Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הסטארט-אפ של בית הספר למדעי הביולוגיה של אוניברסיטת אילינוי, מענק יוזמת הפקולטה החדשה של אוניברסיטת אילינוי, ומענק NIAID R15AI164585 (ל- J.-U. D.). G.M.A. נתמך על ידי תוכנית התמיכה במחקר לתואר ראשון באוניברסיטת אילינוי (ל- G.M.A.). K. P. H. נתמך על ידי מלגת RISE שסופקה על ידי שירות חילופי האקדמיה הגרמנית (DAAD). המחברים מודים לד"ר אוו לנדאו וד"ר קרסטן מאייר מ-Largentech Vertriebs GmbH על אספקת אבקת AGXX. איור 3 , איור 4 ואיור 5 נוצרו עם Biorender.

1. טיפול בלחץ של זני E. coli MG1655 ו- CFT073
<ol><li>לחסן 5 מ"ל של מרק ליזוגני (LB) בינוני עם מושבה אחת של זן E. coli commensal MG1655 ו זן E. coli (UPEC) זן uropathogenic (UPEC), בהתאמה, ודגרה עבור 14-16 שעות (לילה) ב 37 °C (7 °F) ו 300 סל"ד. הערה: Escherichia coli CFT073 הוא פתוגן אנושי. הטיפול ב- CFT073 חייב להתבצע עם אמצעי בטיחות ביולוג?...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ממוטבת לניתוח היווצרות צבירה של חלבונים לאחר טיפול בזני E. coli שונים עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. הפרוטוקול מאפשר מיצוי סימולטני של שברי חלבון בלתי מסיסים ותאי E. coli מטופלים ולא מטופלים. בהשוואה לפרוטוקולים הקיימים לבידוד צבירה של חלבונים מתאים<sup class="x...

חיידקים חשופים באופן בלתי נמנע לאינספור לחצים סביבתיים, כולל רמת כוח נמוכה (למשל, בקיבה היונקית)1,2, מינים תגובתיים של חמצן וכלור (ROS/RCS) (למשל, במהלך התפרצות חמצונית בפגוציטים)3,4,5, טמפרטורות גבוהות (למשל, במעיינות חמים או במהלך הלם חום)6,7, וכמה מיקרוביאלים חזקים (למשל, AGXX המשמש בפרוטוקול זה)8. חלבונים פגיעים במיוחד לכל אחד מגורשי הלחץ האלה, וחשיפה יכולה לעורר חלבון un-/misfolding כי אז צבירת זרעים. כל האורגניזמים משתמשים במערכות הגנה המאפשרות להם להתמודד עם תקלות חלבון9. עם זאת, מתח חמור יכול להציף את מכונות בקרת איכות החלבון ולשבש את המבנה המשני ו /או שלישוני של חלבונים, אשר בסופו של דבר מנטרל חלבונים. כתוצאה מכך, אגרגטים של חלבונים עלולים לפגוע קשות בתפקודים תאיים קריטיים הנדרשים לצמיחה והישרדות חיידקים, עמידות ללחץ וארס10. לכן, מחקר המתמקד בצבירה של חלבונים והשלכותיו בחיידקים הוא נושא רלוונטי בשל השפעתו הפוטנציאלית על בקרת מחלות זיהומיות.
חלבון המושרה בחום מתפתח וצבירה הם לעתים קרובות הפיכים7. לעומת זאת, לחצים פרוטאוטוקסיים אחרים, כגון עקה חמצונית, יכולים לגרום לשינויים בלתי הפיכים בחלבון באמצעות חמצון של שרשראות צד ספציפיות של חומצות אמינו וכתוצאה מכך חלבון un-/misfolding, ובסופו של דבר, צבירת חלבון4. היווצרות הנגרמת על ידי מתח של אגרגטים חלבון מסיס נחקר בהרחבה בהקשר של מלווים מולקולריים ותפקודי המגן שלהם שמרים וחיידקים11,12,13. כמה פרוטוקולים פורסמו המשתמשים במגוון טכניקות ביוכימיות לבידוד וניתוח של אגרגטים חלבון מסיסים14,15,16,17. הפרוטוקולים הקיימים שימשו בעיקר לחקר צבירת חלבונים חיידקיים על הלם חום ו / או זיהוי של מלווים מולקולריים. בעוד פרוטוקולים אלה בהחלט היו התקדמות לתחום, יש כמה אי נוחות גדולה בהליכים הניסיוניים כי הם דורשים (i) נפח תרבית חיידקים גדולה של עד 10 L14,17, (ii) תהליכי שיבוש פיזיים מסובכים, כולל שימוש משבשי תאים, עיתונות צרפתית, ו / או sonication14,15,17, או (iii) זמן רב חוזר שטיפה ודגרה שלבים15,16,17.
מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה שמטרתו לטפל במגבלות הגישות הקודמות ומאפשר ניתוח של כמות אגרגלי החלבון שנוצרו בשני זני קולי שונים של Escherichia לאחר טיפול בציפוי משטח מיקרוביאלי פרוטאוטוקסי. הציפוי מורכב מתכת כסף (Ag) ורותניום (Ru) מותנה בחומצה אסקורבית, ופעילותו מיקרוביאלית מושגת על ידי הדור של מיני חמצן תגובתי8,18. להלן תיאור מפורט של הכנת תרבית החיידקים לאחר הטיפול בתרכובת האנטי מיקרוביאלית והשוואה של מצב צבירת החלבון עם חשיפה של שני זני E. coli עם פרופילי רגישות ברורים להגברת הריכוז של מיקרוביאלית. השיטה המתוארת היא זולה, מהירה וניתן לשחזור וניתן להשתמש בה כדי לחקור צבירת חלבונים בנוכחות תרכובות פרוטאוטוקסיות אחרות. בנוסף, ניתן לשנות את הפרוטוקול כדי לנתח את ההשפעה שיש למחיקות גנים ספציפיות על צבירת חלבונים במגוון חיידקים שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

