Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Illinois State University School of Biological Sciences start midler, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, og NIAID tilskud R15AI164585 (til J.-U. D.). G.M.A. blev støttet af Illinois State University Undergraduate Research Support Program (til G.M.A.). K.P.H. blev støttet af et RISE-stipendium fra den tyske akademiske udvekslingstjeneste (DAAD). Forfatterne takker Dr. Uwe Landau og Dr. Carsten Meyer fra Largentech Vertriebs GmbH for at levere AGXX pulver. Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4og Figur 5 blev genereret med Biorender.

1. Stressbehandling af E. coli stammer MG1655 og CFT073
<ol><li>Pode 5 mL lysogeny bouillon (LB) medium med en enkelt koloni af commensal E. coli stamme MG1655 og uropathogenic E. coli (UPEC) stamme CFT073, henholdsvis og inkubere i 14-16 h (natten) ved 37 °C og 300 rpm. BEMÆRK: Escherichia coli CFT073 er et humant patogen. Håndtering af CFT073 skal udføres med passende biosikkerhedsforanstaltninger i et Biosafety Level-2 certificeret laboratorium.</li>
	<li>Hver stamme fortyn...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

Denne protokol beskriver en optimeret metode til analyse af proteinaggregatdannelse efter behandling af forskellige E. coli-stammer med en proteotoxisk antimikrobiel. Protokollen tillader samtidig udvinding af uopløselige og opløselige proteinfraktioner fra behandlede og ubehandlede E. coli-celler. Sammenlignet med eksisterende protokoller for proteinaggregatisolation fra cellerne14,15,16,<sup clas...

Bakterier udsættes uundgåeligt for et utal af miljømæssige belastninger, herunder lav pH (f.eks. i pattedyrs mave)1,2, reaktiv ilt- og klorart (ROS/RCS) (f.eks. under oxidativ burst i fagocytter)3,4,5, forhøjede temperaturer (f.eks. i varme kilder eller under varmechok)6,7og flere potente antimikrobielle stoffer (f.eks. AGXX anvendes i denne protokol)8. Proteiner er særligt sårbare over for nogen af disse stressorer, og eksponering kan provokere protein un-/misfolding at så frø sammenlægning. Alle organismer anvender beskyttelsessystemer, der giver dem mulighed for at klare proteinfoldning9. Alvorlig stress kan dog overvælde proteinets kvalitetskontrolmaskineri og forstyrre proteinernes sekundære og/eller tertiære struktur, som i sidste ende inaktiverer proteiner. Som følge heraf kan proteinaggregater alvorligt forringe kritiske cellulære funktioner, der kræves for bakterievækst og overlevelse, stressresistens og virulens10. Derfor er forskning med fokus på protein aggregering og dens konsekvenser i bakterier et relevant emne på grund af dets potentielle indvirkning på infektionssygdomsbekæmpelse.
Varmeinduceret protein, der udfolder sig og aggregering, er ofte reversibelt7. I modsætning hertil kan andre proteotoxiske belastninger, såsom oxidativ stress, forårsage irreversible proteinmodifikationer gennem oxidation af specifikke aminosyre sidekæder, hvilket resulterer i protein un-/misfolding og i sidste ende proteinaggregation4. Stressinduceret dannelse af uopløselige proteinaggregater er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med molekylære chaperoner og deres beskyttende funktioner i gær og bakterier11,12,13. Der er offentliggjort flere protokoller , der anvender en række biokemiske teknikker til isolering og analyse af uopløselige proteinaggregater14,15,16,17. De eksisterende protokoller er hovedsageligt blevet anvendt til at studere bakterieprotein aggregering ved varmechok og/eller identifikation af molekylære chaperoner. Mens disse protokoller har helt sikkert været et fremskridt på området, der er nogle store ulemper i de eksperimentelle procedurer, fordi de kræver (i) en stor bakteriel kultur volumen på op til 10 L14,17, (ii) komplicerede fysiske forstyrrelser processer, herunder brugen af celleforstyrrende stoffer, fransk presse, og / eller sonikering14,15,17, eller (iii) tidskrævende gentagne vaske- og inkubation trin15,16,17.
Dette papir beskriver en modificeret protokol, der har til formål at løse begrænsningerne af de tidligere tilgange og tillader analyse af mængden af protein aggregater dannet i to forskellige Escherichia coli stammer efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiel overfladebelægning. Belægningen består af metal-sølv (Ag) og ruthenium (Ru)-konditioneret med ascorbinsyre, og dens antimikrobielle aktivitet opnås ved generering af reaktive iltarter8,18. Heri er en detaljeret beskrivelse af præparatet af bakteriekulturen efter behandling med antimikrobiel forbindelse og en sammenligning af proteinaggregationsstatus ved eksponering af to E. coli-stammer med forskellige følsomhedsprofiler for stigende koncentration af det antimikrobielle stof. Den beskrevne metode er billig, hurtig og reproducerbar og kan bruges til at studere protein aggregering i nærværelse af andre proteotoxiske forbindelser. Derudover kan protokollen ændres for at analysere den indvirkning, som specifikke gensletninger har på proteinaggregation i en række forskellige bakterier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

