Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

इस काम को इलिनोइस स्टेट यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज स्टार्टअप फंड्स, इलिनोइस स्टेट यूनिवर्सिटी न्यू फैकल्टी इनिशिएटिव ग्रांट और एनआईएआईडी ग्रांट R15AI164585 (जे-यू) द्वारा समर्थित किया गया था। D.). जी.M को इलिनोइस स्टेट यूनिवर्सिटी अंडरग्रेजुएट रिसर्च सपोर्ट प्रोग्राम (जी.M ए) द्वारा समर्थित किया गया था। के पी एच को जर्मन अकादमिक एक्सचेंज सर्विस (डीएएडी) द्वारा प्रदान की गई राइज फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक AGXX पाउडर प्रदान करने के लिए लार्जनटेक वेर्ट्रिब्स जीएमबीएच से डॉ उवे लैंडौ और डॉ कार्स्टेन मेयेर का शुक्रिया अदा करते हैं । आंकड़े 1, चित्रा 2, चित्र 3, चित्र 4,और चित्रा 5 बायोरेंडर के साथ उत्पन्न किए गए थे।

1. ई. कोलाई उपभेदों MG1655 और CFT073 के तनाव उपचार
<ol><li>9सोगनी शोरबा (एलबी) माध्यम के 5 एमसीएल को कमेंसल ई. कोलाई स्ट्रेन MG1655 और यूरोपैथोजेनिक ई. कोलाई (यूपीईसी) स्ट्रेन सीएफटी073 के साथ क्रमशः, और 37 डिग्री सेल्?...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल एक प्रोटेटोक्सिक एंटीमाइक्रोबियल के साथ विभिन्न ई कोलाई उपभेदों के उपचार के बाद प्रोटीन कुल गठन के विश्लेषण के लिए एक अनुकूलित पद्धति का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल इलाज और अनुपचारित ...

बैक्टीरिया अनिवार्य रूप से कम पीएच सहित पर्यावरण तनाव के असंख्य के संपर्क में हैं (उदाहरण के लिए, स्तनधारी पेट में)1,2,प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और क्लोरीन प्रजातियां (आरओएस/आरसीएस) (उदाहरण के लिए, फागोसाइट्स में ऑक्सीडेटिव फटने के दौरान)3,4,5,ऊंचा तापमान (जैसे, गर्म झरनों में या गर्मी-सदमे के दौरान)6,7,और कई शक्तिशाली एंटीमाइक्रोबिल (जैसे, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एजीएक्सएक्स)8. प्रोटीन विशेष रूप से इन तनावों में से किसी के लिए असुरक्षित हैं, और जोखिम प्रोटीन को उत्तेजित कर सकता है/गलत है कि फिर बीज एकत्रीकरण । सभी जीव सुरक्षात्मक प्रणालियों को नियोजित करते हैं जो उन्हें प्रोटीन के गलत ो -9से निपटने की अनुमति देते हैं । हालांकि, गंभीर तनाव प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण मशीनरी को अभिभूत कर सकता है और प्रोटीन की माध्यमिक और/या तृतीयक संरचना को बाधित कर सकता है, जो अंतत प्रोटीन को निष्क्रिय कर देता है । नतीजतन, प्रोटीन समुच्चय बैक्टीरियल विकास और अस्तित्व, तनाव प्रतिरोध और उग्रता10के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों को गंभीर रूप से ख़राब कर सकता है। इसलिए, प्रोटीन एकत्रीकरण और बैक्टीरिया में इसके परिणामों पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान संक्रामक रोग नियंत्रण पर इसके संभावित प्रभाव के कारण एक प्रासंगिक विषय है ।
गर्मी प्रेरित प्रोटीन खुलासा और एकत्रीकरण अक्सर7उलटा कर रहे हैं । इसके विपरीत, ऑक्सीडेटिव तनाव जैसे अन्य प्रोटोटॉक्सिक तनाव, विशिष्ट अमीनो एसिड साइड चेन के ऑक्सीकरण के माध्यम से अपरिवर्तनीय प्रोटीन संशोधनपैदा कर सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन अन-/मिसफोल्डिंग और अंततः प्रोटीन एकत्रीकरण4। अघुलनशील प्रोटीन के तनाव -प्रेरित गठन का आणविक चैपरोन और खमीर और बैक्टीरिया11 , 12,13में उनके सुरक्षात्मक कार्यों के संदर्भ में व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है । कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं जो अघुलनशील प्रोटीन के अलगाव और विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रकार की जैव रासायनिक तकनीकों का उपयोग करते हैं14,15,16,17. मौजूदा प्रोटोकॉल मुख्य रूप से गर्मी-सदमे और/या आणविक chaperones की पहचान पर बैक्टीरियल प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि इन प्रोटोकॉल निश्चित रूप से क्षेत्र के लिए एक उन्नति किया गया है, वहां प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में कुछ बड़ी असुविधाओं रहे है क्योंकि वे (i) 10 एल14, 17, (ii) जटिल शारीरिक व्यवधान प्रक्रियाओं, सेल बाधित, फ्रांसीसी प्रेस, और/या sonication14, 15,17,या (iii) समय लेने के लिए एक बड़ी जीवाणु संस्कृति की मात्रा की आवश्यकता है धुलाई और इनक्यूबेशन कदम15,16,17.
यह पेपर एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उद्देश्य पिछले दृष्टिकोणों की सीमाओं को संबोधित करना है और एक प्रोटोटॉक्सिक एंटीमाइक्रोबियल सतह कोटिंग के साथ उपचार के बाद दो अलग-अलग एस्चेरिचिया कोलाई उपभेदों में गठित प्रोटीन समुच्चय की मात्रा के विश्लेषण की अनुमति देता है। कोटिंग धातु-चांदी (एजी) और रुथेनियम (आरयू) से बना है- एस्कॉर्बिक एसिड के साथ वातानुकूलित, और इसकी रोगाणुरोधी गतिविधि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों8, 18के उत्पादन द्वारा प्राप्त की जाती है। इसके बाद एंटीमाइक्रोबियल यौगिक के साथ उपचार के बाद बैक्टीरियल संस्कृति की तैयारी और एंटीमाइक्रोबियल की एकाग्रता बढ़ाने के लिए अलग संवेदनशीलता प्रोफाइल के साथ दो ई कोलाई उपभेदों के संपर्क में प्रोटीन एकत्रीकरण की स्थिति की तुलना का विस्तृत विवरण है। वर्णित विधि सस्ती, तेज और प्रजनन योग्य है और इसका उपयोग अन्य प्रोटोटॉक्सिक यौगिकों की उपस्थिति में प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को विभिन्न बैक्टीरिया में प्रोटीन एकत्रीकरण पर विशिष्ट जीन विलोपन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

