Name: three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds
Uploaded: 2021-07-09T14:15:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Çocuk Araştırma Merkezi (NCRC), İrlanda Araştırma Konseyi (IRC) ve Neuroblastoma UK tarafından desteklenmiştir. İllüstrasyonlar BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

<ol>
	<li>Davidoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).</li><li>Matthay, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma.">Neuroblastoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).</li><li>Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+the+3D+microenvironment+on+cancer+cell+behaviour+and+treatment+responsiveness:+a+recent+update+on+lung,+breast+and+prostate+cancer+models.">Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models.</a> Acta Biomaterialia. , (2021).</li><li>Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+the+genes,+the+tumor+microenvironment+in+neuroblastoma.">More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma.</a> Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).</li><li>Walker, C., Mojares, E., Del R&#237;o Hern&#225;ndez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+matrix+in+development+and+cancer+progression.">Role of extracellular matrix in development and cancer progression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).</li><li>Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+extracellular+matrix+direct+gene+expression.">How does the extracellular matrix direct gene expression.</a> Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).</li><li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reciprocity+in+the+wound+microenvironment.">Dynamic reciprocity in the wound microenvironment.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Medicine. 6, 11 (2008).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Medicine. 4, 38 (2006).</li><li>Ouellette, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+collagen+jungle:+The+biomedical+potential+of+fiber+organization+in+cancer.">Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer.</a> Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Hume, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell+invasiveness+and+response+to+chemotherapeutics+in+adipocyte+invested+3D+engineered+anisotropic+collagen+scaffolds.">Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).</li><li>Fitzgerald, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+collagen-based+scaffolds+to+simulate+prostate+cancer+bone+metastases+with+potential+for+evaluating+delivery+of+nanoparticulate+gene+therapeutics.">The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics.</a> Biomaterials. 66, 53-66 (2015).</li><li>Sapudom, J., Pompe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+tumor+microenvironments+based+on+collagen+matrices.">Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices.</a> Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).</li><li>Curtin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+relevant+3D+collagen-based+scaffold-neuroblastoma+cell+system+exhibits+chemosensitivity+similar+to+orthotopic+xenograft+models.">A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models.</a> Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).</li><li>Gavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma+invasion+strategies+are+regulated+by+the+extracellular+matrix.">Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix.</a> Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).</li><li>Casal, e. J., Crane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry, Glycosaminoglycans. , (2019).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+freezing+rate+on+pore+structure+in+freeze-dried+collagen-GAG+scaffolds.">Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).</li><li>Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinking+and+mechanical+properties+significantly+influence+cell+attachment,+proliferation,+and+migration+within+collagen+glycosaminoglycan+scaffolds.">Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).</li><li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment,+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).</li><li>Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+dehydrothermal+treatment+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).</li><li>Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nanohydroxyapatite+nanocomposites+for+bone+tissue+engineering.">Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering.</a> ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).</li><li>Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterisation+of+a+collagen+nano-hydroxyapatite+composite+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering.</a> Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).</li><li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age,+tumor+biology,+and+survival.">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li><li>Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+hydroxyapatite+incorporation+methods+on+the+structural+and+biological+properties+of+porous+collagen+scaffolds+for+bone+repair.">Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).</li><li>Tierney, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+collagen+concentration+and+crosslink+density+on+the+biological,+structural+and+mechanical+properties+of+collagen-GAG+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).</li><li>Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteomimicry+of+mammary+adenocarcinoma+cells+in+vitro;+increased+expression+of+bone+matrix+proteins+and+proliferation+within+a+3D+collagen+environment.">Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment.</a> PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).</li><li>Nolan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+neuroblastoma:+advances+and+challenges.">Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges.</a> Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).</li><li>Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+cell+responses+in+threedimensional+conductive+collagen+gel+scaffolds+with+conductive+polymer+nanofibres+for+tissue+regeneration.">Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration.</a> Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).</li><li>Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+analyze+three-dimensional+cell+distribution+and+infiltration+in+degradable+scaffolds.">Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds.</a> Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).</li><li>do Amaral, R. J. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalising+collagen-based+scaffolds+with+platelet-rich+plasma+for+enhanced+skin+wound+healing+potential.">Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).</li><li>Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogranin+A+as+a+valid+marker+in+oncology:+Clinical+application+or+false+hopes.">Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes.</a> World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).</li><li>O'Brien, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+permeability+and+cell+attachment+in+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering.">The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

3D yapı iskelesi-kanser hücresi modelinin, basitleştirilmiş bir TME32'de nöroblastom hücre büyümesi, canlılığı ve hücrelerin infiltrasyonu hakkında mekanik içgörü elde etmek için değerli ve çok yönlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Burada açıklanan 3D nöroblastom modeli, minimal TME'yi taklit eder ve 2D tek katmanlı bir kültürden daha fizyolojik olarak ilgili veriler sağlar. 3D hücre kültürünün önemli bir dezavantajı, artan deneysel karmaşıklık ve daha uzun zaman dilimleridir. Burada tarif edilen, nöroblastom hücrelerinin kollajen bazlı iskelelerde tohumlanması, büyümesi ve bakımı için optimize edilmiş bir protokoldür ve ardından hücre büyümesinin sağlam karakterizasyonunu sağlayan aşağı akış analizleri ve uygulamaları yapılır. 14 günlük hızlı bir deney penceresinde antikanser ilaç tedavilerini değerlendirmek için öngörülebilir ve kontrol edilebilir bir ortam yaratmak için iskeleler için en uygun hücre tohumlama yoğunluğu hakkında bilgi edinmeyi amaçladık. Açıklanan tüm bu basit protokollerin kombinasyonu, iskele tabanlı in vitro kültür sisteminde nöroblastom hücre büyümesinin çok yönlü bir değerlendirmesini sağlar.
Bilim insanlarının laboratuvarlarında hızlı bir şekilde kurabilmeleri için protokol kurgusundaki kritik noktalar vurgulanmıştır. Örneğin, kolorimetrik hücre canlılığı testinin daha iyi performansı için belirtilen inkübasyon süreleri, reaktifin tüm hücrelere ulaşmak için iskele gözeneklerine daha derin nüfuz etmesine izin verir. Ayrıca, floresan dsDNA boyama tekniği sağlam ve basittir; bununla birlikte, yapı iskelelerinden DNA salınımı, hücreler kollajen lifleri içinde 'sıkışıp kaldığı' için güçlü hücre lizizi gerektirir.