Eksponeringen af levende organismer for miljømæssige og cellulære belastninger forårsager ofte forstyrrelser i protein homøostase og kan resultere i protein aggregering. Ophobning af protein aggregater i bakterieceller kan føre til betydelige ændringer i cellulære fænotypiske adfærd, herunder en reduktion i vækstrater, stressresistens, og virulens. Der findes flere forsøgsprocedurer til undersøgelse af disse stressormedierede fænotyper. Dette papir beskriver en optimeret analyse til ekstraktion og visualisering af aggregerede og opløselige proteiner fra forskellige Escherichia coli stammer efter behandling med en sølv-ruthenium-holdige antimikrobielle. Denne forbindelse er kendt for at generere reaktive iltarter og forårsager udbredt proteinsammenlægning. 
Metoden kombinerer en centrifugeringsbaseret adskillelse af proteinaggregater og opløselige proteiner fra behandlede og ubehandlede celler med efterfølgende adskillelse og visualisering af natrium dodecyl sulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Coomassie farvning. Denne tilgang er enkel, hurtig og giver mulighed for en kvalitativ sammenligning af proteinaggregatdannelse i forskellige E. coli-stammer. Metoden har en bred vifte af anvendelser, herunder muligheden for at undersøge virkningen af andre proteotoksiske antimikrobielle stoffer på in vivoprotein aggregering i en lang række bakterier. Desuden kan protokollen bruges til at identificere gener, der bidrager til øget resistens over for proteotoksiske stoffer. Gelbånd kan bruges til efterfølgende identifikation af proteiner, der er særligt tilbøjelige til sammenlægning.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> Figur 6: Repræsentative resultater af antimikrobiel induceret proteinsammenlægning i commensal Escherichia coli stamme MG1655 og UPEC stamme CFT073. E. colistammerne MG1655 og CFT073 blev dyrket ved 37 °C og 300 rpm til OD600= 0,5-0,55 i MOPS-g medier, før de blev behandlet med de angivne koncentrationer (-, 0 mg/mL; +, 175 mg...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Denne protokol beskriver ekstraktion og visualisering af aggregerede og opløselige proteiner fra Escherichia coli efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiel. Efter denne procedure giver mulighed for en kvalitativ sammenligning af proteinaggregatdannelse in vivo i forskellige bakteriestammer og/eller mellem behandlinger.

