Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
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Questo lavoro è stato supportato dai fondi di avvio della Illinois State University School of Biological Sciences, dall'Illinois State University New Faculty Initiative Grant e dalla sovvenzione NIAID R15AI164585 (a J.-U. D.). G.M.A. è stato supportato dall'Illinois State University Undergraduate Research Support Program (a G.M.A.). K. P. H. è stato supportato da una borsa di studio RISE fornita dal German Academic Exchange Service (DAAD). Gli autori ringraziano il Dr. Uwe Landau e il Dr. Carsten Meyer di Largentech Vertriebs GmbH per aver fornito la polvere AGXX. Le figure 1, figura 2, figura 3, figura 4e figura 5 sono state generate con Biorender.

1. Trattamento da stress dei ceppi di E. coli MG1655 e CFT073
<ol><li>Inoculare 5 mL di brodo di lipogenesi (LB) con una singola colonia di E. coli ceppo MG1655 e uropatogeno E. coli (UPEC) ceppo CFT073, rispettivamente, e incubare per 14-16 ore (durante la notte) a 37 °C e 300 rpm. NOTA: Escherichia coli CFT073 è un agente patogeno umano. La manipolazione di CFT073 deve essere eseguita con adeguate misure di biosicurezza in un laboratorio certificato di livello 2 di biosicurezz...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

Questo protocollo descrive una metodologia ottimizzata per l'analisi della formazione di aggregati proteici dopo il trattamento di diversi ceppi di E. coli con un antimicrobico proteotossico. Il protocollo consente l'estrazione simultanea di frazioni proteiche insolubili e solubili da cellule di E. coli trattate e non trattate. Rispetto ai protocolli esistenti per l'isolamento di aggregati proteici dalle cellule14,15,<sup class="xref"...

I batteri sono inevitabilmente esposti a una miriade di stress ambientali, tra cui pH basso (ad esempio, nello stomaco dei mammiferi)1,2,specie reattive dell'ossigeno e del cloro (ROS / RCS) (ad esempio, durante lo scoppio ossidativo nei fagociti)3,4,5, temperature elevate (ad esempio, nelle sorgenti calde o durante lo shock termico)6,7e diversi potenti antimicrobici (ad esempio, AGXX utilizzato in questo protocollo)8. Le proteine sono particolarmente vulnerabili a uno qualsiasi di questi fattori di stress e l'esposizione può provocare un-/misfolding proteico che poi semina l'aggregazione. Tutti gli organismi impiegano sistemi protettivi che consentono loro di far fronte al misfolding proteico9. Tuttavia, uno stress grave può sopraffare il meccanismo di controllo della qualità delle proteine e interrompere la struttura secondaria e / o terziaria delle proteine, che alla fine inattiva le proteine. Di conseguenza, gli aggregati proteici possono compromettere gravemente le funzioni cellulari critiche necessarie per la crescita e la sopravvivenza batterica, la resistenza allo stress e la virulenza10. Pertanto, la ricerca incentrata sull'aggregazione proteica e le sue conseguenze nei batteri è un argomento rilevante a causa del suo potenziale impatto sul controllo delle malattie infettive.
Lo sviluppo e l'aggregazione delle proteine indotte dal calore sono spesso reversibili7. Al contrario, altri stress proteotossici, come lo stress ossidativo, possono causare modificazioni proteiche irreversibili attraverso l'ossidazione di specifiche catene laterali di aminoacidi con conseguente un-/misfolding proteico e, infine, aggregazione proteica4. La formazione indotta da stress di aggregati proteici insolubili è stata ampiamente studiata nel contesto degli chaperoni molecolari e delle loro funzioni protettive in lieviti e batteri11,12,13. Sono stati pubblicati diversi protocolli che utilizzano una varietà di tecniche biochimiche per l'isolamento e l'analisi di aggregati proteici insolubili14,15,16,17. I protocolli esistenti sono stati utilizzati principalmente per studiare l'aggregazione proteica batterica in caso di shock termico e/o identificazione di chaperoni molecolari. Mentre questi protocolli sono stati certamente un progresso nel campo, ci sono alcuni importanti inconvenienti nelle procedure sperimentali perché richiedono (i) un grande volume di coltura batterica fino a 10 L14,17, (ii) complicati processi di interruzione fisica, incluso l'uso di disgregatori cellulari, stampa francese e / o sonicazione14,15,17o (iii) lunghi processi ripetuti fasi di lavaggio e incubazione15,16,17.
Questo documento descrive un protocollo modificato che mira ad affrontare i limiti degli approcci precedenti e consente l'analisi della quantità di aggregati proteici formati in due diversi ceppi di Escherichia coli dopo il trattamento con un rivestimento superficiale antimicrobico proteotossico. Il rivestimento è composto da metallo-argento (Ag) e rutenio (Ru)-condizionati con acido ascorbico, e la sua attività antimicrobica è ottenuta dalla generazione di specie reattive dell'ossigeno8,18. Di seguito è riportata una descrizione dettagliata della preparazione della coltura batterica dopo il trattamento con il composto antimicrobico e un confronto dello stato di aggregazione proteica in caso di esposizione di due ceppi di E. coli con distinti profili di suscettibilità all'aumento della concentrazione dell'antimicrobico. Il metodo descritto è economico, veloce e riproducibile e può essere utilizzato per studiare l'aggregazione proteica in presenza di altri composti proteotossici. Inoltre, il protocollo può essere modificato per analizzare l'impatto che specifiche delezioni geniche hanno sull'aggregazione proteica in una varietà di batteri diversi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