Açıklanan basit DNA miktar tayini testini kullanarak, bu modeli kullanarak antikanser ilaç taraması için kollajen bazlı iskeleler üzerindeki log büyüme fazını tanımlayabiliriz. Açıklanan deney ortamında, toplam 14 günlük bir süre ve 1, 7 ve 14. günlerde analiz zaman noktaları ile 4 başlangıç hücre tohumlama yoğunluğu kullanıldı. 4 × 105 hücre/iskelede tohumlanan KellyLuc hücrelerinin, 7. ve 14. günler arasında en belirgin aktif proliferasyon penceresine sahip olduğunu belirledik. Bu log faz büyüme verileri, çeşitli hücre sitotoksisite deneylerinin güvenilir bir şekilde yorumlanmasına izin verecektir. İlaç toksisitelerinden ziyade 3D gözenekli platformda bastırılmış büyümeden kaynaklanan büyüme veya hücre ölümündeki herhangi bir düşüş hakkındaki spekülasyonları ortadan kaldırır. Hücre canlılığı, farklı hücre tiplerinin büyümesini desteklemek için 3D platformların uygunluğu için de yaygın olarak kullanılan bir değerlendirmedir33,34. Canlı / ölü boyama, ATP ölçümü, proliferasyon testleri dahil olmak üzere hücre canlılığını ölçmek için birçok test olsa da, Alamar Blue kolorimetrik hücre canlılığı testinin kullanımının DNA miktar verilerini desteklemek için basit ve etkili bir teknik olduğunu gördük.
DNA nicelemesi ve hücre canlılığının birlikte kullanımı, ortalama olarak, 14 günlük bir süre boyunca sürekli büyüme elde etmek için iskele üzerindeki tohum hücrelerine optimal yoğunluğun 2-4 × 105 hücre/yapı iskelesi olduğuna dair tamamlayıcı kanıtlar sağlamıştır. Bununla birlikte, bu protokol, farklı deneysel zaman dilimlerini, analiz zaman noktalarını ve aşağı akış uygulamalarını karşılamak için kolayca uyarlanabilir. Bu protokol, yapı iskeleleri üzerinde nöroblastom hücrelerinin monokültür hücre büyümesinin değerlendirilmesini tanımlasa da, iskeleler, yara iyileşmesinin araştırılmasında keratinositleri ve fibroblastları birlikte kültürlemek için kollajen-GAG iskelelerini kullanan do Amaral ve ark. tarafından tanımlanan, ko-kültür için bir platform olarak kullanılmak üzere kolayca değiştirilebilir35.
Açıklanan 3D model, immünofloresan ve standart H&E gibi iyi bilinen farklı teknikler kullanılarak hücre büyümesinin ve infiltrasyonunun görselleştirilmesini sağlar. İskeleler üzerindeki hücre morfolojisi ve büyüme modellerinin çeşitliliği nedeniyle, biyokimyasal tahliller kullanılarak büyümenin karakterizasyonu ile birlikte hücrelerin görselleştirilmesi önemlidir. Büyüme modelini anlamak, büyüme davranışı ve antikanser ilaçlarına gelecekteki yanıt hakkında fikir verebilir. Örneğin, DNA nicelemesi kullanılarak IMR32 büyümesi Kelly'ye benzer modeller verir, ancak H &E kullanılarak görselleştirme üzerine IMR32, daha dağınık büyüme gösteren Kelly'den daha büyük kümelerde büyür (Şekil 9). İskelelerdeki hücre hatlarının bu çeşitli büyüme paternleri, tümör heterojenliğinin klinik senaryosunu yansıtır. 3D iskelelerde farklı morfolojilere sahip bir hücre hatları paneli kullanarak antikanser ilaç yanıtını incelemek, hastanın aynı ilaçlara verdiği yanıtın prediktif değerini artıracaktır.
Gen veya protein ekspresyonunun tespiti, ilgilenilen protein salgılanırsa RT-qPCR veya ELISA gibi diğer yaklaşımlar kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Nöroblastom ilerlemesinin vekil bir belirteci olan kromogranin A (CgA)36, nöroblastom hücre büyümesini 3D olarak karakterize etmek için ek olarak kullanıldı. Önceki çalışma17'de açıklandığı gibi, hücreler çoğaldıkça CgA sekresyonu artmıştır (Şekil 10). Tek katmanlı hücre kültürü bu artışı yakalayamazken, proliferasyon, hücrelerin kültür kaplarında tam birleşmeye ulaşması anlamına geldiğinden, 3D kollajen iskelelerinin kullanılması, CgA sekresyonunun uzun süreli değerlendirilmesine izin verdi.
Bu 3D in vitro model, nöroblastom biyolojisini ve terapötiklere yanıtı incelemek için tüm araştırma soruları için uygun olmayabilir. Sınırlamalardan biri, iskeleler içinde eşit olmayan hücre penetrasyonu ve belirli bir hücre hattına bağlı olan ve besinlerin ve test ilaçlarının kontrol edilemeyen difüzyonuna yol açabilen değişen büyüklükte hücre kümelerinin oluşmasıdır. Bu özellik terapötik taramadaki sağlamlığı etkiler. Bununla birlikte, bu sınırlamaya rağmen, doğal tümörlerin boyut ve kanser hücresi dağılımı açısından da heterojen olduğunu ve tümör dokusu içinde birçok başka hücre tipi içerdiğini dikkate almak önemlidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, hücre nüfuslu her bir iskelenin, aşağıdaki parametrelerin optimize edileceği tek bir mikro doku olarak kullanılmasını öneriyoruz: (a) hücre canlılığı reaktifinin hücrelere ve hücre kümelerine ulaşması için inkübasyon süreleri ve (b) yapı iskelesinin derinliklerinde bulunan hücrelerin DNA'sını serbest bırakmak için iskeleler üzerindeki hücrelerin bir doku parçalayıcı ile ön işlenmesiyle Triton X-100 tamponundaki hücrelerin parçalanması.
Bu protokolün bir diğer teknik sınırlaması, bu model için yeni üretilen iskelelerin her partisinin mekanik testinin yapılmamasıdır. Bununla birlikte, basınç ve çekme modülü, gözeneklilik ve görsel gözenek yapısı ve homojenlik gibi iskelelerin fiziksel ve kimyasal özellikleri ile ilgili olarak kapsamlı bir şekilde karakterize edilen iskelelerin sağlam imalat sürecinin kullanılması, iskele kalitelerinin 21,24,27,30,37 partileri aracılığıyla korunmasını sağlar.
Özetle, bu makale, kollajen bazlı iskelelerde hücresel büyümenin analizi için bir dizi basit yöntem sunmaktadır. Hem deneysel zaman çizelgesi hem de analiz noktaları, belirli araştırma sorularına bağlı olarak değiştirilebilir. Bu protokol aynı zamanda diğer hücre tiplerine de uyarlanabilir. Yukarıda gösterilen sonuçlar, bu yöntem derlemesinin, çeşitli nöroblastom hücre hatlarının 14 gün boyunca sürekli büyüme yaratması için en uygun tohumlama yoğunluğu hakkında nasıl fikir verdiğine dair kanıt sağlar. Bu protokoldeki tüm yöntemlerden elde edilen sonuçların birleştirilmesi, 3D kollajen matrisi içinde hücre büyümesinin üstün bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bu modelin gelecekteki kullanımı muhtemelen nöroblastom TME'ye özgü ko-kültür sistemlerini ve çeşitli yeni antikanser ilaçların test edilmesini içerecektir.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Fergal J. O&#8217;Brien3,4,5 
Olga Piskareva1,2,3,5,6 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
6National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3 
Catherine Murphy*1,2,3 
Graeme Kelly4 
Fergal J. O&#8217;Brien3,5,6 
Olga Piskareva1,2,3,6,7 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland 
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen&#8217;s Green, Dublin 2, Ireland 
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland 
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland 
7National Children&#8217;s Research Centre, Our Lady&#39;s Children&#39;s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62627">Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds

Nöroblastom, nöral krest hücrelerinin dönüşümü nedeniyle embriyonik gelişim veya doğum sonrası erken yaşam sırasında ortaya çıkan sempatik sinir sisteminin pediatrik bir kanseridir1. Çocuklarda en sık görülen solid ekstrakraniyal tümördür, 15 yaşın altındaki hastalarda teşhis edilen malignitelerin %8'ini temsil eder ve tüm çocukluk çağı kanser ölümlerinin %15'inden sorumludur. Hastalık, spesifik kromozomal, genetik ve epigenetik değişiklikler ve histopatoloji özellikleri nedeniyle oldukça heterojen klinik davranışlar gösterir.
