Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Children's Research Centre (NCRC), Irish Research Council (IRC) och Neuroblastoma UK. Illustrationerna är skapade med hjälp av BioRender.

<ol>
	<li>Davidoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).</li><li>Matthay, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).</li><li>Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+the+3D+microenvironment+on+cancer+cell+behaviour+and+treatment+responsiveness:+a+recent+update+on+lung,+breast+and+prostate+cancer+models.">Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models.</a> Acta Biomaterialia. , (2021).</li><li>Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+the+genes,+the+tumor+microenvironment+in+neuroblastoma.">More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma.</a> Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).</li><li>Walker, C., Mojares, E., Del R&#237;o Hern&#225;ndez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+matrix+in+development+and+cancer+progression.">Role of extracellular matrix in development and cancer progression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).</li><li>Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+extracellular+matrix+direct+gene+expression.">How does the extracellular matrix direct gene expression.</a> Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).</li><li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reciprocity+in+the+wound+microenvironment.">Dynamic reciprocity in the wound microenvironment.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Medicine. 6, 11 (2008).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Medicine. 4, 38 (2006).</li><li>Ouellette, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+collagen+jungle:+The+biomedical+potential+of+fiber+organization+in+cancer.">Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer.</a> Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Hume, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell+invasiveness+and+response+to+chemotherapeutics+in+adipocyte+invested+3D+engineered+anisotropic+collagen+scaffolds.">Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).</li><li>Fitzgerald, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+collagen-based+scaffolds+to+simulate+prostate+cancer+bone+metastases+with+potential+for+evaluating+delivery+of+nanoparticulate+gene+therapeutics.">The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics.</a> Biomaterials. 66, 53-66 (2015).</li><li>Sapudom, J., Pompe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+tumor+microenvironments+based+on+collagen+matrices.">Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices.</a> Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).</li><li>Curtin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+relevant+3D+collagen-based+scaffold-neuroblastoma+cell+system+exhibits+chemosensitivity+similar+to+orthotopic+xenograft+models.">A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models.</a> Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).</li><li>Gavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+invasion+strategies+are+regulated+by+the+extracellular+matrix.">Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix.</a> Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).</li><li>Casal, e. J., Crane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry, Glycosaminoglycans. , (2019).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+freezing+rate+on+pore+structure+in+freeze-dried+collagen-GAG+scaffolds.">Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).</li><li>Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinking+and+mechanical+properties+significantly+influence+cell+attachment,+proliferation,+and+migration+within+collagen+glycosaminoglycan+scaffolds.">Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).</li><li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment,+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).</li><li>Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+dehydrothermal+treatment+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).</li><li>Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nanohydroxyapatite+nanocomposites+for+bone+tissue+engineering.">Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering.</a> ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).</li><li>Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterisation+of+a+collagen+nano-hydroxyapatite+composite+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering.</a> Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+hydroxyapatite+incorporation+methods+on+the+structural+and+biological+properties+of+porous+collagen+scaffolds+for+bone+repair.">Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).</li><li>Tierney, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+collagen+concentration+and+crosslink+density+on+the+biological,+structural+and+mechanical+properties+of+collagen-GAG+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).</li><li>Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteomimicry+of+mammary+adenocarcinoma+cells+in+vitro;+increased+expression+of+bone+matrix+proteins+and+proliferation+within+a+3D+collagen+environment.">Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment.</a> PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).</li><li>Nolan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+neuroblastoma:+advances+and+challenges.">Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges.</a> Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).</li><li>Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+cell+responses+in+threedimensional+conductive+collagen+gel+scaffolds+with+conductive+polymer+nanofibres+for+tissue+regeneration.">Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration.</a> Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).</li><li>Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+analyze+three-dimensional+cell+distribution+and+infiltration+in+degradable+scaffolds.">Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).</li><li>do Amaral, R. J. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalising+collagen-based+scaffolds+with+platelet-rich+plasma+for+enhanced+skin+wound+healing+potential.">Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).</li><li>Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogranin+A+as+a+valid+marker+in+oncology:+Clinical+application+or+false+hopes.">Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes.</a> World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).</li><li>O'Brien, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+permeability+and+cell+attachment+in+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering.">The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).</li></ol>

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

3D-modellen av scaffold-cancerceller har visat sig vara ett värdefullt och mångsidigt verktyg för att få mekanistisk insikt i neuroblastomcellers tillväxt, livsduglighet och infiltration av celler i en förenklad TME32. Den 3D-neuroblastommodell som beskrivs här efterliknar den minimala TME-metoden och ger mer fysiologiskt relevanta data än en 2D-monolagerodling. En stor nackdel med 3D-cellodling är ökad experimentell komplexitet och längre tidsramar. Här beskrivs ett optimerat protokoll för sådd, tillväxt och underhåll av neuroblastomceller på kollagenbaserade strukturer följt av nedströmsanalyser och applikationer, vilket ger robust karakterisering av celltillväxt. Vi strävade efter att få insikter om den optimala cellsåddstätheten för strukturerna för att skapa en förutsägbar och kontrollerbar miljö för att utvärdera läkemedelsbehandlingar mot cancer i ett snabbt 14-dagars experimentellt fönster. Kombinationen av alla dessa beskrivna enkla protokoll ger en väl avrundad bedömning av neuroblastomcelltillväxt i det ställningsbaserade in vitro-odlingssystemet.
De kritiska punkterna i protokolluppsättningen har betonats för att göra det möjligt för forskare att snabbt fastställa detsamma i sina laboratorier. Till exempel tillåter de angivna inkubationstiderna för bättre prestanda för den kolorimetriska cellviabilitetsanalysen djupare penetration av reagenset i ställningens porer för att nå alla celler. Dessutom är den fluorescerande dsDNA-färgningstekniken robust och okomplicerad; DNA-frisättning från byggnadsställningarna kräver dock kraftig celllys eftersom cellerna är "fångade" i kollagenfibrerna.
