Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch Startfonds der Illinois State University School of Biological Sciences, den Illinois State University New Faculty Initiative Grant und den NIAID-Zuschuss R15AI164585 (an J.-U. D.). G.M.A. wurde vom Illinois State University Undergraduate Research Support Program (zu G.M.A.) unterstützt. K. P. H. wurde durch ein RISE-Stipendium des Deutschen Akademischen Austauschdienstes (DAAD) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Uwe Landau und Dr. Carsten Meyer von der Largentech Vertriebs GmbH für die Bereitstellung des AGXX-Pulvers. Die Abbildungen 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4und Abbildung 5 wurden mit Biorender generiert.

1. Stressbehandlung der E. coli-Stämme MG1655 und CFT073
<ol><li>Impfen Sie 5 ml Lysogenbrühe (LB) Medium mit einer einzigen Kolonie von kommensalen E. coli Stamm MG1655 bzw. uropathogenen E. coli (UPEC) Stamm CFT073 und inkubieren Sie für 14-16 h (über Nacht) bei 37 °C und 300 U / min. HINWEIS: Escherichia coli CFT073 ist ein humaner Krankheitserreger. Die Handhabung von CFT073 muss mit geeigneten Biosicherheitsmaßnahmen in einem Biosafety Level-2 zertifizierten Labor durch...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. 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D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methodik zur Analyse der Proteinaggregatbildung nach Behandlung verschiedener E. coli-Stämme mit einem proteotoxischen antimikrobiellen Mittel. Das Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Extraktion von unlöslichen und löslichen Proteinfraktionen aus behandelten und unbehandelten E. coli-Zellen. Im Vergleich zu bestehenden Protokollen zur Proteinaggregatisolierung aus den Zellen14,15,<sup...

Bakterien sind unweigerlich einer Vielzahl von Umweltbelastungen ausgesetzt, darunter ein niedriger pH-Wert (z. B. im Säugetiermagen)1,2, reaktive Sauerstoff- und Chlorspezies (ROS / RCS) (z. B. während des oxidativen Bursts in Phagozyten)3,4,5, erhöhte Temperaturen (z. B. in heißen Quellen oder während des Hitzeschocks)6,7und mehrere starke antimikrobielle Mittel (z. B. AGXX, die in diesem Protokoll verwendet werden)8. Proteine sind besonders anfällig für einen dieser Stressoren, und die Exposition kann zu einer Proteinentfaltung führen, die dann die Aggregation aussaatiert. Alle Organismen verwenden Schutzsysteme, die es ihnen ermöglichen, mit Proteinfehlfaltungen fertig zu werden9. Starker Stress kann jedoch die Proteinqualitätskontrollmaschinerie überfordern und die sekundäre und / oder tertiäre Struktur von Proteinen stören, was letztendlich Proteine inaktiviert. Infolgedessen können Proteinaggregate kritische Zellfunktionen, die für das Wachstum und Überleben von Bakterien, die Stressresistenz und die Virulenz erforderlich sind, stark beeinträchtigen10. Daher ist die Forschung, die sich auf die Proteinaggregation und ihre Folgen in Bakterien konzentriert, aufgrund ihrer möglichen Auswirkungen auf die Kontrolle von Infektionskrankheiten ein relevantes Thema.
Hitzeinduzierte Proteinentfaltung und -aggregation sind oft reversibel7. Im Gegensatz dazu können andere proteotoxische Belastungen, wie oxidativer Stress, irreversible Proteinmodifikationen durch die Oxidation spezifischer Aminosäure-Seitenketten verursachen, was zu einer Proteinentfaltung und schließlich zu einer Proteinaggregation führt4. Die stressinduzierte Bildung unlöslicher Proteinaggregate wurde ausführlich im Zusammenhang mit molekularen Chaperonen und deren Schutzfunktionen in Hefen und Bakterien untersucht11,12,13. Es wurden mehrere Protokolle veröffentlicht, die eine Vielzahl von biochemischen Techniken zur Isolierung und Analyse von unlöslichen Proteinaggregatenverwenden 14,15,16,17. Die bestehenden Protokolle wurden hauptsächlich verwendet, um die bakterielle Proteinaggregation bei Hitzeschock und / oder die Identifizierung molekularer Chaperone zu untersuchen. Während diese Protokolle sicherlich ein Fortschritt auf dem Gebiet waren, gibt es einige große Unannehmlichkeiten in den experimentellen Verfahren, da sie (i) ein großes Bakterienkulturvolumen von bis zu 10 L14,17, (ii) komplizierte physikalische Störungsprozesse, einschließlich der Verwendung von Zelldisruptoren, französischer Presse und / oder Beschallung14,15,17oder (iii) zeitaufwendige wiederholte Wasch- und Inkubationsschritte15,16,17.
Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes Protokoll, das darauf abzielt, die Grenzen der vorherigen Ansätze anzugehen und die Analyse der Menge an Proteinaggregaten ermöglicht, die in zwei verschiedenen Escherichia coli-Stämmen nach der Behandlung mit einer proteotoxischen antimikrobiellen Oberflächenbeschichtung gebildet werden. Die Beschichtung besteht aus Metall-Silber (Ag) und Ruthenium (Ru)-konditioniert mit Ascorbinsäure, und ihre antimikrobielle Aktivität wird durch die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies8,18erreicht. Hierin finden Sie eine detaillierte Beschreibung der Herstellung der Bakterienkultur nach Behandlung mit der antimikrobiellen Verbindung und einen Vergleich des Proteinaggregationsstatus bei Exposition von zwei E. coli-Stämmen mit unterschiedlichen Anfälligkeitsprofilen für eine zunehmende Konzentration des antimikrobiellen Wirkstoffs. Die beschriebene Methode ist kostengünstig, schnell und reproduzierbar und kann verwendet werden, um die Proteinaggregation in Gegenwart anderer proteotoxischer Verbindungen zu untersuchen. Darüber hinaus kann das Protokoll modifiziert werden, um die Auswirkungen spezifischer Gendreichungen auf die Proteinaggregation in einer Vielzahl verschiedener Bakterien zu analysieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