Bu değişiklikler nöroblastomun agresifliğine ve pediatrik hastalarda kötü sonuçlara katkıda bulunur. Bu nedenle, mevcut tedavilerin klinik olarak agresif hastalığı olan hastaların neredeyse %80'i için uzun vadede etkisiz olduğu kanıtlanmıştır2 ve bu hasta grubu için tedavinin zor olduğu gerçeğini vurgulamaktadır. Bunun nedeni muhtemelen nöroblastom heterojenliği ve metastaz mekanizmalarının hala tam olarak anlaşılamamasıdır. Bununla birlikte, tümör mikroçevresinin (TME) artık birçok kanserin ilerlemesinde rol oynadığına inanılmaktadır; Yine de nöroblastomdayeterince çalışılmamıştır 3,4.
Doğal TME, bir ECM ile çevrili kanserli ve kanserli olmayan hücreleri içeren karmaşık bir 3D mikro ortamdır. ECM, hücresel sakinlerine yapısal ve biyokimyasal destek sağlayan ve hastalığın ilerlemesine, hasta prognozuna ve terapötik yanıta katkıda bulunan bir dokunun hücresel olmayan bileşenini ifade eder5. Hastalığın ilerlemesinin bu şekilde teşvik edilmesi, "dinamik karşılıklılık" veya hücreler ile ECM 6,7,8 arasında devam eden çift yönlü iletişimden kaynaklanmaktadır. Kanser ilerledikçe, stromal kollajen genellikle kanser hücrelerinin metastaziçin bir göç yolu olarak kullandığı stroma-kanser arayüzüne dik doğrusal desenlerde yeniden düzenlenir 9,10,11.
Bu doğal fonksiyonel biyolojik iskelenin ana bileşenleri, lifli bir kollajen ağı tip I ve II ve elastin, laminin gibi glikoproteinlerin yanı sıra bir dizi proteoglikan ve diğer çözünür bileşenleri içeren diğer proteinleri içerir12,13. Doğal ECM'nin bu proteinleri artık 3D in vitro modeller geliştirmek için çekici doğal biyomoleküller haline geldi3. İn vitro hücre kültürü için 3D yapı iskelelerinin uygulanması, geleneksel 2D tek tabakalı kültüre kıyasla TME'nin daha fazla fizyolojik temsili nedeniyle popülaritesini artırmaktadır. Üretilen 3D iskeleler, hücre bağlanmasına, çoğalmasına, göçüne, metabolizmaya ve in vivo biyolojik sistemlerde görülen uyaranlara yanıt vermeye yardımcı olur.
Bu 3D yapı iskelelerinin ana bileşeni, doku onarımı, anjiyogenez, doku morfogenezi, hücre yapışması ve göç dahil olmak üzere birçok normal biyolojik süreçte önemli bir oyuncu olan kolajendir11. Kollajen bazlı 3D matrisler, hücre-ECM etkileşimlerinin yanı sıra hücre göçü ve istilasını sağlarken in vitro biyomimetik bir mikro ortam olarak hizmet ederek ECM'yi modellemek için sağlam işlevselliklerini göstermiştir. Bu 3D matrisler ayrıca, nöroblastom17,18 dahil olmak üzere birçok kanser modelinde 14,15,16 geleneksel 2D veya "düz" kültürden kemoterapötik ilaçlara hücre yanıtının daha doğru bir analizini sağlar. 3D hücre kültürlerinin genetik analizi, hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında bile insan doku profili ile daha yüksek bir korelasyon bildirmiştir19. Genel olarak, bu 3D yapı iskelelerinin temel taşı, hücrelere doğal doku mimarisini özetleyen ve çift yönlü moleküler karışmayı kolaylaştıran uygun bir in vitro ortam sağlamaktır8.
Kollajen bazlı modellerin karmaşıklığını artırmak için, diğer yaygın ECM bileşenleri doku mühendisliği sürecine dahil edilir, böylece farklı dokuların niş TME'lerini yansıtmak için fizyolojik olarak daha ilgili modeller oluşturulur. Örneğin, tüm memeli dokularında20 bulunan negatif yüklü polisakkaritler olan GAG'lar, hücre bağlanmasını, göçünü, çoğalmasını ve farklılaşmasını kolaylaştırır. Kondroitin sülfat, daha önce kemik onarımı için doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmış olankemik ve kıkırdakta bulunan spesifik bir GAG türüdür 21,22,23,24,25. Nano-hidroksiapatit (nHA), insan kemik dokularının mineral bileşiminin ana inorganik bileşenidir ve ağırlığın %65'inioluşturur 26 ve bu nedenle kemik replasmanı ve rejenerasyonu için yaygın olarak kullanılır27. Bu nedenle, GAG'lar ve nHA, primer nöroblastom ECM'sini yeniden yapılandırmak ve nöroblastom, kemik iliği (%70.5) ve kemiğin (%55.7) en yaygın metastatik bölgelerini modellemek için çekici bileşiklerdir28.
