Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door illinois state university school of biological sciences startup fondsen, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, en de NIAID grant R15AI164585 (aan J.-U. D.). G.M.A. werd ondersteund door het Illinois State University Undergraduate Research Support Program (aan G.M.A.). K.P.H. werd ondersteund door een RISE-beurs van de Duitse Academische Uitwisselingsdienst (DAAD). De auteurs bedanken Dr. Uwe Landau en Dr. Carsten Meyer van Largentech Vertriebs GmbH voor het leveren van het AGXX poeder. Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4en Figuur 5 zijn gegenereerd met Biorender.

1. Stressbehandeling van E. coli stammen MG1655 en CFT073
<ol><li>Ent 5 ml lysogeniebouillon (LB) medium met een enkele kolonie commensale E. coli stam MG1655 en uropathogene E. coli (UPEC) stam CFT073, respectievelijk, en incubeer gedurende 14-16 uur ('s nachts) bij 37 °C en 300 tpm. OPMERKING: Escherichia coli CFT073 is een menselijke ziekteverwekker. De behandeling van CFT073 moet worden uitgevoerd met passende bioveiligheidsmaatregelen in een bioveiligheidsniveau 2-gecertific...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methodologie voor de analyse van eiwitaggregatievorming na behandeling van verschillende E. coli-stammen met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het protocol maakt de gelijktijdige extractie van onoplosbare en oplosbare eiwitfracties uit behandelde en onbehandelde E. coli-cellen mogelijk. In vergelijking met bestaande protocollen voor eiwitaggregatie-isolatie uit cellen14,15,<sup class...

Bacteriën worden onvermijdelijk blootgesteld aan een groot aantal omgevingsstressen, waaronder een lage pH (bijvoorbeeld in de maag van zoogdieren)1,2,reactieve zuurstof- en chloorsoorten (ROS / RCS) (bijvoorbeeld tijdens oxidatieve uitbarsting in fagocyten)3,4,5,verhoogde temperaturen (bijvoorbeeld in warmwaterbronnen of tijdens hitteschok)6,7en verschillende krachtige antimicrobiële stoffen (bijv. AGXX gebruikt in dit protocol)8. Eiwitten zijn bijzonder kwetsbaar voor een van deze stressoren en blootstelling kan leiden tot het ontvouwen van eiwitten die vervolgens zadenaggregatie veroorzaken. Alle organismen maken gebruik van beschermende systemen die hen in staat stellen om te gaan met eiwit misfolding9. Ernstige stress kan echter de eiwitkwaliteitscontrolemachines overweldigen en de secundaire en / of tertiaire structuur van eiwitten verstoren, wat uiteindelijk eiwitten inactiveert. Als gevolg hiervan kunnen eiwitaggregaten ernstige afbreuk doen aan kritieke cellulaire functies die nodig zijn voor bacteriële groei en overleving, stressbestendigheid en virulentie10. Daarom is onderzoek gericht op eiwitaggregatie en de gevolgen ervan in bacteriën een relevant onderwerp vanwege de potentiële impact op de bestrijding van infectieziekten.
Warmte-geïnduceerde eiwit ontvouwen en aggregatie zijn vaak omkeerbaar7. Daarentegen kunnen andere proteotoxische spanningen, zoals oxidatieve stress, onomkeerbare eiwitmodificaties veroorzaken door de oxidatie van specifieke aminozuurzijketens, wat resulteert in eiwitont-/misvouwen en uiteindelijk eiwitaggregatie4. Stress-geïnduceerde vorming van onoplosbare eiwitaggregaten is uitgebreid bestudeerd in de context van moleculaire chaperonnes en hun beschermende functies in gist en bacteriën11,12,13. Er zijn verschillende protocollen gepubliceerd die een verscheidenheid aan biochemische technieken gebruiken voor de isolatie en analyse van onoplosbare eiwitaggregaten14,15,16,17. De bestaande protocollen zijn voornamelijk gebruikt om bacteriële eiwitaggregatie te bestuderen bij hitteschok en /of identificatie van moleculaire chaperones. Hoewel deze protocollen zeker een vooruitgang in het veld zijn geweest, zijn er enkele grote ongemakken in de experimentele procedures omdat ze (i) een groot bacteriekweekvolume van maximaal 10 L14,17, (ii) gecompliceerde fysieke verstoringsprocessen vereisen, waaronder het gebruik van celverstoorders, Franse pers en / of ultrasoonapparaat14,15,17of (iii) tijdrovende herhaalde herhaalde wassen en incubatie stappen15,16,17.
Dit artikel beschrijft een aangepast protocol dat gericht is op het aanpakken van de beperkingen van de vorige benaderingen en maakt de analyse mogelijk van de hoeveelheid eiwitaggregaten gevormd in twee verschillende Escherichia coli-stammen na behandeling met een proteotoxische antimicrobiële oppervlaktecoating. De coating bestaat uit metaal-zilver (Ag) en ruthenium (Ru) -geconditioneerd met ascorbinezuur, en de antimicrobiële activiteit wordt bereikt door het genereren van reactieve zuurstofsoorten8,18. Hierin is een gedetailleerde beschrijving van de bereiding van de bacteriecultuur na behandeling met de antimicrobiële verbinding en een vergelijking van de eiwitaggregatiestatus bij blootstelling van twee E. coli-stammen met verschillende gevoeligheidsprofielen aan toenemende concentratie van de antimicrobiële stof. De beschreven methode is goedkoop, snel en reproduceerbaar en kan worden gebruikt om eiwitaggregatie te bestuderen in aanwezigheid van andere proteotoxische verbindingen. Bovendien kan het protocol worden aangepast om de impact te analyseren die specifieke gendeleties hebben op eiwitaggregatie in een verscheidenheid aan verschillende bacteriën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

