Name: extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Illinois State University School of Biological Sciences oppstartsfond, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, og NIAID-stipendet R15AI164585 (til J.-U. D.). G.M.A. ble støttet av Illinois State University Undergraduate Research Support Program (til G.M.A.). K. P. H. ble støttet av et RISE-stipend levert av den tyske akademiske utvekslingstjenesten (DAAD). Forfatterne takker Dr. Uwe Landau og Dr. Carsten Meyer fra Largentech Vertriebs GmbH for å ha levert AGXX-pulveret. Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4og Figur 5 ble generert med Biorender.

1. Stressbehandling av E. coli stammer MG1655 og CFT073
<ol><li>Inokuler 5 ml lysogenybuljong (LB) medium med en enkelt koloni av commensal E. coli stamme MG1655 og uropathogenic E. coli (UPEC) stamme CFT073, og inkubere i 14-16 timer (over natten) ved henholdsvis 37 °C og 300 o/min. MERK: Escherichia coli CFT073 er et menneskelig patogen. Håndtering av CFT073 må utføres med passende biosikkerhetstiltak i et Biosafety Level-2-sertifisert laboratorium.</li>
	<li>Fortynn hver st...

<ol>
	<li>Dahl, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria.">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li><li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid.">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).</li><li>Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions.">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li><li>Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants.">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever.">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).</li><li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+life+on+the+verge+of+death.">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li><li>Van Loi, V., Busche, T., Preu&#223;, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AGXX+&#174;+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus.">The AGXX &#174; antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).</li><li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding.">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+in+bacteria.">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone.">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li><li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tam&#225;s, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties.">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554 (2016).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding.">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).</li><li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Th&#252;ring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus.">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).</li><li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells.">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li><li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-F&#246;hn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles.">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li><li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast.">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li><li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli.">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li><li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress:+Lessons+from+a+model+bacterium.">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li><li>M&#252;hlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins.">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li><li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria.">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP60/10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs,+natural+products,+and+known+bioactive+molecules.">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li><li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus.">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en optimalisert metodikk for analyse av proteinaggregatdannelse etter behandling av forskjellige E. coli-stammer med en protetoksisk antimikrobiell. Protokollen tillater samtidig utvinning av uoppløselige og oppløselige proteinfraksjoner fra behandlede og ubehandlede E. coli-celler. Sammenlignet med eksisterende protokoller for protein aggregert isolasjon fra cellene14,15,16,<...