Med hjälp av den enkla DNA-kvantifieringsanalysen som beskrivs kan vi identifiera den logaritmiska tillväxtfasen på kollagenbaserade strukturer för screening av cancerläkemedel med hjälp av denna modell. I den beskrivna experimentella miljön användes 4 initiala cellsåddstätheter med en total 14-dagarsperiod och analystidpunkter på dag 1, 7 och 14. Vi identifierade att KellyLuc-celler sådda vid 4 × 105 celler/byggnadsställning har det mest signifikant aktiva proliferationsfönstret mellan dag 7 och 14. Dessa tillväxtdata i logfasen kommer att möjliggöra en tillförlitlig tolkning av olika cellcytotoxicitetsexperiment. Det eliminerar spekulationer om eventuell nedgång i tillväxt eller celldöd till följd av undertryckt tillväxt på den 3D-porösa plattformen snarare än från läkemedelstoxicitet. Cellviabilitet är också en allmänt använd bedömning av lämpligheten hos 3D-plattformar för att stödja tillväxten av olika celltyper33,34. Även om det finns många analyser för att mäta cellviabilitet, inklusive levande/död färgning, ATP-mätning, proliferationsanalyser, fann vi att användningen av Alamar Blue-kolorimetrisk cellviabilitetsanalys var en enkel och effektiv teknik för att stödja DNA-kvantifieringsdata.
Den kombinerade användningen av DNA-kvantifiering och cellviabilitet gav kompletterande bevis för att den optimala densiteten för fröceller på ställningen i genomsnitt är 2-4 × 105 celler/byggnadsställning. Detta protokoll kan dock enkelt anpassas för att uppfylla olika experimentella tidsramar, analystidpunkter och nedströmsapplikationer. Även om detta protokoll beskriver utvärderingen av monokulturcelltillväxt av neuroblastomceller på byggnadsställningar, är ställningarna lätt att ändra för användning som en plattform för samodling, beskriven av do Amaral et al., som använde kollagen-GAG-ställningar för att samodla keratinocyter och fibroblaster i en undersökning av sårläkning35.
Den beskrivna 3D-modellen möjliggör visualisering av celltillväxt och infiltration med hjälp av olika välkända tekniker, såsom immunofluorescens och standard H&E. Det är viktigt att visualisera cellerna tillsammans med karakteriseringen av tillväxt med hjälp av biokemiska analyser på grund av mångfalden av cellmorfologi och tillväxtmönster på byggnadsställningar. Att förstå tillväxtmönstret kan ge insikter om tillväxtbeteende och framtida respons på cancerläkemedel. Till exempel ger IMR32-tillväxt med hjälp av DNA-kvantifiering liknande mönster som Kelly, även om IMR32 vid visualisering med H&E växer i större kluster än Kelly, som uppvisade mer spridd tillväxt (figur 9). Dessa varierande tillväxtmönster för cellinjer i scaffolds återspeglar det kliniska scenariot för tumörheterogenitet. Att undersöka läkemedelssvar mot cancer med hjälp av en panel av cellinjer med olika morfologier i 3D-strukturer kommer att öka det prediktiva värdet för patientsvar på samma läkemedel.
Detektion av gen- eller proteinuttryck kan också utföras med andra metoder som RT-qPCR eller ELISA om proteinet av intresse utsöndras. En surrogatmarkör för neuroblastomprogression, kromogranin A (CgA)36, användes för att ytterligare karakterisera neuroblastomcelltillväxt i 3D. Som beskrivits i tidigare arbete17 ökade CgA-utsöndringen när cellerna förökade sig (Figur 10). Även om cellodling i monolager inte kunde fånga denna ökning, eftersom proliferation innebar att cellerna nådde fullt sammanflöde i odlingsskålarna, möjliggjorde användningen av 3D-kollagenställningarna långvarig bedömning av CgA-sekretionen.
Denna 3D in vitro-modell kanske inte är lämplig för alla forskningsfrågor för att studera neuroblastombiologi och svar på terapier. En av begränsningarna är ojämn cellpenetration i byggnadsställningar och bildandet av cellkluster av varierande storlek, vilket beror på en given cellinje och kan leda till okontrollerbar diffusion av näringsämnen och testläkemedel. Denna egenskap påverkar robustheten i terapeutisk screening. Men trots denna begränsning är det viktigt att tänka på att inhemska tumörer också är heterogena i storlek och cancercellsfördelning och innehåller många andra celltyper i tumörvävnaden. För att övervinna denna begränsning föreslår vi att man använder varje cellbefolkad struktur som en enda mikrovävnad för vilken följande parametrar kommer att optimeras: (a) inkubationstider för cellviabilitetsreagenset att nå cellerna och cellklustren, och (b) lysering av cellerna i Triton X-100-buffert genom förbehandling av celler på strukturer med en vävnadslysare för att frigöra DNA från cellerna som finns djupt i ställningen.
En annan teknisk begränsning med detta protokoll är bristen på mekanisk testning av varje parti av nytillverkade ställningar för denna modell. Men genom att använda den robusta tillverkningsprocessen för ställningarna, som har karakteriserats utförligt i förhållande till fysikaliska och kemiska egenskaper hos ställningarna, såsom tryck- och dragmodul, porositet och visuell porstruktur och homogenitet, säkerställs att ställningens kvaliteter bibehålls genom batcher 21,24,27,30,37.
