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida y 5,5 mM de N-hidroxisuccinimida (EDAC/NHS) en agua destilada (dH2O) para mejorar las propiedades mecánicas de las construcciones30. Este proceso de fabricación bien optimizado de dos andamios de colágeno crea andamios con propiedades mecánicas reproducibles, incluido el tamaño de los poros, la porosidad y la rigidez (kPa). Tanto los andamios Coll-I-GAG como los Coll-I-nHA tienen diferentes propiedades físicas, lo que crea diferentes condiciones ambientales. Las propiedades de cada andamio se muestran en la Tabla 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Coll-I-GAG</td>
			<td>Coll-I-nHA</td>
		</tr><tr><td>Tamaño del andamio (diámetro [mm] x altura [mm])</td>
			<td>6 x 4 17</td>
			<td>6 x 4 17</td>
		</tr><tr><td>Concentración de colágeno (% en peso)</td>
			<td>0.5 17</td>
			<td>0.5 17</td>
		</tr><tr><td>Concentración de sustrato (% en peso) [basado en el peso del colágeno]</td>
			<td>0.05 15,17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>Tamaño medio de los poros (mm)</td>
			<td>96 22</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>Porosidad (%)</td>
			<td>99,5 23</td>
			<td>98,9 – 99,4 27</td>
		</tr><tr><td>Rigidez (kPa)</td>
			<td>1.5 27</td>
			<td>5,5 - 8,63 29</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Resumen de las propiedades mecánicas de los dos andamios adoptados para el estudio de la biología del neuroblastoma.
En este artículo se describe un protocolo de ensamblaje de un sistema basado en andamios 3D para imitar mejor el microambiente del neuroblastoma utilizando líneas celulares de neuroblastoma y andamios basados en colágeno previamente descritos suplementados con nHA (Coll-I-nHA) o condroitina-6-sulfato (Coll-I-GAG). El protocolo incluye métodos posteriores para analizar los mecanismos de crecimiento de las células de neuroblastoma en un entorno fisiológicamente más relevante utilizando métodos de bajo costo previamente optimizados y adaptados del cultivo de monocapa 2D Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo general del protocolo. (A) Las células se cultivan hasta un número suficiente, se dividen, se cuentan y se vuelven a suspender en un volumen apropiado de medio. (B) A continuación, este material celular se somete a una dilución en serie para preparar un total de 4 suspensiones celulares de diferentes densidades. (C) Los andamios a base de colágeno se siembran estérilmente en placas de 24 pocillos no adherentes, y (D) se agregan 20 μL de suspensión celular al centro de cada andamio y se dejan incubar a 37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad durante 3-5 h. (E) Luego se agrega lentamente un medio de crecimiento completo (1 mL) a cada andamio y las placas se vuelven a colocar en la incubadora para permitir el crecimiento celular durante el período de tiempo deseado. (F) En cada punto de tiempo predeterminado, se recuperan varios andamios para la evaluación de la viabilidad y el crecimiento celular, el análisis de la expresión génica y la tinción histológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más común en los niños, y representa el 15 % de las muertes totales por cáncer pediátrico. El tejido tumoral nativo es un microambiente complejo tridimensional (3D) que involucra capas de células cancerosas y no cancerosas rodeadas por una matriz extracelular (MEC). La MEC proporciona apoyo físico y biológico y contribuye a la progresión de la enfermedad, el pronóstico del paciente y la respuesta terapéutica.
En este artículo se describe un protocolo para ensamblar un sistema basado en andamios 3D para imitar el microambiente del neuroblastoma utilizando líneas celulares de neuroblastoma y andamios basados en colágeno. Los andamios se complementan con nanohidroxiapatita (nHA) o glicosaminoglicanos (GAG), que se encuentran naturalmente en altas concentraciones en el hueso y la médula ósea, los sitios metastásicos más comunes del neuroblastoma. La estructura porosa 3D de estos andamios permite la adhesión, proliferación y migración de las células del neuroblastoma, así como la formación de grupos celulares. En esta matriz 3D, la respuesta celular a la terapéutica refleja mejor la situación in vivo .
El sistema de cultivo basado en andamios puede mantener densidades celulares más altas que el cultivo celular bidimensional (2D) convencional. Por lo tanto, los protocolos de optimización para el número inicial de células de siembra dependen de los plazos experimentales deseados. El modelo se monitorea evaluando el crecimiento celular a través de la cuantificación del ADN, la viabilidad celular a través de ensayos metabólicos y la distribución celular dentro de los andamios a través de la tinción histológica.