החשיפה של אורגניזמים חיים ללחצים סביבתיים ותאיים גורמת לעתים קרובות לשיבושים בהומאוסטזיס של חלבונים ויכולה לגרום לצבירה של חלבונים. הצטברות של אגרגטים חלבון בתאי חיידקים יכול להוביל לשינויים משמעותיים בהתנהגות פנוטיפית הסלולר, כולל ירידה בשיעורי הצמיחה, עמידות ללחץ, וארס. קיימים מספר הליכים ניסיוניים לבדיקת פנוטיפים אלה בתיווך הלחץ. מאמר זה מתאר בדיקה ממוטבת להפקה והדמיה של חלבונים מצטברים ומסיסים מזני קולי שונים של אשריצ'יה לאחר טיפול במיקרוביאלית המכילה כסף-רותניום. תרכובת זו ידועה לייצר מינים חמצן תגובתי וגורם צבירת חלבון נרחבת. 
השיטה משלבת הפרדה מבוססת צנטריפוגה של אגרגטים של חלבונים וחלבונים מסיסים מתאים מטופלים ולא מטופלים עם הפרדה והדמיה לאחר מכן על ידי נתרן דודזיל סולפט-פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) וכתמים קומאסי. גישה זו פשוטה, מהירה, ומאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבונים בזני E. coli שונים. למתודולוגיה מגוון רחב של יישומים, כולל האפשרות לחקור את ההשפעה של מיקרוביאלים פרוטאוטוקסיים אחרים על צבירת חלבון ויו במגוון רחב של חיידקים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי לזהות גנים התורמים עמידות מוגברת לחומרים פרוטאוטוקסיים. רצועות ג'ל יכולות לשמש לזיהוי מאוחר יותר של חלבונים הנוטים במיוחד לצבירה.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> איור 6: תוצאות מייצגות של צבירת חלבונים הנגרמת על ידי מיקרוביאלית בזן קולי Escherichia commensal MG1655 וזן UPEC CFT073. זני E. coli MG1655 ו- CFT073 גדלו ב 37 °C ו 300 סל"ד כדי OD600= 0.5-0.55 במדיה MOPS-g לפני שהם טופלו עם הריכ...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