Sammanfattningsvis presenterar denna artikel en serie enkla metoder för analys av cellulär tillväxt på kollagenbaserade byggnadsställningar. Både den experimentella tidslinjen och analyspunkterna kan bytas ut beroende på de specifika forskningsfrågorna. Detta protokoll är också anpassningsbart till andra celltyper. Resultaten som visas ovan ger belägg för hur denna sammanställning av metoder gav insikt i den optimala såddtätheten för olika neuroblastomcellinjer för att skapa kontinuerlig tillväxt under 14 dagar. Sammanslagningen av resultat som erhållits från alla metoder i detta protokoll ger en överlägsen förståelse för celltillväxt inom 3D-kollagenmatrisen. Framtida användning av denna modell kommer sannolikt att involvera samodlingssystem som är specifika för neuroblastomet TME och testning av olika nya läkemedel mot cancer.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

Neuroblastom är en barncancer i det sympatiska nervsystemet som uppstår under embryonal utveckling eller tidigt postnatalt liv på grund av omvandlingen av neurala toppceller1. Det är den vanligaste solida extrakraniella tumören hos barn, representerar 8 % av de maligniteter som diagnostiseras hos patienter under 15 år och är ansvarig för 15 % av alla dödsfall i barncancer. Sjukdomen uppvisar mycket heterogena kliniska beteenden på grund av specifika kromosomala, genetiska och epigenetiska förändringar och histopatologiska egenskaper.
Dessa förändringar bidrar till aggressiviteten hos neuroblastom och dåliga resultat hos pediatriska patienter. Nuvarande behandlingar visar sig därför vara ineffektiva på lång sikt för nästan 80 % av patienterna med den kliniskt aggressiva sjukdomen2, vilket belyser det faktum att behandlingen för denna patientgrupp fortfarande är utmanande. Detta beror sannolikt på att mekanismerna för neuroblastomheterogenitet och metastaser fortfarande inte är helt klarlagda. Tumörmikromiljön (TME) anses dock nu allmänt spela en roll i utvecklingen av många cancerformer. Ändå är det fortfarande understuderat i neuroblastom 3,4.
Den ursprungliga TME-mikromiljön är en komplex 3D-mikromiljö med cancerceller och icke-cancerceller omgivna av en ECM. ECM hänvisar till den acellulära komponenten i en vävnad som ger strukturellt och biokemiskt stöd till sina cellulära invånare och bidrar till sjukdomsprogression, patientprognos och terapeutiskt svar5. Detta främjande av sjukdomsprogression beror på "dynamisk ömsesidighet" eller pågående dubbelriktad kommunikation mellan celler och ECM 6,7,8. När cancern fortskrider omorganiseras stromalt kollagen ofta i linjära mönster vinkelrätt mot gränsytan mellan stroma och cancer, som cancerceller använder som en migrationsväg till metastasering 9,10,11.
Huvudkomponenterna i denna naturliga funktionella biologiska struktur inkluderar ett fibröst nätverk av kollagener typ I och II och andra proteiner, inklusive elastin, glykoproteiner som laminin, samt en rad proteoglykaner och andra lösliga komponenter12,13. Dessa proteiner i den ursprungliga ECM har nu blivit attraktiva naturliga biomolekyler för utveckling av 3D in vitro-modeller. Användningen av 3D-strukturer för in vitro-cellodling ökar i popularitet på grund av dess större fysiologiska representation av TME jämfört med traditionell 2D-monolagerodling. De tillverkade 3D-ställningarna hjälper cellbindning, proliferation, migration, metabolism och respons på stimuli som ses i in vivo biologiska system.
Huvudkomponenten i dessa 3D-strukturer är kollagen, som är en nyckelspelare i många normala biologiska processer, inklusive vävnadsreparation, angiogenes, vävnadsmorfogenes, cellvidhäftning och migration11. Kollagenbaserade 3D-matriser har visat sin robusta funktionalitet för att modellera ECM, och fungerar som en in vitro biomimetisk mikromiljö samtidigt som de möjliggör cell-ECM-interaktioner samt cellmigration och invasion. Dessa 3D-matriser ger också en mer exakt analys av cellsvar på kemoterapeutiska läkemedel än traditionell 2D- eller "platt" odling i många cancermodeller 14,15,16, inklusive neuroblastom 17,18. Genetisk analys av 3D-cellkulturer har rapporterat en högre korrelation med den mänskliga vävnadsprofilen även jämfört med djurmodeller19. Sammantaget är hörnstenen i dessa 3D-strukturer att ge cellerna en lämplig in vitro-miljö, vilket rekapitulerar den ursprungliga vävnadsarkitekturen och underlättar dubbelriktad molekylär överhörning8.
För att öka komplexiteten hos kollagenbaserade modeller inkorporeras andra vanliga ECM-komponenter i vävnadsteknikprocessen, vilket skapar mer fysiologiskt relevanta modeller för att återspegla nischade TME-metoder i olika vävnader. Till exempel underlättar GAG, negativt laddade polysackarider som finns i alla däggdjursvävnader20, cellbindning, migration, proliferation och differentiering. Kondroitinsulfat är en specifik typ av GAG som finns i ben och brosk, som tidigare har använts i vävnadstekniska applikationer för benreparation 21,22,23,24,25. Nanohydroxiapatit (nHA) är den huvudsakliga oorganiska beståndsdelen i mineralsammansättningen i mänsklig benvävnad och utgör upp till 65 viktprocent av benet26 och används därför i stor utsträckning för benersättning och regenerering27. Således är GAG och nHA attraktiva kompositer för att rekonstruera det primära neuroblastom-ECM:t och modellera de vanligaste metastaserna av neuroblastom, benmärg (70,5 %) och ben (55,7 %)28.