पर्यावरण और सेलुलर तनाव के लिए जीवित जीवों के जोखिम अक्सर प्रोटीन होरोस्टेसिस में व्यवधान का कारण बनता है और प्रोटीन एकत्रीकरण में परिणाम कर सकते हैं । जीवाणु कोशिकाओं में प्रोटीन समुच्चय के संचय से सेलुलर फेनोटाइपिक व्यवहार में महत्वपूर्ण परिवर्तन हो सकते हैं, जिसमें विकास दर में कमी, तनाव प्रतिरोध और उग्रता शामिल है। इन तनाव-मध्यस्थता फेनोटाइप की परीक्षा के लिए कई प्रायोगिक प्रक्रियाएं मौजूद हैं। यह पत्र चांदी-रुथेनियम युक्त एंटीमाइक्रोबियल के साथ उपचार के बाद विभिन्न एस्चेरिचिया कोलाई उपभेदों से एकत्रित और घुलनशील प्रोटीन के निष्कर्षण और दृश्य के लिए एक अनुकूलित परख का वर्णन करता है। यह यौगिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को उत्पन्न करने के लिए जाना जाता है और व्यापक प्रोटीन एकत्रीकरण का कारण बनता है। 
विधि सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट-पॉलीक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) और कूमासी धुंधला द्वारा बाद के पृथक्करण और दृश्य के साथ इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं से प्रोटीन समुच्चय और घुलनशील प्रोटीन के एक अपकेंद्रित्र आधारित पृथक्करण को जोड़ती है। यह दृष्टिकोण सरल, तेज है, और विभिन्न ई. कोलाई उपभेदों में प्रोटीन कुल गठन की गुणात्मक तुलना की अनुमति देता है। कार्यप्रणाली में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है, जिसमें बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला में वीवो प्रोटीन एकत्रीकरण पर अन्य प्रोटोटॉक्सिक एंटीमाइक्रोबिल्स के प्रभाव की जांच करने की संभावना शामिल है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग उन जीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो प्रोटोटॉक्सिक पदार्थों के प्रतिरोध को बढ़ाने में योगदान देते हैं। जेल बैंड का उपयोग प्रोटीन की बाद की पहचान के लिए किया जा सकता है जो विशेष रूप से एकत्रीकरण से ग्रस्त हैं।

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> चित्रा 6:कॉमेंसल एस्चेरिचिया कोलाई स्ट्रेन एमजी1655 और यूपीईसी स्ट्रेन सीएफटी073 में एंटीमाइक्रोबियल-प्रेरित प्रोटीन एकत्रीकरण के प्रतिनि...

