Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

이 작품은 일리노이 주립 대학 생물 과학 스타트업 기금, 일리노이 주립 대학 뉴 교수 이니셔티브 그랜트, NIAID 보조금 R15AI164585 (J.U. D.). G.M.A.는 일리노이 주립 대학 학부 연구 지원 프로그램 (G.M.A.에 의해 지원되었다. K. P. H.는 독일 학술 교류 서비스(DAAD)에서 제공하는 RISE 펠로우십의 지원을 받았습니다. 저자는 AGXX 분말을 제공 에 대한 라지네텍 버트리브 GmbH에서 박사 우웨 란다우와 박사 카스텐 마이어 에게 감사드립니다. 그림 1, 도 2, 그림 3, 그림 4,그림 5는 바이오렌더로 생성되었다.

1. 대장균 균주 MG1655 및 CFT073의 스트레스 치료
<ol><li>리소게니 국물 (LB) 배지의 접종 5 mL 는 대장균 균주 MG1655 및 비뇨기요법 대장균 (UPEC) 균주 CFT073의 단일 콜로니를 가진 배지, 각각 37 °C 및 300 rpm에서 14-16 h (하룻밤)에 대한 배양. 참고: 대장균 CFT073은 인간 병원체입니다. CFT073의 처리는 생물 안전 수준-2 인증 실험실에서 적절한 생물 안전 조치를 통해 수행해야 합니?...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

이 프로토콜은 프로테오독성 항균제로 상이한 대장균 균주를 치료한 후 단백질 골체 형성을 분석하기 위한 최적화된 방법론을 설명한다. 이 프로토콜은 치료 및 치료되지 않은 대장균 세포로부터 불용성 및 용해성 단백질 분획을 동시에 추출할 수 있게 합니다. 세포로부터의 단백질 골재 절연을 위한 기존 프로토콜에 비해14,15,<sup...

박테리아는 필연적으로 환경 스트레스의 무수한에 노출, 낮은 pH(예를 들어, 포유류 위장)1,2,반응성 산소 및 염소 종(ROS/RCS) (예를 들어, 식신구의 산화 파열 중)3,4,5,높은 온도(예를 들어, 온천 또는 열 충격 시)6,7,및 몇 가지 강력한 항균(예를 들어, 이프로토콜)및 몇 가지 강력한 항균(예를 들어, 이 규약) 및 몇 가지 강력한 항균(예를 들어, 이 에 사용됨) 단백질은 이러한 스트레스에 특히 취약하며, 노출은 단백질을 분리/오도하여 다음 씨앗 응집을 유발할 수 있습니다. 모든 유기체는 단백질 잘못 접는9에대처할 수 있는 보호 시스템을 사용합니다. 그러나, 가혹한 긴장은 단백질 질 관리 기계를 압도하고 궁극적으로 단백질을 비활성화하는 단백질의 이차 및/또는 삼차 구조를 방해할 수 있습니다. 결과적으로, 단백질 응집체는 세균성 성장 및 생존, 스트레스 저항 및 독성10에필요한 중요한 세포 기능을 심각하게 손상시킬 수 있다. 따라서, 단백질 집계및 박테리아에 있는 그것의 결과에 집중하는 연구는 전염병 통제에 그것의 잠재적인 충격 때문에 관련 주제입니다.
열 유도 단백질 전개 및 응집은 종종 가역7. 대조적으로, 산화 스트레스와 같은 다른 프로테오독성 응력은 특정 아미노산 사이드 체인의 산화를 통해 돌이킬 수 없는 단백질 변형을 유발하여 단백질을 비/오폴딩시키고, 결국 단백질 응집4를초래할 수 있다. 응력 유발 단백질 골재의 형성은 효모 및 박테리아11,12,13에서분자 보호자 및 보호 기능의 맥락에서 광범위하게 연구되고있다. 여러 프로토콜은 용해성 단백질 골재의 격리 및 분석을 위한 다양한 생화학적 기술을 활용하는 것으로14,15,16,17을공표되었다. 기존 프로토콜은 주로 열 충격 및/또는 분자 보호자의 식별시 세균성 단백질 응집체를 연구하는 데 사용되었습니다. 이러한 프로토콜은 확실히 필드에 발전되었지만, 세포 파괴기, 프랑스 언론 및/또는 초음파처리14,15,17또는 (iii) 시간 반복의 사용을 포함하여 (i) 최대 10 L14,17, (ii) 복잡한 물리적 중단 과정의 큰 세균 배양 부피를 필요로하기 때문에 실험 적 절차에 몇 가지 주요 불편이 있다. 세탁 및 인큐베이션 단계15,16,17.
본 논문은 이전 접근법의 한계를 해결하는 것을 목표로 하는 수정된 프로토콜을 설명하고 프로테오독성 항균 표면 코팅으로 치료 후 두 가지 다른 대장균 균주에서 형성된 단백질 골재의 양을 분석할 수 있게 한다. 코팅은 금속-은(Ag)과 루테늄(Ru)으로 구성되며, 아스코르브산으로 조절되며, 그 항균 활성은 반응성 산소 종8,18의생성에 의해 달성된다. 본명 에서 항균 화합물을 가진 치료 후 세균 배양의 제조에 대한 상세한 설명과 뚜렷한 감수성 프로파일을 가진 두 개의 대장균 균주의 노출 시 단백질 응집 상태의 비교가 항균제의 농도를 증가시키는 것이다. 설명된 방법은 저렴하고 빠르며 재현가능하며 다른 프로테오독성 화합물이 있는 상태에서 단백질 응집을 연구하는 데 사용될 수 있다. 또한, 프로토콜은 다양한 상이한 박테리아에서 특정 유전자 삭제가 단백질 응집에 미치는 영향을 분석하도록 수정될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