Bu ECM bileşenlerini içeren iskeleler, başlangıçta biyouyumluluk, toksisite ve osteokondüktif ve osteoindüktif özelliklerinin kapsamlı analizi ile kemik dokusu mühendisliği uygulamaları için geliştirilmiştir29,30. Fiziksel ve biyolojik özelliklerini kontrol etmek için dondurarak kurutma teknikleri kullanılarak üretilen gözenekli, kolajen bazlı matrislerdir. nHA (Coll-I-nHA) veya kondroitin-6-sülfat (Coll-I-GAG) ile takviye edilen kollajen iskeleleri, meme kanserinde31 primer TME'yi taklit etmede ve prostat kanserinde15 kemiğe metastaz yapmada başarı gösterdi ve nöroblastom17. Bu kompozit iskeleleri üretmek için kullanılan dondurarak kurutma tekniği, iskeleler içinde gözenek boyutu ve gözeneklilik açısından tekrarlanabilir homojenlik sağlar22,23,24. Kısaca, fibriller kollajenin 0.05 M asetik asit ile karıştırılmasıyla bir kollajen bulamacı (ağırlıkça% 0.5) üretilir. Coll-I-GAG için, karıştırma sırasında kollajen bulamacına köpekbalığı kıkırdağından izole edilen krondoitin-6-sülfatın ağırlıkça% 0.05'i eklenir. Kompozit Coll-I-nHA iskeleleri için, nano boyutlu hidroksiapatit parçacıkları daha önce tarif edildiği gibisentezlenir 27 ve harmanlama işlemi sırasında kollajen ağırlığına 2: 1 oranında kollajen bulamacına eklenir. Tüm iskeleler fiziksel olarak çapraz bağlanır ve 105 °C'de 24 saat25 boyunca dehidrotermal işlem kullanılarak sterilize edilir. Silindirik iskeleler (6 mm çap, 4 mm yükseklik) bir biyopsi zımbası kullanılarak elde edilir ve yapıların mekanik özelliklerini iyileştirmek için damıtılmış suda (dH2O) 3 mM N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilkarbodiimid hidroklorür ve 5.5 mM N-hidroksisüksinimid (EDAC / NHS) ile kimyasal olarak çapraz bağlanabilir30. İki kollajen iskelesinin bu iyi optimize edilmiş üretim süreci, gözenek boyutu, gözeneklilik ve sertlik (kPa) dahil olmak üzere tekrarlanabilir mekanik özelliklere sahip iskeleler oluşturur. Hem Coll-I-GAG hem de Coll-I-nHA iskeleleri, farklı çevresel koşullar yaratan farklı fiziksel özelliklere sahiptir. Her iskelenin özellikleri Tablo 1'de gösterilmektedir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Coll-I-GAG</td>
			<td>Coll-I-nHA</td>
		</tr><tr><td>İskele Boyutu (çap [mm] x yükseklik [mm])</td>
			<td>6 x 4 17</td>
			<td>6 x 4 17</td>
		</tr><tr><td>Kollajen Konsantrasyonu (ağırlıkça%)</td>
			<td>0,5 17</td>
			<td>0,5 17</td>
		</tr><tr><td>Substrat Konsantrasyonu (ağırlıkça%) [kollajen ağırlığına göre]</td>
			<td>0,05 15,17</td>
			<td>200 17</td>
		</tr><tr><td>Ortalama gözenek boyutu (mm)</td>
			<td>96 22</td>
			<td>96 – 120 29</td>
		</tr><tr><td>Gözeneklilik (%)</td>
			<td>99.5 23</td>
			<td>98,9 – 99,4 27</td>
		</tr><tr><td>Sertlik (kPa)</td>
			<td>1.5 27</td>
			<td>5,5 - 8,63 29</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Nöroblastom biyolojisini incelemek için kullanılan iki iskelenin mekanik özelliklerine genel bakış.
Bu makale, nöroblastom hücre hatlarını ve daha önce nHA (Coll-I-nHA) veya kondroitin-6-sülfat (Coll-I-GAG) ile desteklenmiş kollajen bazlı iskeleleri kullanarak nöroblastom mikroçevresini daha iyi taklit etmek için 3D iskele tabanlı bir sistemin bir araya getirilmesi protokolünü açıklamaktadır. Protokol, 2D tek katmanlı kültürden uyarlanmış önceden optimize edilmiş ucuz yöntemler kullanarak nöroblastom hücrelerinin büyüme mekanizmalarını fizyolojik olarak daha ilgili bir ortamda analiz etmek için aşağı akış yöntemlerini içerir Şekil 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig01.jpg"> Şekil 1: Genel protokol iş akışı. (A) Hücreler yeterli sayıya kadar büyütülür, bölünür, sayılır ve uygun bir hacimde yeniden süspanse edilir. (B) Bu hücre stoğu daha sonra farklı yoğunluklarda toplam 4 hücre süspansiyonu hazırlamak için seri seyreltmeye tabi tutulur. (C) Kollajen bazlı iskeleler, yapışmayan 24 oyuklu plakalara steril olarak kaplanır ve (D) her bir iskelenin ortasına 20 μL hücre süspansiyonu eklenir ve 37 °C, %5CO2 ve %95 nemde 3-5 saat inkübe edilmeye bırakılır. (E) Tam büyüme ortamı (1 mL) daha sonra her bir iskeleye yavaşça eklenir ve plakalar, istenen zaman dilimi için hücre büyümesine izin vermek için inkübatöre geri yerleştirilir. (F) Önceden belirlenmiş her zaman noktasında, hücre canlılığı ve büyüme değerlendirmesi, gen ekspresyon analizi ve histolojik boyama için birkaç iskele alınır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-32</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>82110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KellyCis83</td>
			<td>Made in lab &#8211; derived from Kelly (Piskareva et al., 2015)</td>
			<td>-</td>
			<td>Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL sterile Pot</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic pipette</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Biopsy punches</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>BP-60F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPERflask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS10030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1840AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque black 96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P10 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P1000 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P20 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile P200 tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 (175 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 (75 cm2 flask)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3911.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent clear 96 well plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent non-adherent 24 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>83.3922.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Astell</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser&#160; Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin section flotation bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette electronic dispenser</td>
			<td>Corning</td>
			<td>StripipetterUltra</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cooler</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140C</td>
			<td>Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -20 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator -80 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4 &#176;C</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>DLAb</td>
			<td>SK-D1807-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer &#8211; Victor3V Platereader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood/Laminar flow hood</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8038-30-1044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax embedder</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Water</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen- glycosaminoglycan scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen-nanohydroxyapatite scaffold</td>
			<td colspan="3">Tissue engineering research group (TERG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH20</td>
			<td>Adrona - Biosciences</td>
			<td>568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O&#8217;Brien et al., 2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21765-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemaytoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA easy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNEAA&#8217;s</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>015140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-4LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>-</td>
			<td>Excel 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>-</td>
			<td>Version 9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional in vitro biomimetic model of neuroblastoma using collagen-based scaffolds

Nöroblastom, çocuklarda en sık görülen ekstrakraniyal solid tümördür ve genel pediatrik kanser ölümlerinin %15'ini oluşturur. Doğal tümör dokusu, hücre dışı bir matris (ECM) ile çevrili kanserli ve kanserli olmayan hücre katmanlarını içeren karmaşık bir üç boyutlu (3D) mikro ortamdır. ECM, fiziksel ve biyolojik destek sağlar ve hastalığın ilerlemesine, hasta prognozuna ve terapötik yanıta katkıda bulunur.
Bu makale, nöroblastom hücre hatları ve kollajen bazlı iskeleler kullanarak nöroblastom mikroçevresini taklit etmek için 3D iskele tabanlı bir sistemin montajı için bir protokolü açıklamaktadır. İskeleler, nöroblastomun en yaygın metastatik bölgeleri olan kemik ve kemik iliğinde doğal olarak yüksek konsantrasyonlarda bulunan nanohidroksiapatit (nHA) veya glikozaminoglikanlar (GAG'ler) ile desteklenir. Bu iskelelerin 3 boyutlu gözenekli yapısı, nöroblastom hücre bağlanmasına, çoğalmasına ve göçüne ve hücre kümelerinin oluşumuna izin verir. Bu 3D matriste, terapötiklere hücre tepkisi, in vivo durumu daha iyi yansıtmaktadır.