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Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

यह प्रोटोकॉल एक प्रोटोटॉक्सिक एंटीमाइक्रोबियल के साथ उपचार के बाद एस्चेरिचिया कोलाई से एकत्रित और घुलनशील प्रोटीन के निष्कर्षण और दृश्य का वर्णन करता है। इस प्रक्रिया के बाद विभिन्न जीवाणु उपभेदों और/या उपचार के बीच में वीवो में प्रोटीन समग्र गठन की गुणात्मक तुलना की अनुमति देता है ।

प्रोटोटॉक्सिक स्ट्रेसर के साथ एस्चेरिचिया कोलाई के उपचार के बाद प्रोटीन समुच्चय का निष्कर्षण और दृश्य

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

तनाव के संपर्क में प्रोटीन एकत्रीकरण पैदा कर सकता है और बैक्टीरिया के फेनोटाइपिक व्यवहार में महत्वपूर्ण परिवर्तन हो सकता है। इस वीडियो में वर्णित प्रक्रिया तनाव उपचार के बाद प्रोटीन समुच्चय के निष्कर्षण और दृश्य की अनुमति देती है। अन्य प्रकाशित प्रक्रियाओं के विपरीत, इस प्रोटोकॉल को कम सेल संख्या की आवश्यकता होती है और जटिल शारीरिक व्यवधान प्रक्रियाओं के साथ-साथ समय लेने वाली धुलाई और इनक्यूबेशन चरणों से बचना होता है।इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रकार के ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया में प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। आप जीन विलोपन के प्रभाव का विश्लेषण भी कर सकते हैं या प्रोटोटॉक्सिक यौगिकों की प्रभावकारिता की तुलना कर सकते हैं। ई.कोलाई तनाव MG1655 और यूरोपैथोजेनिक ई.कोलाई तनाव CFT073, lysogeny शोरबा, या पौंड, मध्यम के पांच मिलीलीटर में प्रत्येक की एक कॉलोनी को इनोक्यूलाइज करके शुरू करें।दो शोरबा संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस और 300 आरपीएम को 14 से 16 घंटे तक इनक्यूबेट करें। प्रत्येक तनाव को 600 नैनोमीटर, या OD600 पर एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए पतला करें, 0.1 में 500-मिलीलीटर फ्लास्क जिसमें 70 मिलीलीटर एमओपी-जी माध्यम होता है। मिड-लॉग चरण तक पहुंचने तक फ्लास्क को 37 डिग्री और 300 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक संस्कृति के 20 मिलीलीटर को तीन पूर्व-गर्म 125-मिलीलीटर फ्लास्क में स्थानांतरित करें, और उन्हें दो मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 300 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें। एमओपी-जी माध्यम में दो मिलीग्राम-प्रति-मिलीलीटर एंटीमाइक्रोबियल यौगिक समाधान तैयार करें। वांछित सांद्रता तक पहुंचने के लिए प्रत्येक संस्कृति में इस समाधान को जोड़ें, और अनुपचारित नियंत्रण के लिए एमओपीएस-जी माध्यम की आवश्यक मात्रा जोड़ें।तनाव उपचार के 45 मिनट के बाद प्रत्येक संस्कृति के OD600 निर्धारित करें। प्रत्येक नमूने के लिए, 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एक के OD600 के साथ संस्कृति के चार मिलीलीटर aliquot । बर्फ-कोल्ड लाइसिस बफर के 50 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को फिर से रीसल्पेंड करें।बर्फ पर 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें। नमूनों में बर्फ-ठंडे बफर ए के 360 माइक्रोलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे पाइपिंग करके मिलाएं। नमूनों को ०.५ मिलीमीटर ग्लास मोतियों के लगभग २०० माइक्रोलीटर के साथ दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें ।1400 आरपीएम पर मिलाते हुए एक थर्मोमिक्सर में आठ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। कांच के मोतियों को व्यवस्थित करने के लिए बिना हिलाए पांच मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। इसके बाद सेल के 200 माइक्रोलीटर को 1.7 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में ट्रांसफर करें।सेंट्रलाइज सेल 20 मिनट के लिए 16, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर lysate । सुपरनैंट को ले लीजिए, जिसका उपयोग बाद में घुलनशील प्रोटीन नमूने के रूप में किया जाएगा। 16, 000 बार जी और 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों के बर्फ-ठंडे बफर ए सेंट्रफ्यूज के 200 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।फिर ध्यान से सुपरनिटेंट को पूरी तरह से हटा दें। बर्फ के 200 माइक्रोलीटर में गोली को सावधानी से फिर से रीसस्ट करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें- ठंडा बफर बी सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को फिर से, और ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें। फिर बफर ए. Resuspend के साथ धोने दोहराएं 1x के १०० माइक्रोलीटर में गोली को कम करने एसडीएस नमूना बफर को कम करने, और यह ९५ डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मोमिक्सर में पांच मिनट के लिए फोड़ा ।पहले एकत्र किए गए घुलनशील प्रोटीन नमूने की चार मात्रा के साथ 100% टीसीए की एक मात्रा मिलाएं, और प्रोटीन वर्षा के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस नमूने को पांच मिनट के लिए 21, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनेट को हटा दें। सेलुलर मलबे को हटाने के लिए, गोली धोने के लिए बर्फ-ठंड एसीटोन के 200 माइक्रोलीटर का उपयोग करें।अपकेशन प्राप्त करने के लिए नमूना फिर से अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनेट को हटा दें। छर्रों से शेष एसीटोन को हटाने के लिए थर्मोमिक्सर में माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर अपने ढक्कन के साथ खुला रखें। फिर गोली को पूरी तरह से भंग करने के लिए एसडीएस बफर को कम करने वाले 1x के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और नमूना को पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें।पृथक्करण के लिए एसडीएस पॉलीएक्रेलैमाइड जेल पर तुरंत नमूना लोड करें, या बाद में आगे बढ़ने के लिए नमूने को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित दो अलग जैल तैयार करें। एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके ग्लास प्लेटों के बीच जेल डालें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ऊपरी दो सेंटीमीटर मिश्रण से मुक्त हैं।अलग जेल के शीर्ष पर 70% इथेनॉल जोड़ें, दो परतों के बीच एक भी इंटरफेस बनाने। एक बार अलग जैल बहुलक हो जाने के बाद, पाठ पांडुलिपि में निर्देशों का उपयोग करके स्टैकिंग जैल तैयार करें। फिर अलग जैल से इथेनॉल निकालें, और स्टैकिंग जेल समाधान जोड़ें।ध्यान से हवा के बुलबुले शुरू किए बिना जेब की वांछित संख्या के साथ एक कंघी डालें, और जेल को 20 से 30 मिनट के लिए बहुलक बनाने की अनुमति दें। प्रत्येक नमूने के चार माइक्रोलीटर लोड करें, साथ ही प्रोटीन सीढ़ी, अलग कुओं में। फिर कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 144 वोल्ट पर ट्राइस-ग्लाइसिन रनिंग बफर में जेल चलाएं।30 मिनट के लिए एक घुमाव पर जैल दाग करने के लिए पूर्व-गरम फेयरबैंक्स समाधान ए का उपयोग करें और वांछित पृष्ठभूमि प्राप्त होने तक एक घुमाव पर जैल को डी-कलर करने के लिए पूर्व-गर्म फेयरबैंक्स समाधान डी। अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में कोशिकाओं को १७५ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर और एंटीमाइक्रोबियल के २०० माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ इलाज किए जाने पर कुल मिलाकर प्रोटीन की मात्रा में वृद्धि देखी गई । अघुलनशील प्रोटीन अंश में वृद्धि अधिक संवेदनशील MG1655 तनाव में अधिक स्पष्ट किया गया था ।अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में घुलनशील प्रोटीन की मात्रा में कमी देखी गई जब कोशिकाओं का इलाज १७५ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर और एंटीमाइक्रोबियल के २०० माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ किया गया । इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, ध्यान रखें कि नमूनों में प्रोटीन एकत्रीकरण की सीमा की तुलना के लिए 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को सामान्य बनाना महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