환경 및 세포 스트레스에 살아있는 유기체의 노출은 수시로 단백질 항상성에 있는 중단을 일으키는 원인이 되고 단백질 응집귀귀착될 수 있습니다. 세균성 세포에 있는 단백질 응집체의 축적은 성장 비율, 응력 저항 및 독성에 있는 감소를 포함하여 세포 표현성 행동에 있는 중요한 변경으로 이끌어 낼 수 있습니다. 이러한 스트레스 매개 표현형의 검사를 위한 몇몇 실험적인 절차가 존재합니다. 이 논문은 은 루테늄 함유 항균제로 치료 후 다른 대장균 균주에서 골재 및 수용성 단백질의 추출 및 시각화에 최적화된 분석서를 설명합니다. 이 화합물은 반응성 산소 종을 생성하고 광범위한 단백질 응집을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 
이 방법은 치료 및 처리되지 않은 세포로부터 단백질 골재 및 용해성 단백질의 원심분리 계 분리를 나트륨 도데실 황산염-폴리아크라이아미드 젤 전기포진(SDS-PAGE) 및 쿠마시 염색에 의한 후속 분리 및 시각화와 결합한다. 이 접근법은 간단하고 빠르며, 다른 대장균 균주에서 단백질 골체 형성의 질적 비교를 허용합니다. 방법론은 광범위한 박테리아에서 생체 내 단백질 응집에 대한 다른 프로테오독성 항균제의 영향을 조사할 수 있는 가능성을 포함하여 광범위한 응용 분야가 있습니다. 더욱이, 프로토콜은 프로테오독성 물질에 대한 저항증가에 기여하는 유전자를 식별하는 데 사용될 수 있다. 젤 밴드는 특히 응집되기 쉬운 단백질의 후속 식별에 사용할 수 있습니다.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> 도 6: 대장균 균주 MG1655 및 UPEC 균주 CFT073에서 항균 유도 단백질 응집의 대표적인 결과. 대장균 균주 MG1655 및 CFT073은 37°C및 300 rpm에서 OD600= 0.5-0.55로 성장한 후 MOPS-g 미디어에서 표시 농도(-, 0 mg/mL; +, 175 mg/mL; +, +, 200 mg/mL; ++, 200 mg/mL)의 항균으로 치료하였...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

이 프로토콜은 프로테오독성 항균제로 치료 한 후 대장균에서 집계 및 수용성 단백질의 추출 및 시각화를 설명합니다. 이 절차에 따라 다른 세균성 균주 및 /또는 치료 사이에 생체 내에서 단백질 골집 형성의 질적 비교를 할 수 있습니다.