Bakterier er uunngåelig utsatt for et utall miljøspenninger, inkludert lav pH (f.eks. i pattedyrets mage)1,2, reaktive oksygen- og klorarter (ROS/RCS) (f.eks. under oksidativt utbrudd i fagocytter)3,4,5, forhøyede temperaturer (f.eks. i varme kilder eller under varmesjokk)6,7og flere potente antimikrobielle midler (f.eks. AGXX brukt i denne protokollen)8. Proteiner er spesielt sårbare for noen av disse stressorene, og eksponering kan provosere protein un-/misfolding som deretter frø aggregering. Alle organismer bruker beskyttende systemer som gjør at de kan takle proteinfeilfolding9. Imidlertid kan alvorlig stress overvelde proteinkvalitetskontrollmaskineriet og forstyrre den sekundære og / eller tertiære strukturen av proteiner, som til slutt inaktiverer proteiner. Som en konsekvens kan proteinaggregater sterkt svekke kritiske cellulære funksjoner som kreves for bakteriell vekst og overlevelse, stressmotstand og virulens10. Derfor er forskning med fokus på proteinaggregering og dens konsekvenser i bakterier et relevant tema på grunn av dens potensielle innvirkning på smittsom sykdomskontroll.
Varmeindusert protein utfolder seg og aggregering er ofte reversibel7. I motsetning kan andre protetoksiske påkjenninger, som oksidativt stress, forårsake irreversible proteinmodifikasjoner gjennom oksidasjon av spesifikke aminosyresidekjeder som resulterer i protein un-/misfolding og til slutt proteinaggregering4. Stressindusert dannelse av uoppløselige proteinaggregater har blitt grundig studert i sammenheng med molekylære anstander og deres beskyttende funksjoner i gjær og bakterier11,12,13. Flere protokoller har blitt publisert som bruker en rekke biokjemiske teknikker for isolering og analyse av uoppløselige proteinaggregater14,15,16,17. De eksisterende protokollene har hovedsakelig blitt brukt til å studere bakteriell proteinaggregering ved varmesjokk og/eller identifisering av molekylære anstander. Selv om disse protokollene absolutt har vært et fremskritt for feltet, er det noen store ulemper i de eksperimentelle prosedyrene fordi de krever (i) et stort bakteriekulturvolum på opptil 10 L14,17, (ii) kompliserte fysiske forstyrrelsesprosesser, inkludert bruk av celleforstyrrelser, fransk presse og / eller sonikering14,15,17eller (iii) tidkrevende gjentatt vaske- og inkubasjonstrinn15,16,17.
Dette dokumentet beskriver en modifisert protokoll som tar sikte på å adressere begrensningene i de tidligere tilnærmingene og tillater analyse av mengden proteinaggregater dannet i to forskjellige Escherichia coli-stammer etter behandling med et protetoksisk antimikrobielt overflatebelegg. Belegget består av metall-sølv (Ag) og ruthenium (Ru)-betinget med askorbinsyre, og dens antimikrobielle aktivitet oppnås ved generering av reaktive oksygenarter8,18. Herein er en detaljert beskrivelse av fremstillingen av bakteriekulturen etter behandling med den antimikrobielle forbindelsen og en sammenligning av proteinaggregeringsstatus ved eksponering av to E. coli-stammer med tydelige følsomhetsprofiler for å øke konsentrasjonen av antimikrobielle. Den beskrevne metoden er billig, rask og reproduserbar og kan brukes til å studere proteinaggregering i nærvær av andre protetoksiske forbindelser. I tillegg kan protokollen modifiseres for å analysere hvilken innvirkning spesifikke genslettinger har på proteinaggregering i en rekke forskjellige bakterier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals/Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>P008-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>B-092-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>821616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBT9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>G-630-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402893-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3522-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Miller)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>L-040-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MOPS Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T9281-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Trichloroacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-400-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>JABG-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (125 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask (500 mL)</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>726694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer: -80 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (0.5 mm)</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1107-9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z216MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentriguge tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Axygen Maxiclear Microtubes</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-377-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>RS7235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small glass plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer plates (1 mm)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>3339053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and visualization of protein aggregates after treatment of escherichia coli with a proteotoxic stressor

Eksponeringen av levende organismer for miljømessige og cellulære påkjenninger forårsaker ofte forstyrrelser i protein homeostase og kan resultere i proteinaggregering. Akkumuleringen av proteinaggregater i bakterieceller kan føre til betydelige endringer i cellulær fenotypisk oppførsel, inkludert en reduksjon i vekstrater, stressmotstand og virulens. Det finnes flere eksperimentelle prosedyrer for undersøkelse av disse stressormediert fenotyper. Dette dokumentet beskriver en optimalisert analyse for ekstraksjon og visualisering av aggregerte og oppløselige proteiner fra forskjellige Escherichia coli-stammer etter behandling med en sølv-rutheniumholdig antimikrobiell. Denne forbindelsen er kjent for å generere reaktive oksygenarter og forårsaker utbredt proteinaggregering. 
Metoden kombinerer en sentrifugeringsbasert separasjon av proteinaggregater og oppløselige proteiner fra behandlede og ubehandlede celler med påfølgende separasjon og visualisering ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Coomassie-farging. Denne tilnærmingen er enkel, rask og tillater en kvalitativ sammenligning av proteinaggregatdannelse i forskjellige E. coli-stammer. Metodikken har et bredt spekter av applikasjoner, inkludert muligheten til å undersøke virkningen av andre proteotoksiske antimikrobielle midler på in vivo proteinaggregering i et bredt spekter av bakterier. Videre kan protokollen brukes til å identifisere gener som bidrar til økt motstand mot proteotokse stoffer. Gelbånd kan brukes til etterfølgende identifisering av proteiner som er spesielt utsatt for aggregering.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> Figur 6: Representative resultater av antimikrobiell indusert proteinaggregering i commensal Escherichia coli-stamme MG1655 og UPEC-stamme CFT073. E. coli stammer MG1655 og CFT073 ble dyrket ved 37 °C og 300 o/min til OD600= 0,5-0,55 i MOPS-g media før de ble behandlet med de angitte konsentrasjonene (-, 0 mg/ml; +, 175 mg/ml; +...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor at JoVE.com