İskele tabanlı kültür sistemi, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültüründen daha yüksek hücre yoğunluklarını koruyabilir. Bu nedenle, ilk tohumlama hücre sayıları için optimizasyon protokolleri, istenen deneysel zaman dilimlerine bağlıdır. Model, DNA ölçümü yoluyla hücre büyümesini, metabolik deneyler yoluyla hücre canlılığını ve histolojik boyama yoluyla yapı iskeleleri içindeki hücre dağılımını değerlendirerek izlenir.
Bu modelin uygulamaları, gen ve protein ekspresyon profillerinin değerlendirilmesinin yanı sıra geleneksel ilaçlar ve miRNA'lar kullanılarak sitotoksisite testini içerir. 3D kültür sistemi, hücre ve ECM bileşenlerinin hassas bir şekilde manipüle edilmesine izin vererek, fizyolojik olarak doğal tümör dokusuna daha benzer bir ortam yaratır. Bu nedenle, bu 3D in vitro model, hastalık patogenezinin anlaşılmasını ilerletecek ve elde edilen sonuçlar arasındaki korelasyonu geliştirecektir in vitro, in vivo hayvan modelleri ve insan denekler.

Burada açıklanan kollajen bazlı iskele modeli, nöroblastom biyolojisinin incelenmesinden, geleneksel 2D hücre kültüründen daha fizyolojik olarak doğal tümörlere daha benzer bir ortamda antikanser terapötiklerinin taranmasına kadar birçok uygulamaya sahiptir. Belirli bir araştırma sorusunu test etmeden önce, istenen deneysel zaman dilimi içinde hücre bağlanması, proliferasyonu ve infiltrasyonunun tam bir karakterizasyonunu elde etmek çok önemlidir. Büyüme koşulları, her bir spesifik hücre hattının biyolojisine bağlı olacaktır. Daha da önemlisi, optimal koşulları ve sağlam performansı belirlemek için çeşitli hücre büyümesi değerlendirme yöntemleri uygulanmalıdır.
Burada, iskelelerde büyütülen nöroblastom hücrelerinin canlılığı, kolorimetrik hücre canlılığı testi kullanılarak değerlendirildi. Bu test, deneysel zaman dilimi boyunca istenildiği kadar sık gerçekleştirilebilir. Açıklanan deney için, 4 farklı yoğunlukta Coll-I-nHA iskelelerinde büyütülen iki nöroblastom hücre hattı, KellyLuc ve IMR32 için 1, 7 ve 14. günlerde hücre canlılığı değerlendirmesi yapıldı (Şekil 6). 1. Gündeki canlılık, sonraki tüm ölçümleri karşılaştırmak için bir temel olarak belirlendi. Hücre canlılığı reaktifinin azalma hızı, proliferasyon hızları ve metabolizmaları dahil olmak üzere tek tek hücre hatlarının hücre biyolojisini ve büyüme özelliklerini yansıtır. İskelelere ekilen hücre sayısı ile azalma seviyesi arasında bir korelasyon bekleniyordu. Bu deneyde, hücre canlılığı reaktifinin azalması, beklendiği gibi, her iki hücre hattı için her bir zaman noktasında genellikle artmıştır.
Her yoğunluk daha sonra zaman noktaları arasındaki azalmayı karşılaştırmak için her iki hücre hattı için ayrı ayrı değerlendirildi. Zaman noktaları arasındaki azalmada önemli farklılıkları tespit etmek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA yapıldı (Şekil 7). Hem hücre hatları hem de tüm tohumlama yoğunlukları için, 1. gün ve 14. gün karşılaştırıldığında hücre canlılığı reaktifinin azalmasında önemli bir artış (P<0.05) vardı. Bu, iskelelerde bulunan metabolik olarak aktif hücrelerde önemli bir artış olduğunu gösterdi. Bu artış, 7 günlük aralıklar (1. gün - 7. gün, 7. gün - 14. gün) değerlendirilirken her durumda önemli değildi ve istenen büyüme penceresini elde etmek için tohumlama yoğunluğunun optimizasyonunun önemini gösterdi.
Hücre canlılığı testinin sonuçlarını desteklemek için, iskelelerdeki hücre büyümesi, bir floresan dsDNA boyası kullanılarak iskelelerden ekstrakte edilen dsDNA'nın miktar tayini yoluyla dolaylı olarak da ölçülebilir (Şekil 8A). Hücre canlılığı gibi, DNA nicelemesi de deneysel zaman çizelgesi içinde istenildiği kadar sık yapılabilir. Bununla birlikte, bu analiz, iskelelerin tamamen alınmasını ve hücre büyümesinin sonlandırılmasını gerektirir ve bu nedenle bölüm 1'de tartışıldığı gibi deneysel planlamaya dahil edilmelidir. Bu deney için, DNA, 4 farklı yoğunlukta Coll-I-nHA iskelelerinde büyütülen iki nöroblastom hücre dizisi olan KellyLuc ve IMR32 için 1, 7 ve 14. günlerde ölçüldü. Bu hücre dizileri için hücre başına ortalama dsDNA konsantrasyonu bilindiğinden, niceliklenmiş DNA'dan numune başına hücre sayısını elde etmek mümkün olmuştur (Şekil 8B).
DNA nicelemesi, biyolojik kopyalar arasında hücre canlılığı değerlendirmesinden daha yüksek değişkenliğe yol açtı, ancak genellikle her zaman noktası için arttı ve en yüksek seviyeler 14. günde ölçüldü. IMR32 hücreleri, DNA konsantrasyonu ile gösterildiği gibi, Coll-I-nHA iskelelerinde KellyLuc hücrelerinden daha yüksek hücre sayılarına ulaşıyor gibi görünmektedir. Her yoğunluk daha sonra zaman noktaları arasındaki azalmayı karşılaştırmak için iki hücre hattı için ayrı ayrı değerlendirildi. Zaman noktaları arasındaki azalmada önemli farklılıkları tespit etmek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA yapıldı (Şekil 8B).
Hem hücre hatları hem de tüm tohumlama yoğunlukları için, 1. gün ve 14. gün karşılaştırıldığında hücre sayılarında önemli bir artış (P<0.05) vardı, tohumlama yoğunluğu 4'teki KellyLuc hariç (1 × 105 hücre/iskele), bu da herhangi bir zaman noktasında önemli artışlar sağlamadı. Hücre canlılığı sonuçlarına benzer şekilde, 7 günlük aralıklar değerlendirilirken artışlar tüm vakalarda anlamlı değildi (1. gün vs. 7. gün, 7. gün vs. 14. gün). Hücre canlılığı ve DNA ölçümü için zaman noktası eğilimlerini karşılaştırırken, iki analiz arasında bazı küçük farklılıklar vardı. Bununla birlikte, genel olarak benzer eğilimler gözlendi ve çoğu yoğunluk için ortalama değerler 7 günlük aralıklarla arttı. Bu, hücre büyümesinin birden fazla yöntem kullanılarak izlenmesinin önemini göstermektedir.