Las aplicaciones de este modelo incluyen la evaluación de perfiles de expresión de genes y proteínas, así como pruebas de citotoxicidad utilizando fármacos convencionales y miARN. El sistema de cultivo 3D permite la manipulación precisa de los componentes celulares y de la MEC, creando un entorno fisiológicamente más similar al tejido tumoral nativo. Por lo tanto, este modelo 3D in vitro permitirá avanzar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y mejorar la correlación entre los resultados obtenidos in vitro, in vivo en modelos animales y sujetos humanos.

El modelo de andamio basado en colágeno que se describe aquí tiene muchas aplicaciones que van desde el estudio de la biología del neuroblastoma hasta el cribado de terapias contra el cáncer en un entorno fisiológicamente más similar a los tumores nativos que el cultivo celular 2D convencional. Antes de probar una pregunta de investigación determinada, es crucial obtener una caracterización completa de la adhesión, proliferación e infiltración celular dentro del marco de tiempo experimental deseado. Las condiciones de crecimiento dependerán de la biología de cada línea celular específica. Es importante destacar que se deben implementar varios métodos de evaluación del crecimiento celular para determinar las condiciones óptimas y el rendimiento robusto.
En este caso, se evaluó la viabilidad de las células de neuroblastoma cultivadas en andamios mediante un ensayo de viabilidad celular colorimétrico. Este ensayo se puede realizar con la frecuencia que se desee durante todo el período de tiempo experimental. Para el experimento descrito, se realizó una evaluación de la viabilidad celular en los días 1, 7 y 14 para dos líneas celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas en andamios Coll-I-nHA a 4 densidades diferentes (Figura 6). La viabilidad del día 1 se estableció como línea de base para comparar todas las mediciones posteriores. La tasa de reducción del reactivo de viabilidad celular refleja la biología celular y las características de crecimiento de las líneas celulares individuales, incluidas sus tasas de proliferación y metabolismo. Se esperaba una correlación entre el número de células sembradas en los andamios y el nivel de reducción. En este experimento, la reducción del reactivo de viabilidad celular generalmente aumentó con cada punto de tiempo para ambas líneas celulares en todas las densidades, como se esperaba.
A continuación, se evaluó cada densidad individualmente para ambas líneas celulares con el fin de comparar la reducción a través de los puntos temporales. Se realizó un ANOVA de un factor con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para detectar diferencias significativas en la reducción entre puntos de tiempo (Figura 7). Tanto para las líneas celulares como para todas las densidades de siembra, hubo un aumento significativo (P<0,05) en la reducción del reactivo de viabilidad celular al comparar el día 1 y el día 14. Esto indicó un aumento significativo de las células metabólicamente activas presentes en los andamios. Este incremento no fue significativo en todos los casos al evaluar los intervalos de 7 días (día 1 vs. día 7, día 7 vs. día 14), demostrando la importancia de la optimización de la densidad de siembra para lograr la ventana de crecimiento deseada.
Para respaldar los resultados del ensayo de viabilidad celular, el crecimiento celular en andamios también se puede medir indirectamente a través de la cuantificación de dsDNA extraído de andamios utilizando una tinción fluorescente de dsDNA (Figura 8A). Al igual que la viabilidad celular, la cuantificación del ADN se puede realizar con la frecuencia que se desee dentro de la línea de tiempo experimental. Sin embargo, este análisis requiere la recuperación completa de los andamios y la terminación del crecimiento celular, por lo que debe tenerse en cuenta en la planificación experimental, como se discutió en la sección 1. Para este experimento, se cuantificó el ADN en los días 1, 7 y 14 para dos líneas celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas en andamios Coll-I-nHA a 4 densidades diferentes. Como se conoce la concentración media de dsDNA por célula para estas líneas celulares, fue posible derivar el número de células por muestra a partir del ADN cuantificado (Figura 8B).
La cuantificación del ADN dio lugar a una mayor variabilidad entre las réplicas biológicas que la evaluación de la viabilidad celular, pero en general aumentó para cada punto de tiempo, con los niveles más altos cuantificados en el día 14. Las células IMR32 parecen alcanzar un mayor número de células en los andamios Coll-I-nHA, como lo indica la concentración de ADN, que las células KellyLuc. A continuación, se evaluó individualmente cada densidad para las dos líneas celulares con el fin de comparar la reducción a través de los puntos temporales. Se realizó un ANOVA de un factor con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para detectar diferencias significativas en la reducción entre puntos de tiempo (Figura 8B).
