Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل صناديق بدء تشغيل كلية العلوم البيولوجية بجامعة ولاية إلينوي ، ومنحة مبادرة كلية ولاية إلينوي الجديدة ، ومنحة NIAID R15AI164585 (إلى J.-U. D.). G.M.A. كان مدعوما من قبل جامعة ولاية إلينوي برنامج دعم البحوث الجامعية (إلى G.M.A.). 10- وتحظى ك. ب. ه. بدعم من زمالة RISE التي قدمتها دائرة التبادل الأكاديمي الألمانية .. يشكر المؤلفان الدكتور أوي لانداو والدكتور كارستن ماير من Largentech Vertriebs GmbH على توفير مسحوق AGXX. تم إنشاء الأرقام 1 ، الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4، والشكل 5 مع Biorender.

1. علاج الإجهاد من سلالات الإشريكية القولونية MG1655 و CFT073
<ol><li>تلقيح 5 مل من مرق الليوجيني (LB) المتوسطة مع مستعمرة واحدة من commensal E. القولونية سلالة MG1655 وuropathogenic E. القولونية (UPEC) سلالة CFT073، على التوالي، واحتضان لمدة 14-16 ساعة (بين عشية وضحاها) في 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة. مل?...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول منهجية محسنة لتحليل التكوين الكلي للبروتين بعد علاج سلالات الإشريكية القولونية المختلفة بمضادات الميكروبات البروتوتوكسية. يسمح البروتوكول بالاستخراج المتزامن لكسور البروتين غير القابلة للذوبان والذوبان من خلايا الإشريكية القولونية المعالجة وغير المعالج?...

البكتيريا تتعرض حتما لعدد لا يحصى من الضغوط البيئية، بما في ذلك انخفاض درجة الحموضة (على سبيل المثال، في معدة الثدييات)1،2، الأكسجين التفاعلي وأنواع الكلور (ROS / RCS) (على سبيل المثال ، أثناء الانفجار التأكسدي في الخلايا الأكسدية)3،4،5، درجات حرارة مرتفعة (على سبيل المثال ، في الينابيع الساخنة أو أثناء الصدمة الحرارية)6،7، والعديد من مضادات الميكروبات القوية (على سبيل المثال ، AGXX المستخدمة في هذا البروتوكول)8. البروتينات هي عرضة بشكل خاص لأي من هذه الضغوطات، والتعرض يمكن أن تثير البروتين الامم المتحدة / طيها ثم تجميع البذور. جميع الكائنات الحية تستخدم أنظمة الحماية التي تسمح لهم للتعامل مع البروتين طي9. ومع ذلك، يمكن أن تطغى الضغوط الشديدة على آلات مراقبة جودة البروتين وتعطيل البنية الثانوية و/أو الثالثة للبروتينات، والتي تؤدي في نهاية المطاف إلى تعطيل البروتينات. ونتيجة لذلك، يمكن أن تضعف مجاميع البروتين بشدة الوظائف الخلوية الحرجة المطلوبة للنمو البكتيري والبقاء على قيد الحياة، ومقاومة الإجهاد، والفوعة10. لذلك ، فإن الأبحاث التي تركز على تجميع البروتين وعواقبه في البكتيريا هي موضوع مهم بسبب تأثيره المحتمل على مكافحة الأمراض المعدية.
البروتين الناجم عن الحرارة تتكشف والتجميع وغالبا ما تكون عكسها7. في المقابل، يمكن أن تسبب الضغوط البروتيوكسية الأخرى، مثل الإجهاد التأكسدي، تعديلات بروتينية لا رجعة فيها من خلال أكسدة سلاسل جانبية محددة من الأحماض الأمينية مما يؤدي إلى البروتين un-/misfolding، وفي نهاية المطاف، تجميع البروتين4. وقد درس تشكيل الإجهاد الناجم عن المجاميع البروتين غير قابل للذوبان على نطاق واسع في سياق المرافقين الجزيئية ووظائفها الوقائية في الخميرة والبكتيريا11،12،13. وقد تم نشر العديد من البروتوكولات التي تستخدم مجموعة متنوعة من التقنيات الكيميائية الحيوية لعزل وتحليل المجاميع البروتين غير القابلة للذوبان14،15،16،17. وقد استخدمت البروتوكولات القائمة أساسا لدراسة تجميع البروتين البكتيري عند الصدمة الحرارية و / أو تحديد المرافقين الجزيئية. في حين أن هذه البروتوكولات كانت بالتأكيد تقدما في هذا المجال ، هناك بعض المضايقات الرئيسية في الإجراءات التجريبية لأنها تتطلب (1) حجم ثقافة بكتيرية كبيرة تصل إلى 10 L14،17، (ii) عمليات التعطيل المادي المعقدة ، بما في ذلك استخدام أجهزة تعطيل الخلايا ، والصحافة الفرنسية ، و / أو سونيكيشن14،15،17، أو (3) تستغرق وقتا طويلا غسل واحتضان الخطوات15،16،17.
تصف هذه الورقة بروتوكولا معدلا يهدف إلى معالجة قيود النهج السابقة ويسمح بتحليل كمية مجاميع البروتين التي تشكلت في نوعين مختلفين من سلالات الإشريكية القولونية بعد العلاج بطلاء سطح مضاد للميكروبات بروتيتيوكسي. يتكون الطلاء من الفضة المعدنية (Ag) والروثينيوم (Ru) مكيفة بحمض الأسكوربيك ، ويتحقق نشاطها المضاد للميكروبات من خلال توليد أنواع الأكسجينالتفاعلية 8،18. هنا هو وصف مفصل لإعداد الثقافة البكتيرية بعد العلاج مع مركب مضاد للميكروبات ومقارنة حالة تجميع البروتين عند التعرض لسلالات كولاي اثنين مع ملامح قابلية متميزة لزيادة تركيز مضادات الميكروبات. الطريقة الموصوفة غير مكلفة وسريعة وقابلة للاستنساخ ويمكن استخدامها لدراسة تجميع البروتين في وجود مركبات بروتوتوكسية أخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل البروتوكول لتحليل تأثير حذف الجينات المحددة على تجميع البروتين في مجموعة متنوعة من البكتيريا المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