Daha sonra, geleneksel hematoksilen ve eozin (H & E) boyamanın yanı sıra IHC'yi de kapsayan, yapı iskeleleri üzerindeki hücre büyümesi morfolojisi ve dağılımının görsel bir değerlendirmesi uygulandı. Bireysel hücre hatlarının farklı büyüme modellerinin, iskeleye farklı derecelerde penetrasyon ve hücre kümelenmesi dahil olmak üzere iskeleler üzerinde çeşitli mekansal düzenlemelere yol açması beklenmektedir. İskeleler formalinle sabitlendi, parafine gömüldü ve 5 mm'lik kesitler halinde kesildi (Şekil 9A), iskeleler histolojik boyama ve IHC dahil olmak üzere çoklu görselleştirme teknikleri için hazırlandı.
Kollajen bazlı iskelelerde büyütülen Kelly, KellyCis83 ve IMR32 hücrelerine 1, 7 ve 14. günlerde rutin H&E boyaması uygulandı (Şekil 9B). Bu, hücrelerin uzamsal yöneliminin 14 günlük bir süre boyunca iki kollajen bazlı iskele üzerinde görselleştirilmesine izin verdi. Sisplatine duyarlı Kelly hücreleri ve dirençli KellyCis83 hücreleri, hem Coll-I-nHA iskelelerinde (Şekil 9B, i) hem de Coll-I-GAG iskelelerinde (Şekil 9B, ii) büyütüldü. Daha önce yayınlanmış verilerle tutarlı olarak, KellyCis83 hücreleri daha yüksek bir oranda büyüdü ve daha az invaziv Kelly hücre hattından daha az invaziv olan her iki iskele bileşimine de daha derine sızdı. Coll-I-nHA üzerinde büyüyen başka bir nöroblastom hücre hattı olan IMR32'nin H&E boyası, zıt bir büyüme paterni gösterir (Şekil 9B, iii). Bu hücre dizisi, 14 günlük süre boyunca kollajen iskeleleri üzerinde büyük, yoğun bir şekilde paketlenmiş kümeler halinde büyüdü. Brightfield konfokal mikroskopi, kollajen liflerinin otofloresansı nedeniyle kollajen bazlı iskelelerin gözenekli mimarisini görselleştirmek için kullanılabilir (Şekil 9C).
Deneysel zaman çizelgesi boyunca spesifik hücre özelliklerini izlemek için hücre iskeleti aktinini ve nükleer karşı boyayı hedefleyen falloidin ve nükleer karşı boya, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile hücreleri boyadık. Bu teknik kullanılarak Coll-I-GAG iskelelerinde Kelly ve KellyCis83 hücrelerinde bol miktarda aktin gözlendi (Şekil 9D). Bu sonuçlar, bu protokolü kullanarak iskelelerde büyütülen nöroblastom hücrelerinden uzamsal olarak çözülmüş bilgi elde etmek için çoklu görüntüleme tekniklerinin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Belirli bir süre boyunca kollajen bazlı iskeleler üzerindeki hücre büyüme modellerinin bu karakterizasyonu, herhangi bir aşağı akış biyokimyasal tahlillerinin anlaşılmasını ve yorumlanmasını geliştirecektir.
Kollajen bazlı iskelelerde yetiştirilen hücreler tarafından protein ekspresyonu, hücresel aktiviteyi in vivo senaryolarla karşılaştırmak için analiz edilebilir. Daha önce yayınlanmış veriler, hücre tek tabakalarında ve ayrıca Coll-I-nHA ve Coll-I-GAG iskelelerinde büyüyen KellyLuc ve KellyCis83Luc hücreleri tarafından nöroblastomun vekil salgılanan bir belirteci olarak kromogranin A (CgA) ekspresyonunu incelemiştir (Şekil 10). CgA, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanılarak şartlandırılmış ortamda değerlendirildi (Şekil 10A). CgA, daha agresif kemo-dirençli KellyCis83 hücre hattında Kelly'den daha yüksek oranda salgılanır (Şekil 10B, C). Bu, hem Coll-I-GAG hem de Coll-I-nHA iskelelerinde 7. günde anlamlıydı (P<0.05), oysa bu zaman noktasında geleneksel 2D kültür ile tek tabaka olarak büyütülen hücreler için önemli bir fark yoktu.
Bu sonuçlar aynı zamanda, hücreleri tek katmanlı olarak büyütürken, hücreler birleşmeye ulaşmadan önce yalnızca 7 günlük büyümenin mümkün olduğunu kanıtlayan kısıtlı deneysel zaman çizelgesini vurgulamaktadır. İskelelerdeki hücrelerin büyümesi, fizyolojik olarak daha ilgili koşullarda daha uzun bir süre boyunca korunabildikleri için bu sınırlamanın üstesinden gelir. Hücre canlılığı, DNA içeriği, hücresel morfoloji ve uzamsal düzenleme ve ekspresyon profilleri hakkında bilgi edinmek için yukarıdaki tekniklerin kombinasyonu, bir dizi kollajen bazlı yapı iskelesi üzerinde nöroblastom hücrelerinin büyümesinin değerlendirilmesini kolaylaştırır. Bu protokol ayrıca belirli deneysel gereksinimleri ve istenen uygulamaları karşılamak için kolayca uyarlanabilir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig06.jpg"> Şekil 6: Hücre canlılığı analizi. (A) Kolorimetrik hücre canlılığı testi kullanılarak kollajen bazlı iskelelerde nöroblastom hücrelerinin canlılığını ölçmek için genel prosedür. Kuluçka süresi, üreticinin yönergelerine atıfta bulunarak her yeni hücre hattı için optimize edilmelidir. (B) 1, 7 ve 14. günlerde ölçülen, dört farklı başlangıç tohumlama yoğunluğunda Coll-I-nHA iskelelerinde yetiştirilen KellyLuc ve IMR32 hücreleri tarafından hücre canlılığı reaktifinin yüzde azalması. Numuneler, standart sapmayı temsil eden hata çubukları ile biyolojik üçlü olarak değerlendirildi. Kısaltmalar: nHA = nanohidroksiapatit; Coll-I-nHA = nHA ile desteklenmiş kollajen iskeleleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig07.jpg"> Şekil 7: 14 günlük bir süre boyunca Coll-I-nHA üzerinde yetiştirilen hücreler için tohumlama yoğunluğu ile hücre canlılığı. (a) KellyLuc; (B) IMR32. Başlıklı hücre numaraları, 0. günde iskelelerdeki ilk hücre tohumlama yoğunluğunu ifade