Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
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この研究は、イリノイ州立大学生物科学部のスタートアップ資金、イリノイ州立大学新学部イニシアチブ助成金、NIAID助成金R15AI164585(J.-Uに対して支援されました。D.).G.M A.はイリノイ州立大学学部研究支援プログラム(G.M.A.)の支援を受けています。K. P. H. は、ドイツ学術交流サービス (DAAD) が提供する RISE フェローシップによって支援されました。著者らは、AGXX粉末を提供してくれたラージテック・ヴェルトリエブス社のウーヴェ・ランダウ博士とカーステン・マイヤー博士に感謝している。図1、図2、図3、図4、図5は、Biorenderで生成された。

1. 大腸菌 株MG1655およびCFT073のストレス治療
<ol><li>5 mLのリソジニーブロス(LB)培地を、それぞれ1コロニーの終部大 腸菌 株MG1655および泌尿病原性 大腸菌 (UPEC)株CFT073株で、37°Cおよび300rpmで14〜16時間(一晩)にインキュベートした。 注: 大腸菌 CFT073は、ヒトの病原体です。CFT073の取り扱いは、バイオセーフティレベル2認定ラボで適切なバイオセーフティ対策を講じ?...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

このプロトコルは、タンパク質毒性抗菌性を有する異なる大腸菌株の処理後のタンパク質凝集体形成の分析のための最適化された方法論を記述する。このプロトコルは、処理された未処理の大腸菌細胞からの不溶性および可溶性タンパク質画分の同時抽出を可能にする。細胞14、15、16、20からのタンパク質凝集分離のための既存のプロトコルと比較して、この方法はいく...

細菌は必然的に無数の環境ストレスにさらされ、 低pH(例えば哺乳類の胃の中)1、2、活性酸素および塩素種(ROS/RCS)(例えば、食細胞中の酸化バースト中)3、4、5、高温(例えば、温泉または熱ショック中)6、7、およびいくつかの強力な抗菌剤(例えば、このプロトコルで使用されるAGXX)タンパク質はこれらのストレッサーのいずれかに対して特に脆弱であり、暴露はタンパク質を引き起こす可能性があります。すべての生物は、タンパク質の誤折9に対処できる保護システムを採用しています。しかし、重度のストレスはタンパク質の品質管理機械を圧倒し、タンパク質の二次および/または三次構造を破壊し、最終的にタンパク質を不活性化させる可能性があります。その結果、タンパク質凝集体は、細菌の増殖および生存、ストレス耐性、および毒性10に必要な重要な細胞機能を著しく損なう可能性がある。したがって、タンパク質の凝集と細菌の影響に焦点を当てた研究は、感染症のコントロールに及ぼす潜在的な影響のために関連するトピックです。
熱誘起タンパク質の展開と凝集は、しばしば可逆的である7.対照的に、酸化ストレスなどの他のタンパク質毒性ストレスは、特定のアミノ酸側鎖の酸化によって不可逆的なタンパク質修飾を引き起こし、タンパク質の非改ざんを生じ、最終的にはタンパク質凝集4を引き起こす可能性がある。ストレス誘発不溶性タンパク質凝集体の形成は、酵母および細菌11、12、13におけるシャペロン分子およびその保護機能のコンテキストにおいて広く研究されている。不溶性タンパク質凝集体14、15、16、17の分離および分析のために様々な生化学的技術を利用するいくつかのプロトコルが発表されている。既存のプロトコルは、主に熱ショックや分子シャペロンの同定時に細菌タンパク質凝集を研究するために使用されてきました。これらのプロトコルは確かにこの分野への進歩でしたが、(i)細胞破壊器、フランスのプレス、および/または超音波処理14、15、17、または(iii)時間を消費する反復を含む複雑な物理的破壊プロセスの大きな細菌培養量を必要とするため、実験的手順には大きな不便があります。 洗浄およびインキュベーションステップ15、16、17。
本論文では、これまでのアプローチの限界に対処し、タンパク質毒性抗菌表面コーティングによる処理後に2種類のエシェリヒア・コリ株で形成されるタンパク質凝集体の量を分析することを目的とした改変プロトコルについて述べている。コーティングは、アスコルビン酸で金属銀(Ag)とルテニウム(Ru)を条件とし、その抗菌活性は活性酸素種8、18の生成によって達成される。本明細書において、抗菌性化合物による処理後の細菌培養物の調製の詳細な説明と、抗菌性の濃度を増加させるに対して明確な感受性プロファイルを有する2つの大腸菌株の曝露時のタンパク質凝集状態の比較である。記載された方法は、安価で、速く、かつ再現性が高く、他のタンパク質毒性化合物の存在下でタンパク質凝集を研究するために使用することができる。さらに、プロトコルを変更して、特定の遺伝子欠失がさまざまな異なる細菌のタンパク質凝集に与える影響を分析することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