Ställningar som innehåller dessa ECM-komponenter utvecklades ursprungligen för benvävnadstekniska tillämpningar med omfattande analys av deras biokompatibilitet, toxicitet och osteoledande och osteoinduktiva egenskaper29,30. De är porösa, kollagenbaserade matriser som framställs med hjälp av frystorkningstekniker för att kontrollera deras fysikaliska och biologiska egenskaper. Kollagenställningarna kompletterade med antingen nHA (Coll-I-nHA) eller kondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG) visade sig vara framgångsrika i att efterlikna primär TME vid bröstcancer31 och metastasering till skelettet vid prostatacancer15 samt neuroblastom17. Frystorkningstekniken som används för att tillverka dessa kompositställningar ger reproducerbar homogenitet i porstorlek och porositet inom ställningarna22,23,24. Kortfattat tillverkas en kollagenuppslamning (0,5 viktprocent) genom att blanda fibrillärt kollagen med 0,05 M ättiksyra. För Coll-I-GAG tillsätts 0,05 viktprocent chrondoitin-6-sulfat isolerat från hajbrosk till kollagenuppslamningen under blandningen. För de sammansatta Coll-I-nHA-ställningarna syntetiseras hydroxiapatitpartiklarna i nanostorlek enligt tidigare beskrivet27 och tillsätts kollagenuppslamningen i förhållandet 2:1 till kollagenets vikt under blandningsprocessen. Alla ställningar tvärbinds och steriliseras fysiskt med hjälp av en dehydrotermisk behandling vid 105 °C i 24 timmar25. Cylindriska ställningar (6 mm diameter, 4 mm höjd) erhålls med hjälp av en biopsistans och kan kemiskt tvärbindas med 3 mM N-(3-dimetylaminopropyl)-N'-etylkarbodiimidhydroklorid och 5,5 mM N-hydroxisuccinimid (EDAC/NHS) i destillerat vatten (dH2O) för att förbättra konstruktionernas mekaniska egenskaper30. Denna väloptimerade tillverkningsprocess av två kollagenställningar skapar ställningar med reproducerbara mekaniska egenskaper, inklusive porstorlek, porositet och styvhet (kPa). Både Coll-I-GAG- och Coll-I-nHA-ställningar har olika fysiska egenskaper, vilket skapar olika miljöförhållanden. Egenskaperna för varje ställning visas i tabell 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Coll-I-GAG</td>
			<td>Coll-I-nHA</td>
		</tr><tr><td>Ställningens storlek (diameter [mm] x höjd [mm])</td>
			<td>6 × 4 17</td>
			<td>6 × 4 17</td>
		</tr><tr><td>Kollagenkoncentration (viktprocent)</td>
			<td>0,5 17</td>
			<td>0,5 17</td>
		</tr><tr><td>Substratkoncentration (viktprocent) [baserat på kollagenets vikt]</td>
			<td>0,05 15,17</td>
			<td>200 17 Stockholm</td>
		</tr><tr><td>Genomsnittlig porstorlek (mm)</td>
			<td>96 22 Stockholm</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>Porositet (%)</td>
			<td>99,5 23</td>
			<td>98,9 – 99,4 27</td>
		</tr><tr><td>Styvhet (kPa)</td>
			<td>1,5 27 Stockholm</td>
			<td>5,5 - 8,63 29</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Översikt över de mekaniska egenskaperna hos de två strukturer som används för att studera neuroblastombiologi.
Denna artikel beskriver ett protokoll för att sätta ihop ett 3D-ställningsbaserat system för att bättre efterlikna neuroblastommikromiljön med hjälp av neuroblastomcellinjer och tidigare beskrivna kollagenbaserade strukturer kompletterade med antingen nHA (Coll-I-nHA) eller kondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG). Protokollet inkluderar nedströmsmetoder för att analysera tillväxtmekanismerna hos neuroblastomcellerna i en mer fysiologiskt relevant miljö med hjälp av tidigare optimerade billiga metoder anpassade från 2D-monolagerodling Figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> Bild 1: Övergripande protokollarbetsflöde. A) Cellerna odlas till tillräckligt antal, delas, räknas och återsuspenderas i en lämplig volym medium. (B) Detta cellmaterial genomgår sedan seriespädning för att framställa totalt 4 cellsuspensioner med olika densitet. (C) Kollagenbaserade ställningar pläteras sterilt i icke-vidhäftande 24-hålsplattor, och (D) 20 μL cellsuspension tillsätts i mitten av varje ställning och lämnas att inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 och 95 % luftfuktighet i 3-5 timmar. (E) Komplett tillväxtmedium (1 ml) tillsätts sedan långsamt till varje ställning och plattorna placeras tillbaka i inkubatorn för att möjliggöra celltillväxt under önskad tidsram. (F) Vid varje förutbestämd tidpunkt hämtas flera strukturer för bedömning av cellviabilitet och tillväxt, analys av genuttryck och histologisk färgning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

Neuroblastom är den vanligaste extrakraniella solida tumören hos barn och står för 15 % av de totala dödsfallen i barncancer. Den naturliga tumörvävnaden är en komplex tredimensionell (3D) mikromiljö som involverar lager av cancerösa och icke-cancerösa celler omgivna av en extracellulär matris (ECM). ECM ger fysiskt och biologiskt stöd och bidrar till sjukdomsprogression, patientprognos och terapeutiskt svar.
Denna artikel beskriver ett protokoll för att sätta ihop ett 3D-ställningsbaserat system för att efterlikna neuroblastommikromiljön med hjälp av neuroblastomcellinjer och kollagenbaserade ställningar. Stödställningarna kompletteras med antingen nanohydroxiapatit (nHA) eller glykosaminoglykaner (GAG), som finns naturligt i höga koncentrationer i ben och benmärg, de vanligaste metastaserna för neuroblastom. Den 3D-porösa strukturen hos dessa strukturer möjliggör neuroblastomcellbindning, proliferation och migration och bildandet av cellkluster. I denna 3D-matris är cellens svar på terapier mer reflekterande av in vivo-situationen .
Det ställningsbaserade odlingssystemet kan upprätthålla högre celldensiteter än konventionell tvådimensionell (2D) cellodling. Därför är optimeringsprotokoll för initiala såddcellantal beroende av de önskade experimentella tidsramarna. Modellen övervakas genom att bedöma celltillväxt via DNA-kvantifiering, cellviabilitet via metaboliska analyser och celldistribution inom ställningarna via histologisk färgning.