وكثيرا ما يتسبب تعرض الكائنات الحية للضغوط البيئية والخلوية في اضطرابات في التوازن البروتيني ويمكن أن يؤدي إلى تجميع البروتين. تراكم مجاميع البروتين في الخلايا البكتيرية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات كبيرة في السلوك الظاهري الخلوي، بما في ذلك انخفاض في معدلات النمو، ومقاومة الإجهاد، والفوعة. توجد عدة إجراءات تجريبية لفحص هذه الأنماط الظاهرية بوساطة الإجهاد. تصف هذه الورقة المقايسة المثلى لاستخراج وتصور البروتينات المجمعة والذوبانة من سلالات الإشريكية القولونية المختلفة بعد العلاج بمضادات الميكروبات المحتوية على الفضة الروثينيوم. ومن المعروف أن هذا المركب لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلي ويسبب تجميع البروتين على نطاق واسع. 
تجمع هذه الطريقة بين الفصل القائم على الطرد المركزي بين مجاميع البروتين والبروتينات القابلة للذوبان من الخلايا المعالجة وغير المعالجة مع الفصل والتصور اللاحقين بواسطة تلطيخ كبريتات الصوديوم -البولي أكريلاميد هلام (SDS-PAGE) وتلطيخ Coomassie. هذا النهج بسيط وسريع ويسمح بإجراء مقارنة نوعية لتشكيل البروتين الكلي في سلالات الإشريكية القولونية المختلفة. المنهجية لديها مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك إمكانية التحقيق في تأثير مضادات الميكروبات البروتيتوكسية الأخرى على تجميع البروتين في الجسم الحي في مجموعة واسعة من البكتيريا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام البروتوكول لتحديد الجينات التي تسهم في زيادة مقاومة المواد السامة للبروتيتوس. يمكن استخدام نطاقات الجل لتحديد البروتينات اللاحقة المعرضة بشكل خاص للتراكم.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> الشكل 6:النتائج التمثيلية لتجميع البروتين الناجم عن مضادات الميكروبات في سلالة الإشريكية القولونية COMMENSAL Escherichia MG1655 وسلالة UPEC CFT073. سلالات الإشريكية القولونية MG1655 وCFT073 نمت عند 37 درجة مئوية ?...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