環境や細胞のストレスに生物を曝露すると、しばしばタンパク質の恒常性の混乱を引き起こし、タンパク質凝集を引き起こす可能性があります。細菌細胞のタンパク質凝集体の蓄積は、増殖速度の低下、耐ストレス性、および毒性を含む細胞の現象行動の有意な変化につながる可能性があります。これらのストレータ媒介性型の検討にはいくつかの実験手順が存在する。この論文では、銀ルテニウム含有抗菌剤による処理後の、異なる 大腸菌 株からの凝集および可溶性タンパク質の抽出と可視化に対する最適化アッセイについて述べている。この化合物は、活性酸素種を生成することが知られており、広範囲にわたるタンパク質凝集を引き起こす。 
この方法は、処理細胞および未処理細胞からのタンパク質凝集体と可溶性タンパク質の遠心分離と、その後の分離および可視化を、ドデシル硫酸-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびクママシー染色と組み合わせたものです。このアプローチは、単純で高速であり、異なる 大腸菌 株におけるタンパク質凝集体形成の定性的比較を可能にする。この方法論は、幅広い細菌における 生体内 タンパク質凝集に対する他のタンパク質毒性抗菌薬の影響を調べる可能性を含む、幅広い用途を有する。さらに、プロトコールは、タンパク質毒性物質に対する耐性の増大に寄与する遺伝子を同定するために使用することができる。ゲルバンドは、特に凝集しやすいタンパク質のその後の同定に使用できます。

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> 図6:コメンショナル大腸菌株MG1655およびUPEC株CFT073における抗菌誘発タンパク質凝集の代表的な結果大腸菌株MG1655およびCFT073は、示された濃度(-,0 mg/mL;+,175 mg/mL;++, 200 mg/mL)の抗菌薬で処理される前に、MOPS-g培地で37°Cおよび300rpmでOD600=0.0.55に成長した?...

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Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

このプロトコルは、タンパク質毒性抗菌剤による処理後の 大腸菌 からの凝集および可溶性タンパク質の抽出と可視化を記述する。この手順に従うと、異なる細菌株および/または治療間 のインビボで のタンパク質凝集形成の定性的比較が可能となる。