Denna modells tillämpningar inkluderar bedömning av gen- och proteinuttrycksprofiler samt cytotoxicitetstestning med konventionella läkemedel och miRNA. 3D-odlingssystemet möjliggör exakt manipulation av cell- och ECM-komponenter, vilket skapar en miljö som är mer fysiologiskt lik naturlig tumörvävnad. Därför kommer denna 3D in vitro-modell att öka förståelsen för sjukdomspatogenesen och förbättra korrelationen mellan resultat som erhållits in vitro, in vivo i djurmodeller och försökspersoner.

Den kollagenbaserade stödmodellen som beskrivs här har många tillämpningar, allt från att studera neuroblastombiologi till screening av anticancerterapier i en miljö som är mer fysiologiskt lik inhemska tumörer än konventionell 2D-cellodling. Innan man testar en given forskningsfråga är det avgörande att få en fullständig karakterisering av cellbindning, proliferation och infiltration inom den önskade experimentella tidsramen. Tillväxtförhållandena beror på biologin hos varje specifik cellinje. Det är viktigt att flera metoder för bedömning av celltillväxt måste implementeras för att fastställa optimala förhållanden och robust prestanda.
Här bedömdes viabiliteten hos neuroblastomceller odlade på byggnadsställningar med hjälp av en kolorimetrisk cellviabilitetsanalys. Denna analys kan utföras så ofta som önskas under hela den experimentella tidsramen. För det beskrivna experimentet utfördes bedömning av cellviabilitet på dag 1, 7 och 14 för två neuroblastomcellinjer, KellyLuc och IMR32, odlade på Coll-I-nHA-strukturer med 4 olika densiteter (Figur 6). Viabilitet på dag 1 sattes som en baslinje för att jämföra alla efterföljande mätningar. Reduktionshastigheten för cellviabilitetsreagenset återspeglar cellbiologin och tillväxtegenskaperna hos enskilda cellinjer, inklusive deras proliferationshastighet och metabolism. En korrelation mellan antalet celler som såddes på ställningarna och reduktionsnivån förväntades. I detta experiment ökade minskningen av cellviabilitetsreagenset i allmänhet med varje tidpunkt för båda cellinjerna vid alla densiteter, som förväntat.
Varje densitet bedömdes sedan individuellt för båda cellinjerna för att jämföra minskningen över tidpunkter. Envägs ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest utfördes för att upptäcka signifikanta skillnader i reduktion mellan tidpunkter (Figur 7). För båda cellinjerna och alla seedningstätheter sågs en signifikant ökning (P<0,05) av reduktionen av cellviabilitetsreagenset vid jämförelse av dag 1 och dag 14. Detta indikerade en signifikant ökning av metaboliskt aktiva celler som fanns på byggnadsställningarna. Denna ökning var inte signifikant i alla fall när man bedömde 7-dagarsintervallen (dag 1 jämfört med dag 7, dag 7 jämfört med dag 14), vilket visar vikten av optimering av såddtätheten för att uppnå det önskade tillväxtfönstret.
För att stödja resultaten av cellviabilitetsanalysen kan celltillväxt på strukturer också mätas indirekt via kvantifiering av dsDNA extraherat från strukturer med hjälp av en fluorescerande dsDNA-färgning (figur 8A). Liksom cellviabilitet kan DNA-kvantifiering göras så ofta som önskas inom den experimentella tidslinjen. Denna analys kräver dock fullständig hämtning av byggnadsställningar och upphörande av celltillväxt och måste därför tas med i den experimentella planeringen som diskuteras i avsnitt 1. För detta experiment kvantifierades DNA på dag 1, 7 och 14 för två neuroblastomcellinjer, KellyLuc och IMR32, odlade på Coll-I-nHA-ställningar vid 4 olika densiteter. Eftersom den genomsnittliga koncentrationen av dsDNA per cell är känd för dessa cellinjer, var det möjligt att härleda antalet celler per prov från det kvantifierade DNA:t (Figur 8B).
DNA-kvantifiering gav upphov till högre variabilitet mellan biologiska replikat än bedömning av cellviabilitet men ökade generellt för varje tidpunkt, med de högsta nivåerna kvantifierade på dag 14. IMR32-celler verkar nå högre cellantal på Coll-I-nHA-ställningar, vilket indikeras av DNA-koncentration, än KellyLuc-celler. Varje densitet bedömdes sedan individuellt för de två cellinjerna för att jämföra minskningen över tidpunkter. Envägs ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest utfördes för att upptäcka signifikanta skillnader i reduktion mellan tidpunkter (Figur 8B).
För båda cellinjerna och alla seedningstätheter sågs en signifikant ökning (P<0,05) i cellantal vid jämförelse av dag 1 och dag 14, med undantag för KellyLuc vid seeding density 4 (1 × 105 celler/scaffold), som inte gav signifikanta ökningar över någon av tidpunkterna. I likhet med cellviabilitetsresultaten var ökningarna inte signifikanta i alla fall vid bedömning av 7-dagarsintervallen (dag 1 jämfört med dag 7, dag 7 jämfört med dag 14). När man jämförde tidstrenderna för cellviabilitet och DNA-kvantifiering fanns det några små skillnader mellan de två analyserna. Överlag observerades dock liknande trender, med medelvärden som ökade mellan 7-dagarsintervallen för de flesta tätheter. Detta visar hur viktigt det är att övervaka celltillväxten med hjälp av mer än en metod.
En visuell bedömning av celltillväxtens morfologi och fördelning på strukturerna implementerades därefter, omfattande traditionell hematoxylin- och eosinfärgning (H&E) samt IHC. Det förväntas att de olika tillväxtmönstren för enskilda cellinjer kommer att leda till varierande rumsliga arrangemang på byggnadsställningar, inklusive olika grader av penetration i ställningen och cellkluster. Ställningarna var formalinfixerade, paraffininbäddade och skurna i 5 mm sektioner (figur 9A), vilket förberedde ställningarna för flera visualiseringstekniker, inklusive histologisk färgning och IHC.