eder. Numuneler, ortalamayı temsil eden çubuklarla üçlü noktalarla gösterilen biyolojik üçlü olarak değerlendirildi. Grafiklerde belirtilen üç zaman noktasında % hücre canlılığı reaktif azalmasındaki önemli farklılıkları tespit etmek için Çoklu Karşılaştırmalı Tek Yönlü ANOVA kullanıldı (ns P > 0.05, * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001). Kısaltmalar: nHA = nanohidroksiapatit; Coll-I-nHA = nHA ile desteklenmiş kollajen iskeleleri; ANOVA = varyans analizi; ns = önemli değil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig08.jpg"> Şekil 8: İskelelerdeki hücrelerden ekstrakte edilen DNA'nın miktarının belirlenmesi . (A) Floresan dsDNA boyası kullanılarak kollajen bazlı iskelelerde büyütülen hücrelerden dsDNA'nın ölçülmesi işlemi. (B) 14 günlük bir süre boyunca Coll-I-nHA üzerinde yetiştirilen KellyLuc ve IMR32 hücreleri için tohumlama yoğunluğu ile DNA miktar tayini analizinden elde edilen hücre sayıları. Başlıklı hücre numaraları, 0. günde iskelelere ilk hücre tohumlama yoğunluğunu ifade eder. Numuneler, ortalamayı temsil eden çubuklarla üçlü noktalarla gösterilen biyolojik üçlü olarak değerlendirildi. Grafiklerde belirtilen üç zaman noktasında hücre sayılarındaki önemli farklılıkları tespit etmek için Çoklu Karşılaştırmalı Tek Yönlü ANOVA kullanıldı (ns P > 0.05, * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001). Kısaltmalar: nHA = nanohidroksiapatit; Coll-I-nHA = nHA ile desteklenmiş kollajen iskeleleri; dsDNA = çift sarmallı DNA; TE = Tris-EDTA; ANOVA = varyans analizi; ns = önemli değil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig09.jpg"> Şekil 9: İskelelerin immünohistokimya analizi için doku işleme adımları . (A) Görüntü analizi için yapı iskelelerinin işlenmesi için protokolün şematik gösterimi. Bu işlem, primer antikorlar ve floresan etiketli sekonder antikorlar kullanılarak rutin histolojik boyamaya ve spesifik antikor araştırmasına izin verir. (B) H&E boyamaya tabi tutulan üç nöroblastom hücre hattının temsili görüntüleri. H&E görüntüleri, deneyin süresi boyunca büyüme modellerini izlemek için 1, 7, 14. günlerde alınır. Ölçek çubuğu = 200 μm. Kesikli kareler, sol alt kenarda yakınlaştırılmış 20x görüntüler için seçilen alanı temsil eder. Ölçek çubuğu = 20 μm. (i ve ii) Kelly ve KellyCis83 nöroblastom hücre hatlarının H&E'si (sırasıyla üst ve alt paneller) iki tip kollajen bazlı iskele üzerinde. (iii) Coll-I-nHA iskelesi üzerinde kümelenmiş hücresel büyümeyi temsil eden IMR32 hücre hattının H&E'si. (C) Parlak alan konfokal mikroskobuna tabi tutulan Kelly hücre hattının temsili görüntüsü. Kollajen otofloresansı, gözenekli iskelenin görselleştirilmesini sağlar. 10x Ölçek çubuğu = 200 μm, 20x ölçek çubuğu = 20 μm. (D) Gömülü iskelelerin temsili görüntüsü, ardından 10x büyütmede phalloidin ve DAPI ile IHC tarafından analiz, Ölçek çubuğu = 200 μm. Daha küçük iç kareler yakınlaştırılmış görüntüleri (20x) temsil eder, ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: nHA = nanohidroksiapatit; Coll-I-nHA = nHA ile desteklenmiş kollajen iskeleleri; GAG = glikozaminoglikan; Coll-I-GAG = kondroitin-6-sülfat ile takviye edilmiş kollajen iskeleleri; H&E = hematoksilen ve eozin; IHC = immünohistokimya; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62627/62627fig10.jpg"> Şekil 10: 2D plastiğe kıyasla 3D kollajen bazlı iskelelerde büyütülen nöroblastom hücreleri tarafından protein ekspresyonu. (A) CgA ELISA'nın 2D plastik veya 3D kollajen bazlı iskeleler üzerinde büyütülen hücrelerin şartlandırılmış ortamında nasıl gerçekleştirildiğinin bir şeması. (B) 2D plastik tek tabaka üzerinde büyütülen hücrelerin şartlandırılmış ortamından alınan CgA protein ekspresyon seviyeleri. Hücreler 7 gün sonra birleştiğinde, 14 günlük zaman noktası okunamıyordu. Plastikte 7. günde, Kelly ve KellyCis83 hücre hatları arasında CgA seviyelerinde anlamlı bir fark yoktu. (C) CgA ELISA, art arda 14 gün boyunca kollajen bazlı iskelelerde büyütülen hücrelerin şartlandırılmış ortamı kullanılarak gerçekleştirildi. 7. günde, her iki kollajen iskelesinde, daha agresif KellyCis83 hücre hattında CgA seviyeleri daha yüksektir ve 2D tek tabakaya kıyasla 3D matriste daha fizyolojik ilgili CgA seviyelerini vurgular. Bu rakam Curtin ve ark.17'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: 3D = üç boyutlu; 2D = iki boyutlu; CgA = kromogranin A; ELISA = enzime bağlı immünosorbent testi; nHA = nanohidroksiapatit; Coll-I-nHA = nHA ile desteklenmiş kollajen iskeleleri; GAG = glikozaminoglikan; Coll-I-GAG = kondroitin-6-sülfat ile takviye edilmiş kollajen iskeleleri; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin; HRP = yaban turpu peroksidaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62627/62627fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds at JoVE.com

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Bu makale, daha önce tarif edilen üç boyutlu kollajen bazlı iskelelerde nöroblastom hücre hatlarını tohumlamak, önceden belirlenmiş bir zaman dilimi için hücre büyümesini sürdürmek ve çeşitli hücre büyümesi ve hücre davranışı analizleri ve aşağı akış uygulamaları için iskeleleri almak için gereken adımları listeler.