يصف هذا البروتوكول استخراج وتصور البروتينات المجمعة والذوبانة من الإشريكية القولونية بعد العلاج بمضادات الميكروبات البروتوتوكسية. بعد هذا الإجراء يسمح مقارنة نوعية من البروتين تشكيل الكلي في الجسم الحي في سلالات بكتيرية مختلفة و / أو بين العلاجات.

استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية مع الإجهاد البروتيوكسي

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

التعرض للإجهاد يمكن أن يسبب تراكم البروتين ويؤدي إلى تغييرات كبيرة في السلوك الظاهري للبكتيريا. الإجراء الموصوف في هذا الفيديو يسمح باستخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإجهاد. وعلى النقيض من الإجراءات المنشورة الأخرى، يتطلب هذا البروتوكول انخفاض أعداد الخلايا ويمتنع عن عمليات التعطيل البدني المعقدة، فضلا عن خطوات الغسيل والحضانة التي تستغرق وقتا طويلا.يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة تجميع البروتين في مجموعة واسعة من البكتيريا السلبية والجرام إيجابية. يمكنك أيضا تحليل تأثير حذف الجينات أو مقارنة فعالية المركبات البروتيوتوكسية. تبدأ عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة من سلالة E.coli MG1655 وuropathogenic E.coli سلالة CFT073، كل في خمسة ملليلتر من مرق الليوجيني، أو LB، المتوسطة.احتضان ثقافتي المرق عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة لمدة 14 إلى 16 ساعة. تمييع كل سلالة إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر، أو OD600، من 0.1 في قارورة 500 ملليلتر تحتوي على 70 ملليلتر من المتوسط MOPS-g. احتضان القوارير في 37 درجة و 300 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى مرحلة منتصف السجل.بعد الحضانة، قم بنقل 20 ملليلتر من كل ثقافة إلى ثلاث قوارير 125 ملليلتر مسبقة الدفء، واحتضانها عند 37 درجة مئوية و300 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. إعداد محلول مركب مضاد للميكروبات مليغرامين لكل ملليلتر في المتوسط MOPS-g. أضف هذا الحل إلى كل ثقافة للوصول إلى التركيزات المطلوبة، وإضافة الحجم المطلوب من MOPS-g المتوسط للتحكم غير المعالج.تحديد OD600 من كل ثقافة بعد 45 دقيقة من علاج الإجهاد. لكل عينة، aliquot أربعة ملليلتر من الثقافة مع OD600 من واحد إلى أنابيب الطرد المركزي 15 ملليلتر. Resuspend الكريات الخلية في 50 ميكرولتر من الجليد الباردة تحلل العازلة.احتضان العينات لمدة 30 دقيقة على الجليد. إضافة 360 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة ألف إلى العينات، وتخلط بلطف عن طريق pipetting. نقل العينات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق مليلترين مع حوالي 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي 0.5 ملليمتر.احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في ثماني درجات مئوية في ThermoMixer مع اهتزاز في 1400 دورة في الدقيقة. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة خمس دقائق دون اهتزاز لتسوية الخرز الزجاجي. ثم نقل 200 ميكرولتر من lysate الخلية في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.7 ملليلتر.الطرد المركزي الخلية lysate لمدة 20 دقيقة في 16، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية. جمع supernatant، والتي سوف تستخدم كعينة البروتين القابل للذوبان في وقت لاحق. استخدام ماصة لإعادة إنفاق بيليه في 200 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة A.Centrifuge من الأنابيب في 16، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.