Rutinmässig H&E-färgning applicerades på Kelly-, KellyCis83- och IMR32-celler odlade på kollagenbaserade strukturer dag 1, 7 och 14 (Figur 9B). Detta möjliggjorde visualisering av cellernas rumsliga orientering på två kollagenbaserade ställningar under en 14-dagarsperiod. Cisplatinkänsliga Kelly-celler och resistenta KellyCis83-celler odlades på både Coll-I-nHA-strukturer (Figur 9B, i) och Coll-I-GAG-strukturer (Figur 9B, ii). I överensstämmelse med tidigare publicerade data växte KellyCis83-celler i högre takt och infiltrerade djupare in i båda strukturkompositionerna än den mindre invasiva Kelly-cellinjen. H&E-färgningen av en annan neuroblastomcellinje, IMR32, odlad på Coll-I-nHA visar ett kontrasterande tillväxtmönster (Figur 9B, iii). Denna cellinje växte i stora, tätt packade kluster på kollagenställningarna under 14-dagarsperioden. Ljusfältskonfokalmikroskopi kan användas för att visualisera den porösa arkitekturen hos kollagenbaserade strukturer (Figur 9C) på grund av autofluorescensen hos kollagenfibrer.
Vi färgade celler med falloidin som riktar sig mot cytoskelettaktin och den nukleära motfärgen, 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), för att övervaka specifika cellegenskaper under hela den experimentella tidslinjen. Ett överflöd av aktin observerades i Kelly- och KellyCis83-celler på Coll-I-GAG-strukturer med denna teknik (Figur 9D). Dessa resultat visar hur flera avbildningstekniker kan användas för att härleda rumsligt upplöst information från neuroblastomceller som odlas på byggnadsställningar med hjälp av detta protokoll. Denna karakterisering av celltillväxtmönster på kollagenbaserade strukturer under en given period kommer att förbättra förståelsen och tolkningen av alla nedströms biokemiska analyser.
Proteinuttryck hos celler odlade på kollagenbaserade strukturer kan analyseras för att jämföra cellulär aktivitet med in vivo-scenarier . Tidigare publicerade data undersökte uttrycket av kromogranin A (CgA) som en surrogatutsöndrad markör för neuroblastom av KellyLuc- och KellyCis83Luc-celler odlade i cellmonolager samt på Coll-I-nHA- och Coll-I-GAG-strukturer (Figur 10). CgA bedömdes i det konditionerade mediet med hjälp av en enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) (Figur 10A). CgA utsöndras i högre grad i den mer aggressiva kemoresistenta KellyCis83-cellinjen än i Kelly (Figur 10B,C). Detta var signifikant på dag 7 på både Coll-I-GAG och Coll-I-nHA scaffolds (P<0.05), medan det inte fanns någon signifikant skillnad vid denna tidpunkt för celler odlade som ett monolager med konventionell 2D-odling.
Dessa resultat belyser också den begränsade experimentella tidslinjen när man odlar celler i ett monolager, med endast 7 dagars tillväxt som visar sig vara möjlig innan celler når sammanflöde. Tillväxten av celler på byggnadsställningar övervinner denna begränsning eftersom de kan bibehållas under en längre period under mer fysiologiskt relevanta förhållanden. Ovanstående kombination av tekniker för att samla in information om cellviabilitet, DNA-innehåll, cellulär morfologi och rumslig placering och uttrycksprofiler underlättar bedömningen av tillväxten av neuroblastomceller på en rad kollagenbaserade byggnadsställningar. Detta protokoll kan också enkelt anpassas för att uppfylla specifika experimentella krav och önskade applikationer.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig06.jpg"> Figur 6: Analys av cellviabilitet. A) Allmän procedur för att mäta viaabiliteten hos neuroblastomceller på kollagenbaserade strukturer med hjälp av en kolorimetrisk cellviabilitetsanalys. Inkubationstiden måste optimeras för varje ny cellinje, med hänvisning till tillverkarens riktlinjer. (B) Procentuell minskning av cellviabilitetsreagens av KellyLuc- och IMR32-celler odlade på Coll-I-nHA-strukturer vid fyra olika initiala såddtätheter, mätt på dag 1, 7 och 14. Proverna bedömdes i biologiskt tre exemplar med felstaplar som representerade standardavvikelsen. Förkortningar: nHA = nanohydroxiapatit; Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig07.jpg"> Figur 7: Cellviabilitet efter såddtäthet för celler som odlats på Coll-I-nHA under en 14-dagarsperiod . a) KellyLuc. (B) IMR32. Namngivna cellnummer hänvisar till den initiala cellsåddstätheten på ställningarna på dag 0. Proverna bedömdes i biologiskt tre exemplar, vilket indikerades med tre punkter, med staplar som representerar medelvärdet. Envägs ANOVA med multipla jämförelser användes för att detektera signifikanta skillnader i % cellviabilitetsreagensreduktion över de tre tidpunkterna, noterade på graferna (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Förkortningar: nHA = nanohydroxiapatit; Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA; ANOVA = variansanalys; ns = inte signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig08.jpg"> Figur 8: Kvantifiering av DNA extraherat från celler i byggnadsställningar . (A) Process för kvantifiering av dsDNA från celler odlade på kollagenbaserade strukturer med hjälp av en fluorescerande dsDNA-färgning. (B) Cellantal från DNA-kvantifieringsanalys efter såddtäthet för KellyLuc- och IMR32-celler odlade på Coll-I-nHA under en 14-dagarsperiod. Namngivna cellnummer hänvisar till den initiala cellsåddstätheten på ställningar på dag 0. Proverna bedömdes i biologiskt tre exemplar, vilket indikerades med tre punkter, med staplar som representerar medelvärdet. Envägs ANOVA med multipla jämförelser användes för att detektera signifikanta skillnader i cellantal över de tre tidpunkterna, noterade på graferna (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Förkortningar: nHA = nanohydroxiapatit; Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA; dsDNA = dubbelsträngat DNA; TE = Tris-EDTA; ANOVA = variansanalys; ns = inte signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig09.jpg"> Figur 9: Vävnadsbearbetningssteg för immunhistokemisk analys av stödstrukturer . (A) Schematisk framställning av protokollet för bearbetning av ställningar för bildanalys. Denna process möjliggör rutinmässig histologisk färgning och specifik antikroppssondering med hjälp av primära antikroppar och fluorescerande märkta sekundära antikroppar. (B) Representativa bilder av tre neuroblastomcellinjer som utsatts för H&E-färgning. H&E-bilder tas dag 1, 7, 14 för att övervaka tillväxtmönster under experimentets tidsförlopp. Skalstapel = 200 μm. Streckade fyrkanter representerar det område som valdes för inzoomade 20x-bilder i den nedre vänstra kanten. Skalstapel = 20 μm. (i och ii) H&E av Kelly och KellyCis83 neuroblastomcellinjer (övre respektive nedre paneler) på två typer av kollagenbaserade ställningar. (iii) H&E av IMR32-cellinje, som representerar klustrad cellulär tillväxt på Coll-I-nHA-ställningen. (C) Representativ bild av Kelly-cellinjen, utsatt för ljusfältskonfokalmikroskopi. Kollagenautofluorescensen möjliggör visualisering av den porösa ställningen. 10x skalstapel = 200 μm, 20x skalstapel = 20 μm. (D) Representativ bild av inbäddade ställningar följt av analys av IHC med falloidin och DAPI vid 10x förstoring, skalstapel = 200 μm. Mindre inre rutor representerar inzoomade bilder (20x), skalstreck = 20 μm. Förkortningar: nHA = nanohydroxiapatit; Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA; GAG = glykosaminoglykan; Coll-I-GAG = kollagenställningar kompletterade med kondroitin-6-sulfat; H&E = hematoxylin och eosin; IHC = immunhistokemi; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig09large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig10.jpg"> Figur 10: Proteinuttryck av neuroblastomceller odlade på 3D-kollagenbaserade strukturer jämfört med 2D-plast. (A) En schematisk bild av hur CgA ELISA utfördes på betingade medier av celler odlade på 2D-plast eller 3D-kollagenbaserade byggnadsställningar. (B) CgA-proteinuttrycksnivåer tagna från konditionerade medier i celler som odlats på ett 2D-plastmonolager. Eftersom cellerna nådde sammanflöde efter 7 dagar var 14-dagarstidpunkten inte läsbar. Vid dag 7 på plast fanns det ingen signifikant skillnad i CgA-nivåer mellan Kelly- och KellyCis83-cellinjer. CgA ELISA utförs med konditionerade medier av celler som odlats på kollagenbaserade strukturer under 14 dagar i följd. På dag 7, på båda kollagenställningarna, är CgA-nivåerna högre i den mer aggressiva KellyCis83-cellinjen, vilket belyser mer fysiologiskt relevanta nivåer av CgA i 3D-matris jämfört med 2D-monolager. Denna siffra har modifierats från Curtin et al.17. Förkortningar: 3D = tredimensionell; 2D = tvådimensionell; CgA = kromogranin A; ELISA = enzymkopplad immunadsorberande analys; nHA = nanohydroxiapatit, Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA; GAG = glykosaminoglykan; Coll-I-GAG = kollagenställningar kompletterade med kondroitin-6-sulfat; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylbensidin, HRP = pepparrotsperoxidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig10large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Denna artikel listar de steg som krävs för att så neuroblastomcellinjer på tidigare beskrivna tredimensionella kollagenbaserade strukturer, upprätthålla celltillväxt under en förutbestämd tidsram och hämta strukturer för flera celltillväxt- och cellbeteendeanalyser och nedströmsapplikationer, anpassningsbara för att tillfredsställa en rad experimentella mål.

Tredimensionell in vitro biomimetisk modell av neuroblastom med hjälp av kollagenbaserade strukturer

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Vårt protokoll erbjuder en 3D-biokonstruerad modell som nära påverkar den naturliga vävnaden. Detta kan potentiellt användas för att upptäcka nya terapier och biomarkörer för behandling och diagnos av neuroblastom. Den största fördelen är att det skapar mer fysiologiskt relevanta experimentella förhållanden för att studera tumörens mikromiljö med hjälp av en reproducerbar teknik som uppnår batch-till-batch-konsistens.Vår scaffold-metod kan användas för det första för att identifiera nya terapier för neuroblastom, och för det andra för att införliva patient-deriverade celler för bättre förutsägelse av individuell patientsvar . Börja med att placera ställningen som är lagrad i PBS i den laminära flödeshuven. Använd steril pincett för att försiktigt lyfta ställningen från hörnet och tryck mot sidoväggen för att ta bort överflödig PBS.Placera sedan ställningen med det blanka lagret nedåt i mitten av brunnen på en icke-vidhäftande 24-brunnsplatta. Märk plattan med detaljer om cellinjen, såddtäthet och tidpunkter. Arbeta med cellerna med en såddtäthet i taget och håll de återstående cellerna vid 37 grader Celsius i inkubatorn tills de är redo att användas.För cellfästet i ställningen, använd en P20-pipett med sterila spetsar för att blanda cellsuspensionen noggrant och tillsätt 20 mikroliter av den relevanta cellsuspensionen i mitten av varje ställning, se till att cellsuspensionen förblir ovanpå ställningen och inte på sidoväggen eller botten av brunnen. Låt cellerna fästa i tre till fem timmar vid 37 grader Celsius i 5 % koldioxid och 95 % luftfuktighet. I slutet av inkubationen, använd en P1000-pipett för att långsamt tillsätta en milliliter förvärmt tillväxtmedium till varje brunn, vilket förhindrar förskjutning av ställningarna, och inkubera plattan över natten.Observera byggnadsställningarna, till en början, varannan till var tredje dag för färgförändringar av tillväxtmediet när cellerna förökar sig inom ställningen. Använd en 10 ml pipettpistol med långsamt läge för att ta bort och kassera en milliliter av det förbrukade mediet från brunnen. När det konditionerade mediet används för experimentet, samla upp det förbrukade mediet av de biologiska replikaten i ett 15 ml centrifugrör och pelletera ner det cellulära skräpet genom centrifugering.