Die Exposition lebender Organismen gegenüber Umwelt- und Zellstress verursacht häufig Störungen in der Proteinöostase und kann zu einer Proteinaggregation führen. Die Ansammlung von Proteinaggregaten in Bakterienzellen kann zu signifikanten Veränderungen des zellulären phänotypischen Verhaltens führen, einschließlich einer Verringerung der Wachstumsraten, der Stressresistenz und der Virulenz. Für die Untersuchung dieser stressorvermittelten Phänotypen existieren mehrere experimentelle Verfahren. Dieser Artikel beschreibt einen optimierten Assay für die Extraktion und Visualisierung von aggregierten und löslichen Proteinen aus verschiedenen Escherichia coli-Stämmen nach Behandlung mit einem silber-rutheniumhaltigen antimikrobiellen Mittel. Es ist bekannt, dass diese Verbindung reaktive Sauerstoffspezies erzeugt und eine weit verbreitete Proteinaggregation verursacht. 
Die Methode kombiniert eine zentrifugationsbasierte Trennung von Proteinaggregaten und löslichen Proteinen aus behandelten und unbehandelten Zellen mit anschließender Trennung und Visualisierung durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Coomassie-Färbung. Dieser Ansatz ist einfach, schnell und ermöglicht einen qualitativen Vergleich der Proteinaggregatbildung in verschiedenen E. coli-Stämmen. Die Methodik hat eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich der Möglichkeit, den Einfluss anderer proteotoxischer antimikrobieller Mittel auf die In-vivo-Proteinaggregation in einer Vielzahl von Bakterien zu untersuchen. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die zu einer erhöhten Resistenz gegen proteotoxische Substanzen beitragen. Gelbänder können zur anschließenden Identifizierung von Proteinen verwendet werden, die besonders anfällig für Aggregation sind.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse der antimikrobiell induzierten Proteinaggregation im kommsalen Escherichia coli-Stamm MG1655 und UPEC-Stamm CFT073. Die E. coli-Stämme MG1655 und CFT073 wurden bei 37 °C und 300 U/min auf OD600= 0,5-0,55 in MOPS-g-Medien gezüchtet, bevor sie mit den angegebenen Konzentrationen (-, 0 mg/ml...