से बाहरी झिल्ली Vesicles भीतर निर्देशित प्रोटीन पैकेजिंग<em&gt; कोलाई</em&gt;: डिजाइन, उत्पादन और शोधन

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

के पीएच निर्भर गतिविधि का पता लगाने<em&gt; कोलाई</em&gt; निगरानी HdeB<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए नुकसान-प्रेरित प्रोटीन परिसरों का पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन निकटता के बंधन परख का उपयोग करना

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय का संवर्धन

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

ठहराव की बहुतायत और चार्ज करने के स्तर के हस्तांतरण RNAs में ई कोलाई

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

एक परिपत्र पाड़ पर रिकॉमबिनेंट RNAs के बड़े पैमाने पर उत्पादन ई कोलाई में एक Viroid-व्युत्पन्न प्रणाली का उपयोग

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

साइट-निर्देशित Mutagenesis इन विट्रो में और Vivo प्रयोगों उदाहरण में आरएनए बातचीत के साथ ई कोलाई

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

इन्फ्रारेड नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यक्तिगत प्रोटीन सकल की विशेषता

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

एस्चेरिचिया कोलाई में जेनेटिक कोड विस्तार का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम पुनर्गठन के लिए हिस्टोन्स की साइट विशिष्ट लाइसिन एसिटिलेशन

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...