פרוטוקול זה מתאר את החילוץ והדמיון של חלבונים מצטברים ומסיסים מ Escherichia coli לאחר טיפול עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. בעקבות הליך זה מאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבון ב- vivo בזני חיידקים שונים ו/או בין טיפולים.

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

חשיפה ללחץ עלולה לגרום לצבירה של חלבונים ולגרום לשינויים משמעותיים בהתנהגות הפנוטיפית של חיידקים. ההליך המתואר בסרטון זה מאפשר מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול מתח. בניגוד לנהלים אחרים שפורסמו, פרוטוקול זה דורש מספרי תאים נמוכים יותר ונמנע מתהליכי שיבוש פיזיים מסובכים, כמו גם צעדי כביסה ודגורה הגוזלים זמן רב.פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר צבירת חלבונים במגוון רחב של חיידקים גרם שלילי ו גרם חיובי. אתה יכול גם לנתח את ההשפעה של מחיקות גנים או להשוות את היעילות של תרכובות פרוטאוטוקסיות. התחל על ידי חנק מושבה אחת של זן E.coli MG1655 ו זן E.coli אורופתיגני CFT073, כל אחד לחמישה מיליליטרים של ציר ליזוגניה, או LB, בינוני.לדגור על שתי תרביות המרק ב 37 מעלות צלזיוס ו 300 סל"ד במשך 14 עד 16 שעות. לדלל כל זן לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר, או OD600, של 0.1 לתוך בקבוק 500 מיליליטר המכיל 70 מיליליטר של MOPS-g בינוני. לדגור את הבקבוקונים ב 37 מעלות ו 300 סל"ד עד לשלב אמצע היומן הוא הגיע.לאחר הדגירה, מעבירים 20 מיליליטר של כל תרבות לשלושה צלוחיות 125 מיליליטר מחוממות מראש, ודגר אותם ב-37 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד לשתי דקות. הכן פתרון תרכובת מיקרוביאלית של שני מיליגרם למיליליטר במדיום MOPS-g. הוסף פתרון זה לכל תרבות כדי להגיע לריכוזים הרצויים, והוסף את הנפח הנדרש של מדיום MOPS-g עבור השליטה הלא מטופלת.לקבוע את OD600 של כל תרבות לאחר 45 דקות של טיפול בלחץ. עבור כל מדגם, aliquot ארבעה מיליליטר של תרבות עם OD600 של אחד לתוך צינורות צנטריפוגות 15 מיליליטר. resuspend כדורי התא ב 50 microliters של חוצץ תמיסת קר כקרח.לדגור על הדגימות במשך 30 דקות על קרח. הוסיפו לדגימות 360 מיקרוליטרים של חוצץ קר כקרח A, וערבבו בעדינות על-ידי צנרת. העבר את הדגימות לתוך שני מיליליטר צינורות microcentrifuge עם סביב 200 microliters של חרוזי זכוכית 0.5 מ"מ.לדגור על הצינורות במשך 30 דקות בשמונה מעלות צלזיוס בתרמומיקסר עם רועד ב 1400 סל"ד. לדגור את הצינורות על הקרח במשך חמש דקות בלי לרעוד כדי ליישב את חרוזי הזכוכית. לאחר מכן להעביר 200 microliters של התא ליסייט לתוך צינורות microcentrifuge 1.7 מיליליטר.צנטריפוגות התא lysate במשך 20 דקות ב 16, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant, אשר ישמש דגימת חלבון מסיס מאוחר יותר. השתמש פיפטה כדי resuspend הכדור ב 200 microliters של חוצץ קר כקרח A.Centrifuge של הצינורות ב 16, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.