タンパク質毒性ストストレスマによる 大腸菌 治療後のタンパク質凝集体の抽出と可視化

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

ストレスにさらされると、タンパク質の凝集を引き起こし、細菌の現象の挙動に重大な変化をもたらす可能性があります。このビデオで説明した手順は、ストレス処理後のタンパク質凝集体の抽出と可視化を可能にします。他の公表された手順とは対照的に、このプロトコルは、より低い細胞数を必要とし、複雑な物理的破壊プロセス、ならびに時間のかかる洗浄およびインキュベーションステップを控える必要があります。このプロトコルは、グラム陰性およびグラム陽性菌の多種多様なタンパク質凝集を研究するために使用することができます。また、遺伝子欠失の効果を分析したり、タンパク質毒性化合物の有効性を比較することもできます。大腸菌株MG1655および泌尿器病性大腸菌株CFT073の単一コロニーを、それぞれ5ミリリットルのリソゲニーブロス(LB)培地に接種することから始めます。2つのスープ培養物を摂氏37度、300rpmで14~16時間インキュベートします。各株を600ナノメートル(OD600)の光学密度に希釈し、0.1の70ミリリットルのMOPS-g培地を含む500ミリリットルのフラスコにします。中対数相に達するまで37度と300rpmでフラスコをインキュベートします。インキュベーション後、各培養物20ミリリットルを3つの事前に温めた125ミリリットルのフラスコに移し、摂氏37度と300rpmで2分間培養します。MOPS-g培地で2ミリグラム/ミリリットルの抗菌化合物溶液を調製する。各培養液にこの溶液を加え、所望の濃度に達し、未処理の制御に必要な量のMOPS-g培地を加える。45分間のストレス処理の後、各培養のOD600を決定する。各サンプルについて、15ミリリットルの遠心分離管に1つのOD600を有する4ミリリットルの培養物をアリコートする。細胞ペレットを氷冷ライシスバッファーの 50 マイクロリットルに再懸濁します。氷の上で30分間サンプルをインキュベートします。360マイクロリットルの氷冷バッファーAをサンプルに加え、ピペットで軽く混ぜます。サンプルを0.5ミリメートルのガラスビーズの約200マイクロリットルで2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。1400 rpmで振るサーモミキサーで8°Cで30分間チューブをインキュベートします。ガラスビーズを落ち着かすために振ることなく、氷の上にチューブを5分間インキュベートします。その後、200マイクロリットルの細胞ライセートを1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。細胞を16,000倍gと摂氏4度で20分間遠心分離します。後で可溶性タンパク質サンプルとして使用される上清を収集します。ピペットを使用して、16,000グラム、摂氏4度の氷冷バッファーA.遠心分離機の200マイクロリットルのペレットを20分間再懸濁させます。その後、慎重に上清を完全に削除します。ピペットを使用して、200マイクロリットルの氷冷バッファーB.遠心分離機でペレットを慎重に再懸濁し、上清を慎重に取り除きます。その後、バッファーA.1x低減SDSサンプルバッファーの100マイクロリットルでペレットを再懸濁し、95°CでThermoMixerで5分間沸騰させます。100%TCAの1つのボリュームを、先に採取した可溶性タンパク質サンプルの4つのボリュームと混合し、タンパク質沈殿のために摂氏4度で10分間インキュベートします。試料を21,000倍gと摂氏4度で5分間遠心し、沈殿物を得て、上清を除去する。200マイクロリットルの氷冷アセトンを使用してペレットを洗浄し、細胞の破片を除去します。試料を再び遠心分離し、沈殿物を得て、上清を除去した。残りのアセトンをペレットから取り除くには、サーモミキサーのマイクロ遠心チューブを蓋を開けたまま摂氏37度に保ちます。その後、1x減らすSDSバッファーの100マイクロリットルを加え、ペレットを完全に溶解し、サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。分離のためにSDSポリアクリルアミドゲルにサンプルをすぐにロードするか、後で進むためにマイナス20°Cでサンプルを保存します。テキスト原稿に記載されているように、2つの分離ゲルを準備します。ガラス板の間に1ミリリットルのピペットを使用してゲルを注ぎ、上の2センチメートルに混合物が含まれないようにします。分離ゲルの上に70%エタノールを加え、2つの層の間に均一な界面を作り出す。分離ゲルが重合したら、テキスト原稿の指示を使用して積層ゲルを調製します。次いで、分離ゲルからエタノールを取り出し、スタッキングゲル溶液を添加する。気泡を入れずに必要な数のポケットを持つ櫛を慎重に挿入し、ゲルを20〜30分間重合させます。各サンプルの4マイクロリットルとタンパク質ラダーを別々の井戸に積み込みます。その後、室温で45分間144ボルトでトリスグリシンランニングバッファでゲルを実行します。事前に温められたフェアバンクス溶液Aを使用してロッカーのゲルを30分間染色し、事前に温めたフェアバンクス溶液Dを使用して、所望の背景が達成されるまでロッカーのゲルを脱色させます。細胞を1ミリリットル当たり175マイクログラム、抗菌菌1ミリリットル当たり200マイクログラムで処理した場合に形成されたタンパク質凝集体の量の増加が、未処理細胞と比較して観察された。不溶性タンパク質画分の増加は、より敏感なMG1655株でより顕著であった。未治療細胞と比較して、細胞を1ミリリットル当たり175マイクログラム、抗菌菌1ミリリットル当たり200マイクログラムで処理した場合、可溶性タンパク質の量が減少することが観察された。このプロトコルを試みる際には、サンプル中のタンパク質凝集の程度を比較するためには、600ナノメートルでの光学密度への正規化が重要であることを覚えておいてください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え Rna の大量生産

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

タンパク質毒性ストストレスマによる 大腸菌 治療後のタンパク質凝集体の抽出と可視化

タンパク質毒性ストストレスマによる大腸菌治療後のタンパク質凝集体の抽出と可視化