Tanto para las líneas celulares como para todas las densidades de siembra, hubo un aumento significativo (P<0.05) en el número de células cuando se compararon el día 1 y el día 14, con la excepción de KellyLuc en la densidad de siembra 4 (1 × 105 células/andamio), que no produjo aumentos significativos en ninguno de los puntos de tiempo. Al igual que los resultados de viabilidad celular, los aumentos no fueron significativos en todos los casos al evaluar los intervalos de 7 días (día 1 vs. día 7, día 7 vs. día 14). Al comparar las tendencias de los puntos de tiempo para la viabilidad celular y la cuantificación del ADN, hubo algunas ligeras diferencias entre los dos análisis. Sin embargo, se observaron tendencias similares en general, con valores medios que aumentaron entre intervalos de 7 días para la mayoría de las densidades. Esto demuestra la importancia de monitorear el crecimiento celular utilizando más de un método.
A continuación, se implementó una evaluación visual de la morfología y distribución del crecimiento celular en los andamios, que abarcó la tinción tradicional de hematoxilina y eosina (H&E), así como la IHQ. Se espera que los diferentes patrones de crecimiento de las líneas celulares individuales conduzcan a una variada disposición espacial en los andamios, incluyendo diferentes grados de penetración en el andamio y agrupamiento celular. Los andamios se fijaron en formol, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 mm (Figura 9A), preparando los andamios para múltiples técnicas de visualización, incluida la tinción histológica y la IHQ.
La tinción rutinaria de H&E se aplicó a las células Kelly, KellyCis83 e IMR32 cultivadas en andamios a base de colágeno en los días 1, 7 y 14 (Figura 9B). Esto permitió la visualización de la orientación espacial de las células en dos andamios basados en colágeno durante un período de 14 días. Las células Kelly sensibles al cisplatino y las células KellyCis83 resistentes se cultivaron en andamios Coll-I-nHA (Figura 9B, i) y Coll-I-GAG (Figura 9B, ii). De acuerdo con los datos publicados anteriormente, las células KellyCis83 crecieron a un ritmo más alto y se infiltraron más profundamente en ambas composiciones de andamios que la línea celular Kelly menos invasiva. La tinción H&E de otra línea celular de neuroblastoma, IMR32, cultivada en Coll-I-nHA muestra un patrón de crecimiento contrastante (Figura 9B, iii). Esta línea celular creció en racimos grandes y densamente empaquetados en los andamios de colágeno durante un período de 14 días. La microscopía confocal de campo claro se puede utilizar para visualizar la arquitectura porosa de los andamios a base de colágeno (Figura 9C) debido a la autofluorescencia de las fibras de colágeno.
Tiñimos células con faloidina dirigida a la actina citoesquelética y la contratinción nuclear, 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), para monitorizar rasgos celulares específicos a lo largo de la línea de tiempo experimental. Se observó una abundancia de actina en las células de Kelly y KellyCis83 en andamios Coll-I-GAG utilizando esta técnica (Figura 9D). Estos resultados demuestran cómo se pueden utilizar múltiples técnicas de imagen para obtener información resuelta espacialmente a partir de células de neuroblastoma cultivadas en andamios utilizando este protocolo. Esta caracterización de los patrones de crecimiento celular en andamios basados en colágeno durante un período determinado mejorará la comprensión e interpretación de cualquier ensayo bioquímico posterior.
La expresión de proteínas por células cultivadas en andamios basados en colágeno se puede analizar para comparar la actividad celular con escenarios in vivo . Los datos publicados anteriormente examinaron la expresión de cromogranina A (CgA) como marcador sustituto secretado de neuroblastoma por células KellyLuc y KellyCis83Luc cultivadas en monocapas celulares, así como en andamios Coll-I-nHA y Coll-I-GAG (Figura 10). La CgA se evaluó en los medios acondicionados mediante un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) (Figura 10A). La CgA se secreta a una tasa más alta en la línea celular KellyCis83 resistente a la quimioterapia más agresiva que en Kelly (Figura 10B, C). Esto fue significativo en el día 7 en los andamios Coll-I-GAG y Coll-I-nHA (P<0.05), mientras que no hubo diferencias significativas en este punto de tiempo para las células cultivadas como monocapa por cultivo 2D convencional.