De blootstelling van levende organismen aan omgevings- en cellulaire stress veroorzaakt vaak verstoringen in eiwithomeostase en kan resulteren in eiwitaggregatie. De accumulatie van eiwitaggregaten in bacteriële cellen kan leiden tot significante veranderingen in het cellulaire fenotypische gedrag, waaronder een vermindering van groeisnelheden, stressbestendigheid en virulentie. Er bestaan verschillende experimentele procedures voor het onderzoek van deze stressor-gemedieerde fenotypen. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde test voor de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit verschillende Escherichia coli-stammen na behandeling met een zilver-ruthenium-bevattende antimicrobiële stof. Van deze verbinding is bekend dat het reactieve zuurstofsoorten genereert en wijdverspreide eiwitaggregatie veroorzaakt. 
De methode combineert een op centrifugatie gebaseerde scheiding van eiwitaggregaten en oplosbare eiwitten uit behandelde en onbehandelde cellen met daaropvolgende scheiding en visualisatie door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en Coomassie-kleuring. Deze aanpak is eenvoudig, snel en maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in verschillende E. coli-stammen. De methodologie heeft een breed scala aan toepassingen, waaronder de mogelijkheid om de impact van andere proteotoxische antimicrobiële stoffen op in vivo eiwitaggregatie in een breed scala aan bacteriën te onderzoeken. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om genen te identificeren die bijdragen aan een verhoogde resistentie tegen proteotoxische stoffen. Gelbanden kunnen worden gebruikt voor de daaropvolgende identificatie van eiwitten die bijzonder gevoelig zijn voor aggregatie.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> Figuur 6: Representatieve resultaten van antimicrobieel geïnduceerde eiwitaggregatie in commensale Escherichia coli stam MG1655 en UPEC stam CFT073. E. coli stammen MG1655 en CFT073 werden gekweekt bij 37 °C en 300 rpm tot OD600= 0,5-0,55 in MOPS-g media voordat ze werden behandeld met de aangegeven concentraties (-, 0 mg/ml; +,...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Dit protocol beschrijft de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit Escherichia coli na behandeling met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het volgen van deze procedure maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in vivo in verschillende bacteriestammen en/of tussen behandelingen.

Extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na behandeling van Escherichia coli met een proteotoxische stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Blootstelling aan stress kan eiwitaggregatie veroorzaken en resulteren in significante veranderingen in het fenotypische gedrag van bacteriën. De procedure die in deze video wordt beschreven, maakt de extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na stressbehandeling mogelijk. In tegenstelling tot andere gepubliceerde procedures vereist dit protocol lagere celaantallen en onthoudt het zich van gecompliceerde fysieke verstoringsprocessen, evenals tijdrovende was- en incubatiestappen.Dit protocol kan worden gebruikt om eiwitaggregatie te bestuderen in een breed scala aan gramnegatieve en grampositieve bacteriën. U kunt ook het effect van gendeleties analyseren of de werkzaamheid van proteotoxische verbindingen vergelijken. Begin met het inenten van een enkele kolonie E.coli-stam MG1655 en uropathogene E.coli-stam CFT073, elk in vijf milliliter lysogenesebouillon, of LB, medium.Incubeer de twee bouillonculturen bij 37 graden Celsius en 300 rpm gedurende 14 tot 16 uur. Verdun elke stam tot een optische dichtheid van 600 nanometer, of OD600, van 0,1 tot een kolf van 500 milliliter met 70 milliliter MOPS-g medium. Incubeer de kolven bij 37 graden en 300 tpm totdat de middenfase is bereikt.Breng na de incubatie 20 milliliter van elke cultuur over in drie voorverwarmde kolven van 125 milliliter en incubeer ze bij 37 graden Celsius en 300 tpm gedurende twee minuten. Bereid een antimicrobiële oplossing van twee milligram per milliliter in MOPS-g medium. Voeg deze oplossing toe aan elke cultuur om de gewenste concentraties te bereiken en voeg het vereiste volume MOPS-g-medium toe voor de onbehandelde regeling.Bepaal de OD600 van elke cultuur na 45 minuten stressbehandeling. Voor elk monster wordt vier milliliter cultuur met een OD600 van één in centrifugebuizen van 15 milliliter opgenomen. Resuspend de celkorrels in 50 microliter ijskoude lysisbuffer.Incubeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs. Voeg 360 microliter ijskoude buffer A toe aan de monsters en meng voorzichtig door te pipetteren. Breng de monsters over in microcentrifugebuizen van twee milliliter met ongeveer 200 microliter glasparels van 0,5 millimeter.Incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij acht graden Celsius in een ThermoMixer met schudden bij 1400 tpm. Incubeer de buizen vijf minuten op ijs zonder te schudden om de glaskralen te laten bezinken. Breng vervolgens 200 microliter van het cellysaat over in microcentrifugebuizen van 1,7 milliliter.Centrifugeer het cellaat gedurende 20 minuten bij 16.000 keer g en vier graden Celsius. Verzamel het supernatant, dat later als oplosbaar eiwitmonster zal worden gebruikt. Gebruik een pipet om de pellet gedurende 20 minuten te resuspenderen in 200 microliter ijskoude buffer A.Centrifuge van de buizen bij 16.000 keer g en vier graden Celsius.Verwijder vervolgens voorzichtig het bovennatuurlijke geheel. Gebruik een pipet om de pellet voorzichtig opnieuw op te suspenderen in 200 microliter ijskoude buffer B.Centrifugeer de buizen opnieuw en verwijder voorzichtig het supernatant. Herhaal vervolgens de was met buffer A.Resuspend de pellet in 100 microliter van 1x reducerende SDS-monsterbuffer en kook deze gedurende vijf minuten in een ThermoMixer op 95 graden Celsius.Meng een volume van 100% TCA met vier volumes van het oplosbare eiwitmonster dat eerder is verzameld en incubeer gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius voor eiwitneerslag. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 21.000 maal g en vier graden Celsius om het neerslag te verkrijgen en verwijder het supernatant. Gebruik 200 microliter ijskoude aceton om de pellet te wassen, om cellulair vuil te verwijderen.Centrifugeer het monster opnieuw om het neerslag te verkrijgen en verwijder het supernatant. Om de resterende aceton uit de pellets te verwijderen, houdt u de microcentrifugebuizen in de ThermoMixer op 37 graden Celsius met hun deksels open. Voeg vervolgens 100 microliter van 1x reducerende SDS-buffer toe om de pellet volledig op te lossen en kook het monster gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius.Laad het monster onmiddellijk op een SDS-polyacrylamidegel voor scheiding of bewaar het monster bij min 20 graden Celsius om later verder te gaan. Bereid twee scheidende gels zoals beschreven in het teksthandschrift. Giet de gel tussen de glasplaten met behulp van een pipet van één milliliter, zodat de bovenste twee centimeter vrij is van het mengsel.Voeg 70% ethanol toe aan de scheidingsgel, waardoor een gelijkmatige interface tussen de twee lagen ontstaat. Zodra de scheidingsgels zijn gepolymeriseerd, bereidt u de stapelgels voor met behulp van instructies in het tekstmanuscript. Verwijder vervolgens de ethanol uit de scheidingsgels en voeg de stapelgeloplossing toe.Plaats voorzichtig een kam met het gewenste aantal zakken zonder luchtbellen in te brengen en laat de gel 20 tot 30 minuten polymeriseren. Laad vier microliter van elk monster, evenals de eiwitladder, in afzonderlijke putten. Laat de gel vervolgens gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in tris-glycine-loopbuffer op 144 volt lopen.Gebruik voorverwarmde Fairbanks-oplossing A om de gels gedurende 30 minuten op een rocker te beitsen en voorverwarmde Fairbanks-oplossing D om de gels op een rocker te ontkleuren totdat de gewenste achtergrond is bereikt. Er werd een toename waargenomen in de hoeveelheid eiwitaggregatie gevormd wanneer cellen werden behandeld met 175 microgram per milliliter en 200 microgram per milliliter van de antimicrobiële stof, in vergelijking met onbehandelde cellen. De toename van de onoplosbare eiwitfractie was meer uitgesproken in de meer gevoelige MG1655-stam.Een afname werd waargenomen in de hoeveelheid oplosbare eiwitten wanneer cellen werden behandeld met 175 microgram per milliliter en 200 microgram per milliliter van de antimicrobiële stof, in vergelijking met onbehandelde cellen. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat normalisatie naar de optische dichtheid bij 600 nanometer belangrijk is voor vergelijking van de mate van eiwitaggregatie in de monsters.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Ontwerp, Productie en zuivering

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...