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Denne protokollen beskriver ekstraksjon og visualisering av aggregerte og oppløselige proteiner fra Escherichia coli etter behandling med en protetoksisk antimikrobiell. Etter denne prosedyren tillater en kvalitativ sammenligning av protein aggregert formasjon in vivo i ulike bakteriestammer og / eller mellom behandlinger.

Ekstraksjon og visualisering av proteinaggregater etter behandling av Escherichia coli med en protetoksisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Eksponering for stress kan forårsake proteinaggregering og resultere i betydelige endringer i fenotypisk oppførsel av bakterier. Prosedyren beskrevet i denne videoen tillater ekstraksjon og visualisering av proteinaggregater etter stressbehandling. I motsetning til andre publiserte prosedyrer krever denne protokollen lavere celletall og avstår fra kompliserte fysiske forstyrrelsesprosesser, samt tidkrevende vaske- og inkubasjonstrinn.Denne protokollen kan brukes til å studere proteinaggregering i et bredt utvalg av gram-negative og gram-positive bakterier. Du kan også analysere effekten av gensletting eller sammenligne effekten av proteotoksiske forbindelser. Begynn med å inokulere en enkelt koloni av E.coli-stamme MG1655 og uropathogenic E.coli stamme CFT073, hver i fem milliliter lysogenibuljong, eller LB, medium.Inkuber de to buljongkulturene ved 37 grader Celsius og 300 rpm i 14 til 16 timer. Fortynn hver stamme til en optisk tetthet ved 600 nanometer, eller OD600, på 0,1 i en 500 milliliter kolbe som inneholder 70 milliliter MOPS-g medium. Inkuber kolbeene ved 37 grader og 300 o/min til midtloggfasen er nådd.Etter inkubasjon, overfør 20 milliliter av hver kultur til tre forvarmede 125 milliliterflasker, og inkuber dem ved 37 grader Celsius og 300 rpm i to minutter. Forbered en to milligram per milliliter antimikrobiell forbindelsesløsning i MOPS-g medium. Tilsett denne løsningen i hver kultur for å nå de ønskede konsentrasjonene, og legg til det nødvendige volumet av MOPS-g medium for ubehandlet kontroll.Bestem OD600 for hver kultur etter 45 minutter med stressbehandling. For hver prøve, aliquot fire milliliter kultur med en OD600 av en til 15 milliliter sentrifuge rør. Resuspend cellepellets i 50 mikroliter av iskald lysis buffer.Inkuber prøvene i 30 minutter på is. Tilsett 360 mikroliter iskald buffer A til prøvene, og bland forsiktig ved pipettering. Overfør prøvene til to milliliter mikrosenterrør med rundt 200 mikroliter 0,5 millimeter glassperler.Inkuber rørene i 30 minutter ved åtte grader Celsius i en ThermoMixer med risting ved 1400 rpm. Inkuber rørene på is i fem minutter uten å riste for å avgjøre glassperlene. Overfør deretter 200 mikroliter av cellelyset til 1,7 milliliter mikrocentrifugerør.Sentrifuger cellelyset i 20 minutter ved 16.000 ganger g og fire grader Celsius. Samle supernatanten, som vil bli brukt som den oppløselige proteinprøven senere. Bruk en pipette til å resuspendere pellet i 200 mikroliter av iskald buffer A.Sentrifuge av rørene ved 16.000 ganger g og fire grader Celsius i 20 minutter.Fjern deretter supernatanten helt. Bruk en pipette til forsiktig å resuspendere pellet i 200 mikroliter av iskald buffer B.Sentrifuger rørene igjen, og fjern forsiktig supernatanten. Gjenta deretter vasken med buffer A.Resuspend pellet i 100 mikroliter av 1x redusere SDS prøvebuffer, og kok den i fem minutter i en ThermoMixer ved 95 grader Celsius.Bland ett volum på 100% TCA med fire volumer av den oppløselige proteinprøven samlet tidligere, og