Estos resultados también ponen de relieve la línea de tiempo experimental restringida cuando se cultivan células en una monocapa, con solo 7 días de crecimiento que resultan factibles antes de que las células alcancen la confluencia. El crecimiento de las células en andamios supera esta limitación, ya que pueden mantenerse durante un período más largo en condiciones fisiológicamente más relevantes. La combinación anterior de técnicas para adquirir información sobre la viabilidad celular, el contenido de ADN, la morfología celular y la disposición espacial, y los perfiles de expresión facilita la evaluación del crecimiento de las células de neuroblastoma en una variedad de andamios basados en colágeno. Este protocolo también se puede adaptar fácilmente para satisfacer los requisitos experimentales específicos y las aplicaciones deseadas.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig06.jpg"> Figura 6: Análisis de viabilidad celular. (A) Procedimiento general para medir la viabilidad de las células de neuroblastoma en andamios basados en colágeno mediante un ensayo de viabilidad celular colorimétrico. El período de incubación debe optimizarse para cada nueva línea celular, haciendo referencia a las pautas del fabricante. (B) Reducción porcentual del reactivo de viabilidad celular por células KellyLuc e IMR32 cultivadas en andamios Coll-I-nHA a cuatro densidades de siembra iniciales diferentes, medidas en los días 1, 7 y 14. Las muestras se evaluaron por triplicado biológico con barras de error que representan la desviación estándar. Abreviaturas: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig07.jpg"> Figura 7: Viabilidad celular por densidad de siembra para células cultivadas en Coll-I-nHA durante un período de 14 días. (A) KellyLuc; (B) IMR32. Los números de celda titulados se refieren a la densidad inicial de siembra de celdas en los andamios en el día 0. Las muestras se evaluaron por triplicado biológico, indicado por puntos triplicados, con barras que representan la media. Se utilizó ANOVA de un factor con comparaciones múltiples para detectar diferencias significativas en el porcentaje de reducción del reactivo de viabilidad celular en los tres puntos temporales, anotados en los gráficos (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abreviaturas: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA; ANOVA = análisis de varianza; ns = no significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig08.jpg"> Figura 8: Cuantificación del ADN extraído de células en andamios. (A) Proceso de cuantificación de dsDNA de células cultivadas en andamios a base de colágeno utilizando una tinción fluorescente de dsDNA. (B) Número de células del análisis de cuantificación de ADN por densidad de siembra para células KellyLuc e IMR32 cultivadas en Coll-I-nHA durante un período de 14 días. Los números de celda titulados se refieren a la densidad inicial de siembra de células en andamios en el día 0. Las muestras se evaluaron por triplicado biológico, indicado por puntos triplicados, con barras que representan la media. Se utilizó ANOVA de un factor con comparaciones múltiples para detectar diferencias significativas en el número de células en los tres puntos de tiempo, anotados en los gráficos (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abreviaturas: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA; dsDNA = ADN bicatenario; TE = Tris-EDTA; ANOVA = análisis de varianza; ns = no significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig09.jpg"> Figura 9: Pasos de procesamiento de tejidos para el análisis inmunohistoquímico de andamios. (A) Representación esquemática del protocolo para el procesamiento de andamios para el análisis de imágenes. Este proceso permite la tinción histológica rutinaria y el sondeo de anticuerpos específicos utilizando anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. (B) Imágenes representativas de tres líneas celulares de neuroblastoma sometidas a tinción de H&E. Las imágenes de H&E se toman en los días 1, 7 y 14 para monitorear los patrones de crecimiento durante el transcurso del experimento. Barra de escala = 200 μm. Los cuadrados discontinuos representan el área elegida para las imágenes ampliadas 20x en el borde inferior izquierdo. Barra de escala = 20 μm. (i y ii) H&E de las líneas celulares de neuroblastoma Kelly y KellyCis83 (paneles superior e inferior, respectivamente) en dos tipos de andamios a base de colágeno. (iii) H&E de la línea celular IMR32, que representa el crecimiento celular agrupado en el andamio Coll-I-nHA. (C) Imagen representativa de la línea celular de Kelly, sometida a microscopía confocal de campo claro. La autofluorescencia de colágeno permite la visualización del andamio poroso. Barra de escala 10x = 200 μm, barra de escala 20x = 20 μm. (D) Imagen representativa de andamios incrustados seguida de análisis por IHQ con faloidina y DAPI a 10x aumento, barra de escala = 200 μm. Los cuadrados interiores más pequeños representan imágenes ampliadas (20x), barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = andamios