Kollajen Bazlı İskeleler Kullanılarak Nöroblastomun Üç Boyutlu İn Vitro Biyomimetik Modeli

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Protokolümüz, doğal dokuyu yakından etkileyen 3D biyo-mühendislik modeli sunar. Bu, potansiyel olarak nöroblastom tedavisi ve teşhisi için yeni terapötikler ve biyobelirteçler keşfetmek için kullanılabilir. Başlıca avantajı, partiden partiye tutarlılık sağlayan tekrarlanabilir bir teknik kullanarak tümör mikroçevresini incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili deneysel koşullar yaratmasıdır.İskele yöntemimiz ilk olarak, nöroblastom için yeni terapötikleri tanımlamak ve ikinci olarak, bireysel hasta yanıtını daha iyi tahmin etmek için hastadan türetilen hücreleri dahil etmek için kullanılabilir. Başlamak için, PBS'de depolanan iskeleyi laminer akış başlığına yerleştirin. İskeleyi köşeden nazikçe kaldırmak için steril cımbız kullanın ve fazla PBS'yi çıkarmak için yan duvara bastırın.Ardından iskeleyi, parlak tabaka aşağı bakacak şekilde, yapışmayan 24 oyuklu bir plakanın kuyusunun ortasına yerleştirin. Plakayı hücre çizgisi, tohumlama yoğunluğu ve zaman noktalarının ayrıntılarıyla etiketleyin. Her seferinde bir tohumlama yoğunluğuna sahip hücrelerle çalışın ve kalan hücreleri kullanıma hazır olana kadar inkübatörde 37 santigrat derecede tutun.İskeledeki hücre bağlantısı için, hücre süspansiyonunu iyice karıştırmak için steril uçlu bir P20 pipeti kullanın ve her bir iskelenin ortasına 20 mikrolitre ilgili hücre süspansiyonu ekleyin, böylece hücre süspansiyonunun kuyunun yan duvarında veya tabanında değil, iskelenin üstünde kalmasını sağlayın. Hücrelerin %5 karbondioksit ve %95 nemde 37 santigrat derecede üç ila beş saat bağlanmasına izin verin. İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa yavaşça bir mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı eklemek için bir P1000 pipeti kullanın, iskelelerin yer değiştirmesini önleyin ve plakayı gece boyunca inkübe edin.Hücreler iskele içinde çoğaldıkça büyüme ortamının renk değişiklikleri için başlangıçta her iki ila üç günde bir iskeleleri gözlemleyin. Harcanan ortamın bir mililitresini kuyudan çıkarmak ve atmak için yavaş modda 10 mililitrelik bir pipet tabancası kullanın. Deney için şartlandırılmış ortam kullanıldığında, biyolojik kopyaların kullanılmış ortamını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın ve hücresel kalıntıları santrifüjleme yoluyla aşağı doğru peletleyin.Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve tüpü eksi 80 santigrat derecede saklayın. Pipet tabancasını damlama moduna ayarladıktan sonra, iskelelere yavaşça iki mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin. İskele içeren plakayı inkübe edin ve gösterildiği gibi istenen büyüme periyodu boyunca taze ortamı doldurun.Laminer akış başlığında, uygun hücre canlılığı tahlil reaktifini 0.2 mikrometrelik steril bir filtreden bir santrifüj tüpüne süzülerek sterilize edin. Steril çözeltiyi, tam büyüme ortamını ve steril PBS'yi su banyosunda 37 santigrat derecede önceden ısıtın. Steril cımbız kullanarak, analiz edilecek iskeleleri 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve plakayı ilgili tüm ayrıntılarla etiketleyin.Her oyuğa 900 mikrolitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin. Daha sonra her bir oyuğa 100 mikrolitre steril hücre canlılığı reaktifi ekleyin. Negatif kontrol için, iskelesiz bir kuyuya 900 mikrolitre orta ve 100 mikrolitre steril hücre canlılığı reaktifi ekleyin.Plakanın üzerindeki kapağı değiştirin ve seyreltilmiş hücre canlılığı reaktifini kuyu boyunca dağıtmak için plakayı yaklaşık üç dakika hafifçe sallayın. Plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve% 95 nem ile inkübe edin. Plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra, plakayı birkaç saniye hafifçe sallayın ve metin el yazmasında gösterildiği gibi üçlü kopyaları oluşturun.100 mikrolitre inkübe edilmiş ortam ve reaktifi 24 oyuklu plakanın bir kuyusundan yarı saydam 96 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna aktararak teknik üçlüleri oluşturun ve bu adımı bir kuyu için toplam üç kez gerçekleştirin. Hücre canlılığı reaktifini ışıktan korumak için 96 oyuklu plakayı alüminyum folyo ile örtün. Kalan 700 mikrolitre ortamı ve reaktifi 24 oyuklu plakadaki iskelelerden çıkarın ve atın.Her iskeleyi bir mililitre steril PBS ile iki kez yıkayın. 570 ve 600 nanometrede absorbansı ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın ve üreticinin tavsiyelerine göre hücre canlılığı reaktiflerinin yüzde azalma yüzdesini hesaplayın. Uygun yazılımı kullanarak hücre canlılığı sonuçlarını istatistiksel olarak analiz edin.Hata çubukları oluşturmak ve tahlil değişkenliğini belirtmek için biyolojik üçlü değerleri girin. Uygun biyoistatistiksel yazılımı kullanarak deneysel zaman dilimi boyunca hücre canlılığındaki değişiklikleri incelemek için tek yönlü bir varyans testi analizi gerçekleştirin. Metin metninde açıklandığı gibi, grafiklerdeki zaman noktaları arasındaki önemli farklılıkları belirtin.İskelelerde yetiştirilen iki nöroblastom hücre dizisi olan KellyLuc ve IMR32'nin canlılığı değerlendirildi. Artan hücre yoğunluğu, hücre canlılığı reaktifinin zamanla daha fazla azalmasına neden oldu. İskelelerdeki hücre büyümesi, iskelelerden ekstrakte edilen DNA'nın miktarı belirlenerek dolaylı olarak ölçüldü ve numune başına hücre sayısı hesaplandı.IMR32 hücreleri, zamanla artan büyüme, ardından KellyLuc hücreleri gösterdi. Hücrelerin büyüme morfolojisi ve yapı iskelesi üzerindeki dağılımı hematoksilen, eozin ve immünohistokimya boyaması ile görsel olarak değerlendirildi. KellyCis83 hücreleri daha hızlı büyüdü ve daha az invaziv Kelly hücre hattından daha hızlı büyüdü ve her iki iskele bileşimine daha derine sızdı.Nano-hidroksiapatit üzerinde yetiştirilen IMR32, 14 gün boyunca büyük, yoğun paketlenmiş kümelerle zıt bir büyüme modeli gösterdi. Hücreye özgü özellikler immünohistokimya boyaması, ardından phalloidin ve DAPI boyaması ile izlendi ve kollajen-glikozaminoglikan iskelelerinde Kelly ve KellyCis83 hücrelerinde aktin bolluğu gözlendi. İn vitro hücresel aktivite değerlendirmesi için, salgılanan kromogranin A seviyeleri ölçüldü ve kollajen-glikozaminoglikan ve kollajen nano-hidroksiapatit iskelelerinde yetiştirilen hücreler, geleneksel 2D kültürdeki büyümeye kıyasla daha fazla kromogranin A üretti.Kemoterapiye dirençli KellyCis83 hücre hattı, Kelly hücre hattından daha fazla kromogranin A salgıladı. Hücre bağlanmasından sonra, hücreler çeşitli terapötiklerle tedavi edilebilir. Bu, hücrelerin ilaçlara tepkisi için geleneksel 2D kültürden daha fizyolojik olarak daha ilgili sonuçlar sağlayacaktır.Bu teknik, araştırmacıların, kanser hücrelerinin, terapötiklere veya diğer hücre tipleriyle etkileşimlere yanıttan tümör mikro çevresindeki bir uyarana nasıl davrandığını ve tepki verdiğini daha iyi keşfetmelerini sağlar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...