ثم إزالة بعناية فائقة تماما. استخدام ماصة لإعادة إنفاق بعناية بيليه في 200 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة B.Centrifuge الأنابيب مرة أخرى، وإزالة بعناية supernatant. ثم كرر الغسيل مع العازلة A.Resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من 1x الحد من المخزن المؤقت عينة SDS، ويغلي لمدة خمس دقائق في ThermoMixer في 95 درجة مئوية.مزيج حجم واحد من 100٪ TCA مع أربعة أحجام من عينة البروتين القابل للذوبان التي تم جمعها في وقت سابق، واحتضان لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية لهطول الأمطار البروتين. الطرد المركزي العينة في 21، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق للحصول على عجل، وإزالة supernatant. استخدام 200 ميكرولتر من الأسيتون الجليد الباردة لغسل بيليه، لإزالة الحطام الخلوي.الطرد المركزي العينة مرة أخرى للحصول على عجل، وإزالة supernatant. لإزالة الأسيتون المتبقي من الكريات، احتفظ بأنابيب الطرد المركزي الدقيق في ThermoMixer عند 37 درجة مئوية مع فتح جفونها. ثم أضف 100 ميكرولتر من 1x الحد من العازلة SDS لإذابة بيليه تماما، وغلي العينة في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.قم بتحميل العينة على الفور على هلام بولي أكريلاميد SDS للفصل ، أو قم بتخزين العينة عند ناقص 20 درجة مئوية للمضي قدما لاحقا. إعداد اثنين من المواد الهلامية فصل كما هو موضح في المخطوطة النصية. صب الجل بين لوحات الزجاج باستخدام ماصة ملليلتر واحد، وضمان أن العلوي سنتيمترين خالية من الخليط.إضافة 70٪ الإيثانول على رأس هلام فصل، وخلق واجهة حتى بين الطبقتين. بمجرد أن يبوليمر المواد الهلامية الفاصلة ، قم بإعداد المواد الهلامية المكدسة باستخدام التعليمات الواردة في المخطوطة النصية. ثم إزالة الإيثانول من المواد الهلامية فصل، وإضافة محلول هلام التراص.أدخل بعناية مشط مع العدد المطلوب من الجيوب دون إدخال فقاعات الهواء، والسماح للهلام لبوليمرة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. تحميل أربعة ميكرولترات من كل عينة، فضلا عن سلم البروتين، في آبار منفصلة. ثم تشغيل هلام في تريس الجليسين تشغيل العازلة في 144 فولت لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.استخدام حل فيربانكس قبل الحارة ألف للطخة المواد الهلامية على الروك لمدة 30 دقيقة وقبل الحارة فيربانكس حل D لإلغاء لون المواد الهلامية على الروك حتى يتم تحقيق الخلفية المطلوبة. ولوحظت زيادة في كمية البروتين المجمعة التي تشكلت عندما عولجت الخلايا ب 175 ميكروغراما لكل ملليلتر و 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من مضادات الميكروبات، مقارنة بالخلايا غير المعالجة. كانت الزيادة في كسر البروتين غير القابل للذوبان أكثر وضوحا في سلالة MG1655 الأكثر حساسية.ولوحظ انخفاض في كمية البروتينات القابلة للذوبان عندما عولجت الخلايا ب 175 ميكروغراما لكل ملليلتر و 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من مضادات الميكروبات، مقارنة بالخلايا غير المعالجة. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن تطبيع الكثافة البصرية عند 600 نانومتر مهم لمقارنة مدى تجميع البروتين في العينات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

إثراء مجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

موقع محدد ليسين أسيتيل الهستونات لإعادة تشكيل النوكليوسوم باستخدام توسيع الشفرة الوراثية في الإشريكية القولونية

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...