Överför supernatanten till en ny tub och förvara tuben vid minus 80 grader Celsius. Efter att ha ställt in pipettpistolen på droppläge, tillsätt försiktigt två milliliter förvärmt tillväxtmedium till ställningarna. Inkubera den platta som innehåller ställningen och fyll på det färska mediet under den önskade tillväxtperioden, som visas.I huven med laminärt flöde, sterilisera lämpligt reagens för cellviabilitetsanalys genom filtrering genom ett 0.2 mikrometer sterilt filter in i ett centrifugrör. Förvärm den sterila lösningen, det kompletta odlingsmediet och den sterila PBS:en i vattenbadet vid 37 grader Celsius. Använd en steril pincett, överför ställningarna som ska analyseras i en ny 24-hålsplatta och märk plattan med alla relevanta detaljer.Tillsätt 900 mikroliter av det förvärmda odlingsmediet till varje brunn. Tillsätt sedan 100 mikroliter av det sterila cellviabilitetsreagenset till varje brunn. För en negativ kontroll, tillsätt 900 mikroliter medium och 100 mikroliter av det sterila cellviabilitetsreagenset i en brunn utan byggnadsställning.Sätt tillbaka locket på plattan och gunga försiktigt plattan i cirka tre minuter för att fördela det utspädda cellviabilitetsreagenset i hela brunnen. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius med 5 % koldioxid och 95 % luftfuktighet. Efter att ha tagit bort plattan från inkubatorn, gunga försiktigt plattan i några sekunder och generera triplikaten, som visas i textmanuskriptet.Generera de tekniska triplikaterna genom att överföra 100 mikroliter av det inkuberade mediet och reagenset från en brunn på 24-hålsplattan till en brunn på den genomskinliga 96-hålsplattan, och utför detta steg totalt tre gånger för en brunn. Täck 96-hålsplattan med aluminiumfolie för att skydda cellviabilitetsreagenset från ljus. Ta bort och kassera de återstående 700 mikroliter medium och reagens från ställningarna i plattan med 24 hål.Tvätta varje ställning två gånger med en milliliter steril PBS. Använd en mikroplattläsare för att mäta absorbansen vid 570 och 600 nanometer och beräkna den procentuella minskningen av cellviabilitetsreagenser enligt tillverkarens rekommendationer. Statistiskt analysera cellviabilitetsresultaten med hjälp av lämplig programvara.Mata in de biologiska trippelvärdena för att producera felstaplar och indikera analysvariabiliteten. Utför en envägsanalys av varianstest för att undersöka förändringarna i cellviabilitet under den experimentella tidsramen med hjälp av lämplig biostatistisk programvara. Ange signifikanta skillnader mellan tidpunkterna på graferna, som beskrivs i textmanuskriptet.Livsdugligheten hos två neuroblastomcellinjer, KellyLuc och IMR32, odlade på ställningarna, utvärderades. Den ökade celltätheten resulterade i en större minskning av cellviabilitetsreagenset med tiden. Celltillväxten på ställningarna mättes indirekt genom att kvantifiera det DNA som extraherades från ställningarna, och cellerna per prov beräknades.IMR32-cellerna visade ökad tillväxt, sedan KellyLuc-celler, med tiden. Cellernas tillväxtmorfologi och fördelning på byggnadsställningarna bedömdes visuellt med hematoxylin, eosin och immunhistokemifärgning. KellyCis83-celler växte snabbare och infiltrerade djupare in i båda ställningskompositionerna än den mindre invasiva Kelly-cellinjen.IMR32 odlad på nanohydroxiapatit uppvisade ett kontrasterande tillväxtmönster med stora, tätt packade kluster under 14 dagar. De cellspecifika egenskaperna övervakades genom immunhistokemisk färgning, följt av falloidin- och DAPI-färgning, och överflödet av aktin observerades i Kelly- och KellyCis83-celler på kollagen-glykosaminoglykan-ställningar. För den cellulära aktivitetsbedömningen in vitro mättes utsöndrade nivåer av kromogranin A, och cellerna odlade på kollagen-glykosaminoglykan och kollagen nano-hydroxiapatitstrukturer producerade mer kromogranin A jämfört med tillväxten på konventionell 2D-odling.Den kemoresistenta KellyCis83-cellinjen utsöndrade mer kromogranin A än Kelly-cellinjen. Efter cellbindning kan cellerna behandlas med olika läkemedel. Detta skulle ge mer fysiologiskt relevanta resultat för cellernas svar på läkemedel än konventionell 2D-odling.Denna teknik gör det möjligt för forskare att bättre utforska hur cancerceller beter sig och reagerar på en stimulans i tumörens mikromiljö, allt från svar på terapier eller interaktioner med andra celltyper.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studie av virala vektorer i en Tredimensionell Lever modell nyinsatta med Human Hepatocellulär cancer HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytta uppåt: Ett enkelt och flexibelt In Vitro tredimensionella Invasion Assay protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation av High-Throughput tredimensionella tumör Spheroids för drogkontroll

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Längsgående morfologiska och fysiologiska övervakning av tredimensionella tumör Spheroids använder optisk koherenstomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensionella ben extracellulärmatrix modell för osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Helt mänsklig tumör-baserade Matrix i tredimensionell sfäroid invasion assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tredimensionell modell av sfäroider för att studera tjocktarmscancerstamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafisk modell av Neuroblastom metastasering

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

En tredimensionell sfäroidmodell för att undersöka tumör-stromal interaktion i hepatocellulärt karcinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...