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Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion und Visualisierung von aggregierten und löslichen Proteinen aus Escherichia coli nach Behandlung mit einem proteotoxischen antimikrobiellen Mittel. Nach diesem Verfahren kann ein qualitativer Vergleich der Proteinaggregatbildung in vivo in verschiedenen Bakterienstämmen und/oder zwischen Behandlungen ermöglicht werden.

Extraktion und Visualisierung von Proteinaggregaten nach Behandlung von Escherichia coli mit einem proteotoxischen Stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Die Exposition gegenüber Stress kann zu einer Proteinaggregation führen und zu signifikanten Veränderungen im phänotypischen Verhalten von Bakterien führen. Das in diesem Video beschriebene Verfahren ermöglicht die Extraktion und Visualisierung von Proteinaggregaten nach der Stressbehandlung. Im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Verfahren erfordert dieses Protokoll geringere Zellzahlen und verzichtet auf komplizierte physikalische Störungsprozesse sowie zeitaufwändige Wasch- und Inkubationsschritte.Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Proteinaggregation in einer Vielzahl von gramnegativen und grampositiven Bakterien zu untersuchen. Sie können auch die Wirkung von Genstreichungen analysieren oder die Wirksamkeit proteotoxischer Verbindungen vergleichen. Beginnen Sie mit der Impfung einer einzelnen Kolonie des E.coli-Stammes MG1655 und des uropathogenen E.coli-Stammes CFT073 in jeweils fünf Milliliter Lysogenbrühe oder LB-Medium.Inkubieren Sie die beiden Brühenkulturen bei 37 Grad Celsius und 300 U/ min für 14 bis 16 Stunden. Verdünnen Sie jeden Stamm auf eine optische Dichte von 600 Nanometern oder OD600 von 0,1 in einen 500-Milliliter-Kolben mit 70 Millilitern MOPS-g-Medium. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad und 300 U / min, bis die mittlere Log-Phase erreicht ist.Nach der Inkubation 20 Milliliter jeder Kultur in drei vorgewärmte 125-Milliliter-Kolben geben und bei 37 Grad Celsius und 300 U/ min für zwei Minuten inkubieren. Bereiten Sie eine antimikrobielle Verbindungslösung mit zwei Milligramm pro Milliliter in MOPS-g-Medium vor. Fügen Sie diese Lösung zu jeder Kultur hinzu, um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen, und fügen Sie das erforderliche Volumen an MOPS-g-Medium für die unbehandelte Kontrolle hinzu.Bestimmen Sie den OD600 jeder Kultur nach 45 Minuten Stressbehandlung. Aliquotieren Sie für jede Probe vier Milliliter Kultur mit einem OD600 von einem in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Resuspend die Zellpellets in 50 Mikroliter eiskaltem Lysepuffer.Inkubieren Sie die Proben für 30 Minuten auf Eis. Fügen Sie den Proben 360 Mikroliter eiskalten Puffer A hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren. Die Proben werden in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit rund 200 Mikrolitern 0,5-Millimeter-Glasperlen überführen.Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei acht Grad Celsius in einem ThermoMixer mit Schütteln bei 1400 U/min. Inkubieren Sie die Schläuche fünf Minuten lang auf Eis, ohne zu schütteln, um die Glasperlen abzulegen. Anschließend werden 200 Mikroliter des Zelllysats in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Zentrifugieren Sie das Zelllysat für 20 Minuten bei 16.000 mal g und vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand, der später als lösliche Proteinprobe verwendet wird. Verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet in 200 Mikrolitern eiskaltem Puffer A.Zentrifuge der Röhrchen bei 16.000 mal g und vier Grad Celsius für 20 Minuten wieder aufzubewältigen.Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand ganz. Verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet vorsichtig in 200 Mikroliter eiskaltem Puffer B wieder aufzubelaufen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Dann wiederholen Sie die Wäsche mit Puffer A.Resuspend das Pellet in 100 Mikrolitern 1x reduzierendem SDS-Probenpuffer und kochen Sie es fünf Minuten lang in einem ThermoMixer bei 95 Grad Celsius.Mischen Sie ein Volumen von 100% TCA mit vier Volumina der zuvor gesammelten löslichen Proteinprobe und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei vier Grad Celsius für die Proteinfällung. Zentrifugieren Sie die Probe bei 21.000 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um den Niederschlag zu erhalten, und entfernen Sie den Überstand. Verwenden Sie 200 Mikroliter eiskaltes Aceton, um das Pellet zu waschen und Zellablagerungen zu entfernen.Zentrifugieren Sie die Probe erneut, um den Niederschlag zu erhalten, und entfernen Sie den Überstand. Um das restliche Aceton aus den Pellets zu entfernen, halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen im ThermoMixer bei geöffneten Deckeln bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann 100 Mikroliter mit 1x reduzierendem SDS-Puffer hinzu, um das Pellet vollständig aufzulösen, und kochen Sie die Probe bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten.Laden Sie die Probe sofort zur Trennung auf ein SDS-Polyacrylamidgel oder lagern Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius, um später fortzufahren. Bereiten Sie zwei Trenngele vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Gießen Sie das Gel mit einer Ein-Milliliter-Pipette zwischen die Glasplatten und stellen Sie sicher, dass die oberen zwei Zentimeter frei von der Mischung sind.Fügen Sie 70% Ethanol auf das Trenngel hinzu, wodurch eine gleichmäßige Grenzfläche zwischen den beiden Schichten entsteht. Sobald die Trenngele polymerisiert sind, bereiten Sie die Stapelgele anhand der Anweisungen im Textmanuskript vor. Dann entfernen Sie das Ethanol aus den Trenngelen und fügen Sie die Stapelgellösung hinzu.Führen Sie vorsichtig einen Kamm mit der gewünschten Anzahl von Taschen ein, ohne Luftblasen einzuführen, und lassen Sie das Gel 20 bis 30 Minuten polymerisieren. Laden Sie vier Mikroliter jeder Probe sowie die Proteinleiter in separate Vertiefungen. Dann lassen Sie das Gel in Tris-Glycin-Laufpuffer bei 144 Volt für 45 Minuten bei Raumtemperatur laufen.Verwenden Sie vorgewärmte Fairbanks-Lösung A, um die Gele 30 Minuten lang auf einer Wippe zu färben, und vorgewärmte Fairbanks-Lösung D, um die Gele auf einer Wippe zu entfärben, bis der gewünschte Hintergrund erreicht ist. Es wurde ein Anstieg der Menge an Proteinaggregat beobachtet, die gebildet wurde, wenn Zellen mit 175 Mikrogramm pro Milliliter und 200 Mikrogramm pro Milliliter des antimikrobiellen Wirkstoffs behandelt wurden, verglichen mit unbehandelten Zellen. Der Anstieg der unlöslichen Proteinfraktion war im empfindlicheren MG1655-Stamm ausgeprägter.Eine Abnahme der Menge an löslichen Proteinen wurde beobachtet, wenn Zellen mit 175 Mikrogramm pro Milliliter und 200 Mikrogramm pro Milliliter des antimikrobiellen Wirkstoffs im Vergleich zu unbehandelten Zellen behandelt wurden. Beachten Sie bei diesem Protokoll, dass die Normalisierung auf die optische Dichte bei 600 Nanometern für den Vergleich des Ausmaßes der Proteinaggregation in den Proben wichtig ist.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Forschung

Biochemie

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Nachweis des pH-abhängige Aktivität von<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; und<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Ortsspezifische Lysin-Acetylierung von Histonen zur Nukleosomen-Rekonstitution mit genetischer Codeerweiterung bei Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...