프로테오독성 스트레스로 대장균 치료 후 단백질 골재의 추출 및 시각화

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

스트레스에 노출되면 단백질 응집을 일으킬 수 있으며 박테리아의 표현성 행동에 상당한 변화를 초래할 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 절차는 스트레스 치료 후 단백질 골재의 추출 및 시각화를 허용합니다. 다른 게시된 절차와 는 달리, 이 프로토콜은 더 낮은 세포 수를 요구하고 복잡한 물리적 중단 프로세스뿐만 아니라 시간이 많이 소요되는 세척 및 잠복 단계를 기권합니다.이 프로토콜은 그램 음성 및 그람 양성 박테리아의 다양한 단백질 응집을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 유전자 삭제의 효과를 분석하거나 프로테오독성 화합물의 효능을 비교할 수 있습니다. 대장균 균주 MG1655 및 비뇨기요법 대장균 균주 CFT073의 단일 콜로니를 리소게니 국물 또는 LB, 배지의 5밀리리터로 접종하여 시작한다.두 국물 문화를 섭씨 37도, 300rpm에서 14~16시간 동안 배양합니다. 각 변형을 600 나노미터 또는 OD600의 광학 밀도로 0.1을 70 밀리리터의 MOPS-g 배지를 포함하는 500 밀리리터 플라스크로 희석시다. 플라스크를 37도 및 300 rpm에서 중간 로그 단계에 도달할 때까지 배양합니다.인큐베이션 후, 각 문화의 20 밀리리터를 3개의 미리 따뜻하게 한 125밀리리터 플라스크로 옮기고 섭씨 37도, 300rpm에서 2분간 배양합니다. MOPS-g 배지에서 밀리리터당 2밀리그램 의 항균 화합물 용액을 준비합니다. 이 솔루션을 각 배양에 추가하여 원하는 농도에 도달하고 처리되지 않은 컨트롤에 필요한 양의 MOPS-g 배지를 추가합니다.45분간의 스트레스 치료 후 각 배양의 OD600을 결정합니다. 각 샘플에 대해, 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 하나의 OD600와 문화의 4 밀리리터를 알리쿼트. 얼음 차가운 용해 버퍼의 50 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.얼음에 30 분 동안 샘플을 배양. 360 마이크로리터의 얼음 냉간 버퍼 A를 샘플에 넣고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 샘플을 약 2밀리리터 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기고 약 200마이크로리터의 0.5밀리미터 유리 구슬을 전달합니다.1400 rpm에서 흔들리는 ThermoMixer에서 섭씨 8도에서 30 분 동안 튜브를 배양하십시오. 유리 구슬을 정착시키기 위해 흔들리지 않고 5 분 동안 얼음에 튜브를 배양하십시오. 그런 다음 세포 용액의 200 마이크로 리터를 1.7 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮킨다.원심 분리세포는 16, 000배, 섭씨 4도에서 20분 동안 용액을 흘린다. 나중에 수용성 단백질 샘플로 사용될 상체를 수집합니다. 파이펫을 사용하여 20분 동안 튜브의 얼음 냉기 버퍼 A.원심분리기 200마이크로리터에서 펠릿을 재보페한다.그런 다음 신중하게 초상적 인 것을 완전히 제거하십시오. 파이펫을 사용하여 200마이크로리터의 얼음 냉간 완충B.원심분리기에서 펠릿을 조심스럽게 재보페하고, 상체를 조심스럽게 제거한다. 그런 다음 버퍼 A.resuspend 100 마이크로 리터S SDS 샘플 버퍼를 감소, 95 섭씨에서 ThermoMixer에서 5 분 동안 끓인다.100%TCA의 1부피를 이전에 수집한 용해성 단백질 샘플 4부와 혼합하고 단백질 강수량에 대해 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 21, 000배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하여 침전을 얻고 상체를 제거합니다. 200 마이크로리터의 얼음 차가운 아세톤을 사용하여 펠릿을 세척하고 셀룰러 이물질을 제거하십시오.침전을 얻기 위해 시료를 다시 원심분리하고 상체부를 제거합니다. 펠릿에서 나머지 아세톤을 제거하려면 ThermoMixer의 미세 원심 분리기 튜브를 뚜껑을 열어 섭씨 37도에서 유지합니다. 그런 다음 1x의 마이크로리터 100기를 추가하여 SDS 버퍼를 완전히 녹여 펠릿을 완전히 녹이고 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.즉시 분리를 위해 SDS 폴리아크릴아미드 젤에 샘플을 적재하거나 샘플을 영하 20도에서 저장하여 나중에 진행합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 두 개의 분리 젤을 준비합니다. 1밀리리터 파이펫을 사용하여 유리 플레이트 사이에 젤을 부어 상부 2센티미터가 혼합물이 없도록 합니다.분리 젤 위에 70%에탄올을 추가하여 두 레이어 사이에 짝수 인터페이스를 만듭니다. 분리 젤이 중합되면 텍스트 원고의 지침을 사용하여 스태킹 젤을 준비하십시오. 그런 다음 분리 젤에서 에탄올을 제거하고 스태킹 젤 용액을 추가합니다.기포를 도입하지 않고 원하는 포켓 수의 빗을 조심스럽게 삽입하고 겔이 20~30분 동안 중합되도록 합니다. 각 샘플의 4개의 마이크로리터와 단백질 사다리를 별도의 우물에 적재합니다. 그런 다음 실온에서 45분 동안 144볼트에서 트리스 글리신 러닝 버퍼로 젤을 실행합니다.미리 데워진 Fairbanks 솔루션 A를 사용하여 로커에 젤을 30분 동안 염색하고 페어뱅크스 솔루션 D를 미리 데워서 원하는 배경이 달성될 때까지 로커에 젤을 색칠할 수 있습니다. 세포가 밀리리터 당 175 마이크로그램과 항균제당 200 마이크로그램으로 치료될 때 형성된 단백질 골재의 양에서 증가가 관찰되었다. 불용성 단백질 분획의 증가는 더 민감한 MG1655 균주에서 더 두드러졌다.세포가 밀리리터 당 175 마이크로그램과 항균제의 밀리리터 당 200 마이크로그램으로 치료될 때 수용성 단백질의 양에서 감소가 관찰되었다. 이 프로토콜을 시도할 때, 600 나노미터에서 광학 밀도로의 정규화는 시료의 단백질 응집 정도비교에 중요하다는 점에 유의하십시오.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...