L'esposizione degli organismi viventi a stress ambientali e cellulari spesso causa interruzioni nell'omeostasi proteica e può provocare l'aggregazione proteica. L'accumulo di aggregati proteici nelle cellule batteriche può portare ad alterazioni significative nel comportamento fenotipico cellulare, tra cui una riduzione dei tassi di crescita, resistenza allo stress e virulenza. Esistono diverse procedure sperimentali per l'esame di questi fenotipi mediati da fattori di stress. Questo documento descrive un test ottimizzato per l'estrazione e la visualizzazione di proteine aggregate e solubili da diversi ceppi di Escherichia coli dopo il trattamento con un antimicrobico contenente argento-rutenio. Questo composto è noto per generare specie reattive dell'ossigeno e provoca un'aggregazione proteica diffusa. 
Il metodo combina una separazione basata sulla centrifugazione di aggregati proteici e proteine solubili da cellule trattate e non trattate con successiva separazione e visualizzazione mediante elettroforesi su gel di dodecilsalfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e colorazione di Coomassie. Questo approccio è semplice, veloce e consente un confronto qualitativo della formazione di aggregati proteici in diversi ceppi di E. coli. La metodologia ha una vasta gamma di applicazioni, tra cui la possibilità di studiare l'impatto di altri antimicrobici proteotossici sull'aggregazione proteica in vivo in una vasta gamma di batteri. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per identificare i geni che contribuiscono ad aumentare la resistenza alle sostanze proteossiche. Le bande di gel possono essere utilizzate per la successiva identificazione di proteine particolarmente inclini all'aggregazione.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> Figura 6: Risultati rappresentativi dell'aggregazione proteica indotta da antimicrobici in Escherichia coli commensale ceppo MG1655 e UPEC ceppo CFT073. I ceppi di E. coli MG1655 e CFT073 sono stati coltivati a 37 °C e 300 rpm a OD600= 0,5-0,55 in mezzi MOPS-g prima di essere trattati con le concentrazioni indicate (-, 0 mg/mL; +...

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Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Questo protocollo descrive l'estrazione e la visualizzazione di proteine aggregate e solubili da Escherichia coli dopo il trattamento con un antimicrobico proteotossico. Seguire questa procedura permette un confronto qualitativo della formazione di aggregati proteici in vivo in diversi ceppi batterici e/o tra trattamenti.

Estrazione e visualizzazione di aggregati proteici dopo il trattamento di Escherichia coli con un fattore di stress proteotossico