de colágeno suplementados con condroitina-6-sulfato; H&E = hematoxilina y eosina; IHQ = inmunohistoquímica; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig10.jpg"> Figura 10: Expresión de proteínas por células de neuroblastoma cultivadas en andamios 3D basados en colágeno en comparación con plástico 2D. (A) Un esquema de cómo se realizó el ELISA CgA en medios acondicionados de células cultivadas en andamios 2D de plástico o 3D basados en colágeno. (B) Niveles de expresión de la proteína CgA tomados de medios acondicionados de células cultivadas en una monocapa de plástico 2D. Como las células alcanzaron la confluencia después de 7 días, el punto de tiempo de 14 días no era legible. Para el día 7 en plástico, no hubo diferencias significativas en los niveles de CgA entre las líneas celulares Kelly y KellyCis83. (C) ELISA CgA realizado utilizando medios acondicionados de células cultivadas en andamios a base de colágeno durante 14 días consecutivos. En el día 7, en ambos andamios de colágeno, los niveles de CgA son más altos en la línea celular KellyCis83 más agresiva, lo que pone de manifiesto niveles fisiológicamente más relevantes de CgA en la matriz 3D en comparación con la monocapa 2D. Esta figura ha sido modificada a partir de Curtin et al.17. Abreviaturas: 3D = tridimensional; 2D = bidimensional; CgA = cromogranina A; ELISA = ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas; nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = andamios de colágeno suplementados con condroitina-6-sulfato; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbencidina; HRP = peroxidasa de rábano picante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Este artículo enumera los pasos necesarios para sembrar líneas celulares de neuroblastoma en andamios tridimensionales basados en colágeno descritos anteriormente, mantener el crecimiento celular durante un período de tiempo predeterminado y recuperar andamios para varios análisis de crecimiento y comportamiento celular y aplicaciones posteriores, adaptables para satisfacer una variedad de objetivos experimentales.

Modelo biomimético tridimensional in vitro de neuroblastoma con andamios basados en colágeno

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Nuestro protocolo ofrece un modelo de bioingeniería en 3D que afecta de cerca al tejido nativo. Esto se puede utilizar potencialmente para descubrir nuevas terapias y biomarcadores para el tratamiento y el diagnóstico del neuroblastoma. La principal ventaja es que crea condiciones experimentales fisiológicamente más relevantes para estudiar el microambiente tumoral mediante una técnica reproducible que consigue consistencia lote a lote.Nuestro método de andamiaje se puede utilizar, en primer lugar, para identificar nuevas terapias para el neuroblastoma y, en segundo lugar, para incorporar células derivadas del paciente para una mejor predicción de la respuesta individual del paciente. Para comenzar, coloque el andamio almacenado en PBS en la campana de flujo laminar. Use pinzas estériles para levantar suavemente el andamio de la esquina y presione contra la pared lateral para eliminar el exceso de PBS.Luego coloque el andamio con la capa brillante hacia abajo en el centro del pocillo de una placa de 24 pocillos no adherente. Etiquete la placa con detalles de la línea celular, la densidad de siembra y los puntos de tiempo. Trabaje con las celdas de una densidad de siembra a la vez y mantenga las celdas restantes a 37 grados centígrados en la incubadora, hasta que estén listas para su uso.Para la fijación de la célula en el andamio, utilice una pipeta P20 con puntas estériles para mezclar bien la suspensión celular y agregue 20 microlitros de la suspensión celular correspondiente en el centro de cada andamio, asegurándose de que la suspensión celular permanezca en la parte superior del andamio y no en la pared lateral o la base del pozo. Deje que las celdas se adhieran durante tres a cinco horas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de humedad. Al final de la incubación, use una pipeta P1000 para agregar lentamente un mililitro de medio de crecimiento precalentado a cada pocillo, evitando el desplazamiento de los andamios, e incube la placa durante la noche.Observe los andamios, inicialmente, cada dos o tres días para ver si hay cambios de color en el medio de crecimiento a medida que las células proliferan dentro del andamio. Utilice una pistola de pipetas de 10 mililitros con modo lento para retirar y desechar un mililitro del medio gastado del pocillo. Cuando se utilice el medio acondicionado para el experimento, recoja el medio gastado de las réplicas biológicas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros y desgaste los restos celulares por centrifugación.Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Después de configurar la pistola de pipetas en el modo de goteo, agregue suavemente dos mililitros de medio de crecimiento precalentado a los andamios. Incubar la placa que contiene el andamio y reponer el medio fresco durante el período de crecimiento deseado, como se demuestra.En la campana de flujo laminar, esterilice el reactivo de ensayo de viabilidad celular adecuado mediante filtración a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros en un tubo de centrífuga. Precaliente la solución estéril, el medio de crecimiento completo y el PBS estéril en el baño de agua, a 37 grados centígrados. Con pinzas estériles, transfiera los andamios que se analizarán en una placa nueva de 24 pocillos y etiquete la placa con todos los detalles relevantes.Agregue 900 microlitros del medio de cultivo precalentado a cada pocillo. A continuación, añada 100 microlitros del reactivo de viabilidad celular estéril a cada pocillo. Para un control negativo, añadir 900 microlitros de medio y 100 microlitros del reactivo de viabilidad celular estéril en un pocillo sin andamio.Vuelva a colocar la tapa en la placa y muévala suavemente durante aproximadamente tres minutos para distribuir el reactivo de viabilidad celular diluido por todo el pocillo. Incubar la placa a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de humedad. Después de retirar la placa de la incubadora, balancee suavemente la placa durante unos segundos y genere los triplicados, como se muestra en el manuscrito del texto.Genere los triplicados técnicos transfiriendo 100 microlitros del medio incubado y el reactivo de un pocillo de la placa de 24 pocillos a un pocillo de la placa translúcida de 96 pocillos, y realice este paso un total de tres veces para un pocillo. Cubra la placa de 96 pocillos con papel de aluminio para proteger el reactivo de viabilidad celular de la luz. Retire y deseche los 700 microlitros restantes de medio y reactivo de los andamios en la placa de 24 pocillos.Lave cada andamio dos veces con un mililitro de PBS estéril. Utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia a 570 y 600 nanómetros, y calcule el porcentaje de reducción de los reactivos de viabilidad celular según las recomendaciones del fabricante. Analizar estadísticamente los resultados de viabilidad celular, utilizando el software adecuado.Introduzca los valores biológicos por triplicado para producir barras de error e indicar la variabilidad del ensayo. Realizar una prueba de análisis de varianza unidireccional para examinar los cambios en la viabilidad celular durante el período de tiempo experimental utilizando un software bioestadístico adecuado. Indique diferencias significativas entre los puntos de tiempo en los gráficos, como se describe en el manuscrito del texto.Se evaluó la viabilidad de dos líneas celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas en los andamios. El aumento de la densidad celular dio lugar a una mayor reducción del reactivo de viabilidad celular con el tiempo. El crecimiento celular en los andamios se midió indirectamente cuantificando el ADN extraído de los andamios, y se calcularon las células por muestra.Las células IMR32 mostraron un aumento del crecimiento, luego las células KellyLuc, con el tiempo. La morfología del crecimiento y la distribución de las células en los andamios se evaluaron visualmente mediante tinción con hematoxilina, eosina e inmunohistoquímica. Las células KellyCis83 crecieron más rápido y se infiltraron más profundamente en ambas composiciones de andamios que la línea celular Kelly menos invasiva.IMR32 cultivado en nano-hidroxiapatita demostró un patrón de crecimiento contrastante con racimos grandes y densamente empaquetados, durante 14 días. Los rasgos específicos de la célula se monitorizaron mediante tinción inmunohistoquímica, seguida de tinción con faloidina y DAPI, y se observó la abundancia de actina en células Kelly y KellyCis83 en andamios de colágeno-glicosaminoglicano. Para la evaluación de la actividad celular in vitro, se midieron los niveles secretados de cromogranina A, y las células cultivadas en andamios de colágeno-glicosaminoglicanos y nano-hidroxiapatita de colágeno produjeron más cromogranina A en comparación con el crecimiento en cultivo 2D convencional.La línea celular KellyCis83 resistente a la quimioterapia secretó más cromogranina A que la línea celular Kelly. Después de la unión celular, las células se pueden tratar con diversas terapias. Esto proporcionaría resultados fisiológicamente más relevantes para la respuesta de las células a los fármacos que el cultivo 2D convencional.Esta técnica permite a los investigadores explorar mejor cómo se comportan y reaccionan las células cancerosas a un estímulo dentro del microambiente tumoral, desde la respuesta a la terapéutica o las interacciones con otros tipos de células.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado Modelo repoblado con la línea celular humana HepG2 carcinoma hepatocelular

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Matriz basada en tumores completamente humana en ensayo de invasión de esferoide tridimensional

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluación de la muerte celular utilizando sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Un modelo esferoide tridimensional para investigar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...