ואז בזהירות להסיר את supernatant לגמרי. השתמש פיפטה כדי בזהירות resuspend הכדור ב 200 microliters של חוצץ קר כקרח B.Centrifuge הצינורות שוב, ולהסיר בזהירות את supernatant. לאחר מכן לחזור על לשטוף עם חוצץ A.Resuspend הכדור ב 100 microliters של 1x הפחתת SDS חוצץ מדגם, ולהרתיח אותו במשך חמש דקות ThermoMixer ב 95 מעלות צלזיוס.מערבבים נפח אחד של 100% TCA עם ארבעה כרכים של דגימת החלבון המסיס שנאספו קודם לכן, ודגר במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס למכשכי חלבון. צנטריפוגה הדגימה ב 21, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להשיג את המשקעים, ולהסיר את supernatant. השתמש 200 microliters של אצטון קר כקרח לשטוף את הכדור, כדי להסיר פסולת הסלולר.צנטריפוגה המדגם שוב כדי להשיג את המשקעים, ולהסיר את supernatant. כדי להסיר את האצטון הנותר מן הכדורים, לשמור על צינורות microcentrifuge ב ThermoMixer ב 37 מעלות צלזיוס עם המכסים שלהם פתוחים. לאחר מכן להוסיף 100 microliters של 1x הפחתת SDS חוצץ כדי להמיס לחלוטין את הכדור, ולהרתיח את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.מיד לטעון את המדגם על ג'ל polyacrylamide SDS להפרדה, או לאחסן את המדגם במינוס 20 מעלות צלזיוס להמשיך מאוחר יותר. הכן שני ג'לים מפרידים כמתואר בכתב היד של הטקסט. יוצקים את הג'ל בין לוחות הזכוכית באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, ומבטיחים ששני הסנטימטרים העליונים יהיו חופשיים מהתערובת.מוסיפים 70% אתנול על גבי הג'ל המפריד, ויוצרים ממשק אחיד בין שתי השכבות. לאחר הג'לים המפרידים יש פולימר, להכין את ג'ל הערימה באמצעות הוראות בכתב היד הטקסט. לאחר מכן להסיר את האתנול מן הג'לים המפרידים, ולהוסיף את פתרון ג'ל לערום.בזהירות להכניס מסרק עם מספר הכיסים הרצוי מבלי להציג בועות אוויר, ולאפשר ג'ל פילמור במשך 20 עד 30 דקות. טען ארבעה מיקרוליטרים של כל דגימה, כמו גם סולם החלבון, לבארות נפרדות. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב חוצץ ריצה טריז גליצין ב 144 וולט במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.השתמש בפתרון פיירבנקס מחומם מראש A כדי להכתים את הג'לים על רוקר במשך 30 דקות ופתרון פיירבנקס מחמם מראש D כדי לדכא את הצבע של הג'לים על רוקר עד שהרקע הרצוי מושג. עלייה נצפתה בכמות צבירה של חלבון שנוצר כאשר תאים טופלו עם 175 מיקרוגרם למיליליטר ו 200 מיקרוגרם למיליליטר של מיקרוביאלית, בהשוואה לתאים לא מטופלים. העלייה בשבר החלבון המסיס הייתה בולטת יותר בזן MG1655 הרגיש יותר.נצפתה ירידה בכמות החלבונים המסיסים כאשר תאים טופלו עם 175 מיקרוגרם למיליליטר ו 200 מיקרוגרם למיליליטר של מיקרוביאלית, בהשוואה לתאים לא מטופלים. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי נורמליזציה לצפיפות האופטית ב 600 ננומטר חשוב להשוואה של היקף צבירת החלבון בדגימות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

אתר ספציפי ליסין אצטילציה של היסטונים עבור שחזור Nucleosome באמצעות הרחבת קוד גנטי ב Escherichia קולי

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...