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

L'esposizione allo stress può causare aggregazione proteica e provocare alterazioni significative nel comportamento fenotipico dei batteri. La procedura descritta in questo video consente l'estrazione e la visualizzazione di aggregati proteici dopo il trattamento dello stress. A differenza di altre procedure pubblicate, questo protocollo richiede un numero di cellule inferiore e si astiene da complicati processi di interruzione fisica, nonché fasi di lavaggio e incubazione che richiedono tempo.Questo protocollo può essere utilizzato per studiare l'aggregazione proteica in un'ampia varietà di batteri gram-negativi e gram-positivi. È inoltre possibile analizzare l'effetto delle delezioni geniche o confrontare l'efficacia dei composti proteotossici. Inizia inoculando una singola colonia di E.coli ceppo MG1655 e uropatogeno E.coli ceppo CFT073, ciascuno in cinque millilitri di brodo di lipogenesi, o LB, medio.Incubare le due colture di brodo a 37 gradi Celsius e 300 giri / min per 14-16 ore. Diluire ogni ceppo a una densità ottica a 600 nanometri, o OD600, di 0,1 in un pallone da 500 millilitri contenente 70 millilitri di terreno MOPS-g. Incubare i palloni a 37 gradi e 300 giri / min fino a raggiungere la fase di metà log.Dopo l'incubazione, trasferire 20 millilitri di ciascuna coltura in tre palloni da 125 millilitri preriscaldati e incubarli a 37 gradi Celsius e 300 giri / min per due minuti. Preparare una soluzione di composto antimicrobico da due milligrammi per millilitro in mezzo MOPS-g. Aggiungere questa soluzione a ciascuna coltura per raggiungere le concentrazioni desiderate e aggiungere il volume richiesto di terreno MOPS-g per il controllo non trattato.Determinare l'OD600 di ogni coltura dopo 45 minuti di trattamento dello stress. Per ogni campione, aliquota quattro millilitri di coltura con un OD600 di uno in tubi centrifughi da 15 millilitri. Riconsoscidare i pellet cellulari in 50 microlitri di tampone di lisi ghiacciato-freddo.Incubare i campioni per 30 minuti sul ghiaccio. Aggiungere 360 microlitri di tampone A ghiacciato ai campioni e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Trasferire i campioni in tubi microcentrifuga da due millilitri con circa 200 microlitri di perle di vetro da 0,5 millimetri.Incubare i tubi per 30 minuti a otto gradi Celsius in un Bimbyer con agitazione a 1400 giri / min. Incubare i tubi sul ghiaccio per cinque minuti senza agitare per sistemare le perle di vetro. Quindi trasferire 200 microlitri del llisi cellulare in tubi microcentrifuga da 1,7 millilitri.Centrifugare il lussato cellulare per 20 minuti a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante, che verrà utilizzato come campione proteico solubile in seguito. Utilizzare una pipetta per ricaspendare il pellet in 200 microlitri di tampone ghiacciato A.Centrifugare i tubi a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti.Quindi rimuovere con attenzione il surnatante del tutto. Utilizzare una pipetta per risuscidere accuratamente il pellet in 200 microlitri di tampone ghiacciato B.Centrifugare nuovamente i tubi e rimuovere con cura il surnatante. Quindi ripetere il lavaggio con tampone A.Resuspend il pellet in 100 microlitri di 1x riducendo il tampone del campione SDS e farlo bollire per cinque minuti in un Bimbyer a 95 gradi Celsius.Mescolare un volume di 100% TCA con quattro volumi del campione proteico solubile raccolto in precedenza e incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius per la precipitazione delle proteine. Centrifugare il campione a 21.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti per ottenere il precipitato e rimuovere il surnatante. Utilizzare 200 microlitri di acetone ghiacciato per lavare il pellet, per rimuovere i detriti cellulari.Centrifugare nuovamente il campione per ottenere il precipitato e rimuovere il surnatante. Per rimuovere l'acetone rimanente dal pellet, tenere i tubi microcentrifuga nel Bimbyer a 37 gradi Celsius con i coperchi aperti. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone SDS riducente 1x per sciogliere completamente il pellet e far bollire il campione a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Caricare immediatamente il campione su un gel di poliacrilammide SDS per la separazione o conservare il campione a meno 20 gradi Celsius per procedere in un secondo momento. Preparare due gel di separazione come descritto nel manoscritto di testo. Versare il gel tra le lastre di vetro usando una pipetta da un millilitro, assicurandosi che i due centimetri superiori siano privi della miscela.Aggiungere il 70% di etanolo sopra il gel separatore, creando un'interfaccia uniforme tra i due strati. Una volta che i gel di separazione hanno polimerizzato, preparare i gel impilabili utilizzando le istruzioni nel manoscritto di testo. Quindi rimuovere l'etanolo dai gel di separazione e aggiungere la soluzione di gel impilante.Inserire con attenzione un pettine con il numero desiderato di tasche senza introdurre bolle d'aria e lasciare polimerizzare il gel per 20-30 minuti. Caricare quattro microlitri di ciascun campione, così come la scala proteica, in pozzi separati. Quindi eseguire il gel in un tampone di corsa tris-glicina a 144 volt per 45 minuti a temperatura ambiente.Utilizzare la soluzione Fairbanks preriscaldata A per macchiare i gel su un bilanciere per 30 minuti e la soluzione Fairbanks preriscaldata D per decolorare i gel su un bilanciere fino a raggiungere lo sfondo desiderato. È stato osservato un aumento della quantità di aggregato proteico formato quando le cellule sono state trattate con 175 microgrammi per millilitro e 200 microgrammi per millilitro di antimicrobico, rispetto alle cellule non trattate. L'aumento della frazione proteica insolubile è stato più pronunciato nel ceppo MG1655 più sensibile.Una diminuzione è stata osservata nella quantità di proteine solubili quando le cellule sono state trattate con 175 microgrammi per millilitro e 200 microgrammi per millilitro di antimicrobico, rispetto alle cellule non trattate. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la normalizzazione alla densità ottica a 600 nanometri è importante per il confronto dell'entità dell'aggregazione proteica nei campioni.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

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Packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Progettazione, produzione e purificazione

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Ricerca

Biochimica

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

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Rilevamento del pH-dipendente attività di<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

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Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

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Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

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Quantificazione di abbondanza e ricarica i livelli di RNA di trasferimento in Escherichia coli

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Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

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With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

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Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

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Acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando l'espansione del codice genetico in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...