inkuber i 10 minutter ved fire grader Celsius for proteinutfelling. Sentrifuger prøven ved 21.000 ganger g og fire grader Celsius i fem minutter for å få utfelling, og fjern supernatanten. Bruk 200 mikroliter iskald aceton til å vaske pelletsen, for å fjerne cellulært rusk.Sentrifuger prøven igjen for å få utfellingen, og fjern supernatanten. For å fjerne gjenværende aceton fra pellets, hold mikrocentrifugerørene i ThermoMixer ved 37 grader Celsius med lokkene åpne. Tilsett deretter 100 mikroliter 1x reduksjon av SDS-buffer for å fullstendig oppløse pelletsen, og kok prøven ved 95 grader Celsius i fem minutter.Last straks prøven på en SDS polyakrylamidgel for separasjon, eller lagre prøven på minus 20 grader Celsius for å fortsette senere. Forbered to separerende geler som beskrevet i tekstmanuskriptet. Hell gelen mellom glassplatene ved hjelp av en en milliliter pipette, og sørg for at de øvre to centimeterne er fri for blandingen.Legg til 70% etanol på toppen av separasjonsgelen, og opprett et jevnt grensesnitt mellom de to lagene. Når separasjonsgelene har polymerisert seg, klargjør du stablingsgelene ved hjelp av instruksjonene i tekstmanuskriptet. Fjern deretter etanol fra separerende geler, og legg til stablingsgelløsningen.Sett forsiktig inn en kam med ønsket antall lommer uten å introdusere luftbobler, og la gelen polymerisere i 20 til 30 minutter. Last fire mikroliter av hver prøve, samt proteinstigen, i separate brønner. Kjør deretter gelen i tris-glycin løpebuffer ved 144 volt i 45 minutter ved romtemperatur.Bruk forvarmet Fairbanks-løsning A for å farge gelene på en rocker i 30 minutter og forvarmet Fairbanks-løsning D for å farge gelene på en rocker til ønsket bakgrunn er oppnådd. En økning ble observert i mengden proteinaggregat som ble dannet da celler ble behandlet med 175 mikrogram per milliliter og 200 mikrogram per milliliter av antimikrobielle, sammenlignet med ubehandlede celler. Økningen i den uoppløselige proteinfraksjonen var mer uttalt i den mer følsomme MG1655-stammen.En reduksjon ble observert i mengden løselige proteiner når celler ble behandlet med 175 mikrogram per milliliter og 200 mikrogram per milliliter av antimikrobielle, sammenlignet med ubehandlede celler. Når du prøver denne protokollen, husk at normalisering til optisk tetthet ved 600 nanometer er viktig for sammenligning av omfanget av proteinaggregering i prøvene.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Regissert Protein Emballasje innen ytre membran Blemmer fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produksjon og rensing

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning av pH-avhengig aktivitet av<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Anstand HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; og<em&gt; I Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Anriking av vaskemiddel-uløselig Protein aggregater fra Postmortem hjernen

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifisering av overflod og lading nivåer av overføring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalaproduksjon av rekombinant RNAs på en sirkulær stillaset med en Viroid-avledet System i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Nettstedet-rettet mutagenese for In Vitro og Vivo eksperimenter eksemplifisert med RNA samhandling i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Stedsspesifikk lysinacetylering av histoner for nukleosomrekonstituering ved bruk av genetisk kodeutvidelse i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...