Ekstraktion og visualisering af proteinaggregater efter behandling af Escherichia coli med en proteotoxisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Udsættelse for stress kan forårsage protein aggregering og resultere i betydelige ændringer i fænotypiske adfærd bakterier. Den procedure, der er beskrevet i denne video, tillader ekstraktion og visualisering af proteinaggregater efter stressbehandling. I modsætning til andre offentliggjorte procedurer kræver denne protokol lavere cellenumre og afholder sig fra komplicerede fysiske afbrydelsesprocesser samt tidskrævende vaske- og inkubationstrin.Denne protokol kan bruges til at studere protein aggregering i en bred vifte af gram-negative og gram-positive bakterier. Du kan også analysere effekten af gensletninger eller sammenligne effekten af proteotoxiske forbindelser. Begynd med at pode en enkelt koloni af E.coli stamme MG1655 og uropathogenic E.coli stamme CFT073, hver i fem milliliter lysogeny bouillon, eller LB, medium.Inkuber de to bouillonkulturer ved 37 grader Celsius og 300 rpm i 14 til 16 timer. Fortynd hver stamme til en optisk densitet ved 600 nanometer, eller OD600, på 0,1, til en 500 milliliter kolbe indeholdende 70 milliliter MOPS-g medium. Inkuber kolberne ved 37 grader og 300 omdr./min, indtil midt loggefasen er nået.Efter inkubation overføres 20 milliliter af hver kultur til tre forvarmede 125 milliliterkolber og inkuberer dem ved 37 grader Celsius og 300 rpm i to minutter. Forbered en to-milligram-per-milliliter antimikrobiel forbindelsesopløsning i MOPS-g medium. Tilføj denne løsning til hver kultur for at nå de ønskede koncentrationer, og tilsæt den nødvendige mængde MOPS-g medium til ubehandlet kontrol.Bestem OD600 af hver kultur efter 45 minutters stressbehandling. For hver prøve, aliquot fire milliliter af kultur med en OD600 af en i 15-milliliter centrifuge rør. Resuspend cellen pellets i 50 mikroliter af iskold lysis buffer.Inkuber prøverne i 30 minutter på is. Tilsæt 360 mikroliter af iskold buffer A til prøverne, og bland forsigtigt ved pipettering. Overfør prøverne til to milliliter mikrocentrifugerør med omkring 200 mikroliter af 0,5 millimeter glasperler.Inkuber rørene i 30 minutter ved otte grader Celsius i en ThermoMixer med rysten ved 1400 omdrejninger. Inkuber rørene på is i fem minutter uden at ryste for at bosætte glasperlerne. Overfør derefter 200 mikroliter af cellen lyser til 1,7 milliliter mikrocentrifugerør.Centrifuge cellen lysate i 20 minutter ved 16,000 gange g og fire grader Celsius. Saml supernatanten, som vil blive brugt som den opløselige proteinprøve senere. Brug en pipette til at genbruge pellet i 200 mikroliter af iskold buffer A.Centrifuge af rørene ved 16.000 gange g og fire grader Celsius i 20 minutter.Fjern derefter forsigtigt supernatanten helt. Brug en pipette til forsigtigt at genbruge pellet i 200 mikroliter af iskold buffer B.Centrifuge rørene igen, og fjern forsigtigt supernatanten. Gentag derefter vasken med bufferen A.Resuspend pellet i 100 mikroliter på 1x, hvilket reducerer SDS-prøvebufferen, og kog den i fem minutter i en ThermoMixer ved 95 grader Celsius.Bland et volumen på 100% TCA med fire mængder af den opløselige proteinprøve indsamlet tidligere, og inkuber i 10 minutter ved fire grader Celsius for protein nedbør. Centrifuge prøven ved 21,000 gange g og fire grader Celsius i fem minutter for at opnå bundfaldet, og fjerne supernatant. Brug 200 mikroliter af iskold acetone til at vaske pellet, for at fjerne cellulære vragrester.Centrifuge prøven igen for at opnå bundfaldet, og fjern supernatanten. For at fjerne den resterende acetone fra pellets, holde mikrocentrifuge rør i ThermoMixer på 37 grader Celsius med deres låg åbne. Tilsæt derefter 100 mikroliter på 1x reducerende SDS buffer for helt at opløse pelleten og kog prøven ved 95 grader Celsius i fem minutter.Læg straks prøven på en SDS-polyacrylamidgel til separation, eller prøven opbevares ved minus 20 grader Celsius for at fortsætte senere. Forbered to adskillende geler som beskrevet i tekstmanuskriptet. Hæld gelen mellem glaspladerne ved hjælp af en en milliliter pipette, hvilket sikrer, at de to øverste centimeter er fri for blandingen.Tilsæt 70% ethanol oven på skillegelen, hvilket skaber en jævn grænseflade mellem de to lag. Når de adskillende geler er polymeriseret, skal du forberede stablingsgelerne ved hjælp af instruktioner i tekstmanuskriptet. Fjern derefter ethanolen fra skillegelerne, og tilsæt stablingsgelopløsningen.Indsæt forsigtigt en kam med det ønskede antal lommer uden at introducere luftbobler, og lad gelen polymerisere i 20 til 30 minutter. Læg fire mikroliter af hver prøve, såvel som proteinstigen, i separate brønde. Kør derefter gelen i tris-glycin løbebuffer ved 144 volt i 45 minutter ved stuetemperatur.Brug forvarmet Fairbanks opløsning A til at plette gelerne på en rocker i 30 minutter og forvarmet Fairbanks opløsning D til at affarve gelerne på en rocker, indtil den ønskede baggrund er opnået. Der blev observeret en stigning i mængden af proteinaggregat, der blev dannet, da celler blev behandlet med 175 mikrogram pr. milliliter og 200 mikrogram pr. milliliter af det antimikrobielle, sammenlignet med ubehandlede celler. Stigningen i den uopløselige proteinfraktion var mere udtalt i den mere følsomme MG1655-stamme.Der blev observeret et fald i mængden af opløselige proteiner, når celler blev behandlet med 175 mikrogram pr. milliliter og 200 mikrogram pr. milliliter af det antimikrobielle, sammenlignet med ubehandlede celler. Når du forsøger denne protokol, skal du huske på, at normalisering til den optiske tæthed ved 600 nanometer er vigtig for sammenligning af omfanget af proteinaggregation i prøverne.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Instrueret Protein Emballage inden ydermembranvesikler fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion og oprensning

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning af pH-afhængige aktivitet af<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; og<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Berigelse af Detergent-uopløselige Protein aggregater fra Postmortem menneskehjerne

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantificering af overfloden og opladning niveauer af overførsel RNA'er i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storproduktion af rekombinant RNA'er på en cirkulær stillads ved hjælp af en Viroid-afledte System i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed mutagenese for In Vitro og i Vivo eksperimenter eksemplificeret med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specifik lysin acetylering af Histoner for nukleosom rekonstitution ved hjælp af genetisk kode ekspansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...